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生物技术制药复习题第一章 绪论第一节 生物技术的发展史1、生物技术：以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有与其性状的新物种或新品系，并与工程结合，利用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一个综合性技术体系。它的范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。基因工程是生物技术的核心。P12、蛋白质工程-第二代基因工程；海洋生物技术-第三代生物技术P13、生物技术发展史：传统、近代（抗生素、发酵罐）、现代（DNA重组）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重组技术1975年，Koher 和 Milstein 建立了单克隆抗体技术1982年，第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市1989年，我国第一个基因工程药物干扰素批准上市2003年，中国的重组腺病毒-p53注射液成为石阶上第一个正式批准的基因治疗药物。第二节 生物技术药物1、生物技术制药：生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。P42、生物技术药物：采用DNA重组技术活其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。它与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品共同归为生物药物。3、现代生物药物分为4类：重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；基因药物；天然药物；合成与部分合成药物。4、生物药物按用途分为：治疗药物；预防药物；诊断药物。5、生物技术药物的特征：（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强、疗效高；（4）稳定性差（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络性效应；（10）检验的特殊性。第三节 生物技术制药1、生物技术制药的特征：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。P52、生物技术在制药中的应用有哪些？P7（1）基因工程制药： 开发基因工程药物，如干扰素（IFN）、红细胞生成素（EPO）等 基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗 基因工程抗体，它可以作为导向药物的载体 基因诊断与基因治疗应用基因工程技术建立新药的筛选模型 应用极影工程激活素改良菌种，产生新的微生物药物 改进药物生产工艺 利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。（2）细胞工程制药单克隆抗体技术 动物细胞培养 植物细胞培养生产次级代谢产物。（3）酶工程制药 ：酶与细胞的固定化及酶转化制药（4）发酵工程制药：发酵工艺改进、新药研制、菌种改造。第二章 基因工程制药第一节 概述（略）第二节 基因工程药物的生产过程P151、基因工程技术：将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。2、基因工程药物制造的主要程序 （过程）（重点和后面几节联系起来）（1）目的基因的克隆（分离目的基因）：通过逆转录、反转录-聚合酶链式反应、化学合成方法来制备cDNA，再通过核酸探针杂交或免疫反应来筛选目的基因（2）目的基因与载体连接构建DNA重组体：通过限制性内切酶DNA连接酶等核酸酶，把目的基因组入载体的相关克隆位点，常用的载体有质粒载体和噬菌体载体（3）将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌：常用的宿主菌有大肠杆菌、酵母菌等，先使宿主菌处于感受态，再通过转化、转导等方式把重组DNA导入宿主菌，以构建工程菌（4）工程菌发酵：提供适当的培养基、反应器、控制好发酵过程中的各种参数，如温度、PH、溶氧等，并通过升温来诱导产物表达（5）目的基因表达产物的分离纯化：通过固液分离、初步纯化、高度纯化、成品加工来制备产品；若是胞内产物需要细胞破碎，若是包涵体则需要变性和复性（6）产品的检验：检测产品的质量和性能 。第三节 目的基因的获得1、利用基因工程生产蛋白质或多肽需要得到其基因，制备目的基因常用的方法有哪些？P16 （1）逆转录法 以mRNA为模板，经逆转录的到cDNA，构建cDNA文库，从cDNA文库中筛选目的基因。由于RNA转录加工过程中，内含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文库中无内含子，适于在原核系统中表达。但是，cDNA只包含蛋白质的结构基因部分，缺少有关的调控序列，因此在原核系统中表达，还需要根据表达载体的结构，配以相应的调控序列。 （2）利用反转录-聚合酶链式反应制备基因 （3）化学合成法：只适用于克隆小分子肽的基因 2、利用逆转录法获得目的基因的基本过程P16 （1）mRNA的纯化 ：从表达目的基因的细胞中提取总RNA，用寡聚脱氧胸苷（dT）纤维素柱从总RNA中提取纯化mRNA。 （2）cDNA的合成 ：以mRNA为模板，利用逆转录酶合成cDNA第一链，再用DNA聚合酶合成cDNA的双链。（3）cDNA克隆：利用合适的连接方法，将产生的双链cDNA片段插入到合适的载体中。 （4）构建cDNA文库 ：将cDNA与载体连接的重组体转入大肠杆菌中，产生的克隆群体为cDNA文库。 （5）从cDNA文库中筛选目的基因 ：得到cDNA文库后，通常采用核酸探针杂交法和免疫反应鉴定法从数以万计的DNA片段中筛选出目的基因。3、载体分为：表达型载体和非表达型载体。P17第四节 基因表达1、基因表达：指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。P202、基因高效表达研究：指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。P203、基因表达的微生物宿主细胞分为两大类：P21第一类为原核细胞（常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等）； 大肠杆菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系）：表达基因产物形式多样，大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。枯草芽胞杆菌：分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。链霉菌：作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。第二类为真核细胞（常用的真核微生物有酵母、丝状真菌等） 酵母：酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达丝状真菌：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。4、目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母。P225、大肠杆菌基因表达载体P23（1）pBV220系统pBV220系统国内使用最多的载体,其组成：来源于pUC8多克隆位点；核糖体rrnB基因终止信号；pBR322第42253735位；pUC18第2066680位；噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子；pRC23的PL启动子及SD序列（2）pET系统6、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素P22外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：（1）外源基因的剂量 ：一般来说细菌内基因拷贝数增加，基因的表达产物也增加。 （2）外源基因的表达效率 启动子的强弱： 启动子是在转录水平上影响基因表达的因素。需要寻找强的启动子。 核糖体结合位点的有效性：大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的高效表达是十分重要的。 SD 序列和起始密码ATG的间距 ：表达非融合蛋白的关键是原核SD序列和真核起始密码ATG之间的距离，距离过长过短都影响真核基因的表达。 密码子组成：应选择使用大肠杆菌偏爱的密码子。 （3）表达产物的稳定性： （4）细胞的代谢负荷 ：必须使宿主细胞的代谢负荷不至过重，又能高效表达出外源基因产物。 （5）工程菌的培养条件 外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处的环境条件息息相关，必须进行优化。 7、真核基因在大肠杆菌中的表达形式P26以融合蛋白的形式表达药物基因 以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达； 缺点：只能作抗原用。以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏。分泌型表达药物基因（外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游） 优点：在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨酸残基； 缺点：产量不高， 信号肽不被切割。8、载体相关定义载体：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。克隆载体：从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为载体，在其上插入合适大小的外源DNA片段，将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，是目的基因能够表达的载体。穿梭载体：指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的载体（例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体）。9、载体的复制系列可分四类： P27（1）Yep类（酵母附加体质粒）（2）YRp类（酵母复制型质粒）（3）YCp类（酵母着丝粒质粒）（4）YIp类（酵母整合型质粒）10、影响目的基因在酵母菌中表达的因素外源基因的拷贝数外源基因的表达效率：启动子分泌信号的效率终止序列的影响外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响：菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要较弱 菌体性能稳定 分泌能力强11、精确表达载体P28酵母载体有两类：普通表达载体和精确表达载体。精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸的克隆载体。第五节 基因工程菌生长代谢的特点1、碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用；P31第六节 基因工程菌的不稳定性1、质粒不稳定分为那两类？P32工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。 质粒的分裂不稳定是指工程菌在分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌的现象。与含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌比数率差异的大小有关质粒的结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。基2、提高质粒稳定性的方法P33（1）选择合适的宿主菌：遗传稳定（2）选择合适的载体：高拷贝数；（3）选择压力：如加抗生素提高稳定性；（4）分阶段控制培养：先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的表达 （5）控制培养条件 （6）固定化第八节 重组工程菌的培养1、基因工程菌的培养方式P36（1） 分批培养（2）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。（3）连续培养（4）透析培养（5）固定化培养2、基因工程菌的培养工艺P37（1） 培养基的影响（2） 接种量的影响（3）温度的影响（4）溶氧量的影响（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序的影响：一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。（7） pH的影响：生长pH在6.87.4左右，后期外源蛋白的表达其最佳pH为6.06.5。第九节 高密度发酵1、什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法实现高密度发酵？P41（1）高密度发酵：一个相对概念，一般指培养基中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L。（2）影响高密度发酵的因素：培养基；溶氧浓度；pH；温度；代谢副产物（3）实现高密度发酵的方法P43发酵条件的改进a.培养基的选择（普遍采用6g/L的甘油为碳源）；b.建立流加式培养的方式；c.提高供氧能力构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌a.阻断乙酸产生的主要途径；b.对碳代谢流进行分流；c.限制进入糖酵解途径的碳代谢流；d.引入血红蛋白基因构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第十节 基因工程药物的分离纯化1、表达的产物都是多肽或蛋白质 ，它的制得具有以下特点：P46（1）表达产物在初始料中含量较低；（2）含有大量细胞及代谢产物；（3）表达产物稳定性差，易失活变性；（4）表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；（5）对其质量要求纯度高、无菌、无热原。2、分离纯化的基本过程若是论述题最好对过程进行一定的介绍3、建立分离纯化工艺的根据P46（1）含目的产物的起始料的特点基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：菌种的类型及其代谢特性。原材料培养基的来源及其质量。生产工艺及条件。（2）物料中杂质的种类和性质。（3）目的产物特性。（4）产品质量的要求4、细胞破碎与固液分离 细胞收集： 离心法、膜分离法。 细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法；物理法、化学法、生物法 固液分离：离心、膜过滤、双水相萃取5、细胞破碎的方法；P47（1）物理方法：匀浆法、珠磨法、超声波法（2）化学法：渗透冲击法（高渗+低渗）、增溶法（表面活性剂等）（3）生物法：酶溶法6、分离纯化常用的色谱分离方法有那些？P50分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等 有害效应。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高 压液相色谱等。 （1）离子交换层析P51离子交换介质由三部分构成：（1）不溶性高分子聚合物载体；（2）共价键结合于载体上-活性基团或功能集团（3）与活性基团带相反电荷-平衡离子或反离子（决定是阴离子交换树脂还是阳离子交换树脂）如：酸性阳离子交换树脂R-SO3H蛋白质的等电点和表面电荷的分布主要影响离子交换的性能。它由平衡、上样、洗脱（分为梯度洗脱和阶段洗脱2种）、再生4个主要步骤构成。（2）疏水层析P54利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。流动相为pH68盐水溶液。常用的介质是多聚糖（如琼脂糖）和硅胶。（3）亲和层析P4756亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。洗脱时分为特异性洗脱和非特异性洗脱。（4）凝胶过滤层析P59凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，大分子量物质先流出，小分子物质后流出。利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。7、用于分离纯化的技术应满足那些要求？P62(1)技术条件温和，能保持目的产物的生物活性。 (2)选择性好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数。 (3)收率要高。 (4)两个技术之间不需要对物料加以处理或调整，这样可以减少工艺步骤。 (5)整个分离纯化过程要快速，能够满足高生产率的要求。 第十一节 变性蛋白的复性1、外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成P632、包涵体：指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 3、包涵体的分离和溶解P63（1）包涵体的分离：重组菌破碎后，离心得沉淀部分，再用低浓度变性剂（脲或盐酸胍）、去垢剂（Triton X-100）、脱氧胆酸钠洗涤。（2）包涵体溶解：般用强的变性剂如脲（6-8M）、盐酸胍（6M），或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等，溶解涵体蛋白质。 （3）包涵体复性：稀释复性和透析复性；含二硫键的蛋白的复性；封闭蛋白的疏水蔟促进复性；凝胶过滤层析复性；小分子添加剂促进的复性；分子伴侣或折叠酶促进的复性；人工分子伴侣的复性第十二节 基因工程药物的质量控制1、由基因重组技术所获得的蛋白质药物产品进行鉴定时，常作那些项目分析？P68（1）肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质后，对生成的肽段进行的分离分析。它是一种可检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法，该技术灵敏高效的特点使其成为对基因工程 药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。 （2）氨基酸成分分析 在氨基酸成分分析中，一般含50个左右的氨基酸残基的蛋白质的定量分析是接近理论值的，即与序列分析结果一致。 （3）部分氨基酸序列分析 部分氨基酸序列分析（N端15个氨基酸）可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。 （4）重组蛋白质的浓度测定和分子量测定蛋白质浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外法等。蛋白质分子量测定最常用的方法有凝胶过滤法和SDS-PAGE法，凝胶过滤法是测定完整的蛋白质分子量，而SDS-PAGE法测定的是蛋白质亚基的分子量。（5）蛋白质二硫键分析 二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，基因工程药物产品的硫-硫键是否正确配对 是一个重要问题。第三章 动物细胞制药第一节 概述细胞工程：是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。P79第二节 动物细胞的形态和生理特点（重点）1、离体培养的动物细胞分为那些类型？P81 动物细胞适应功能,形态各异。离体培养细胞分两类：贴壁细胞；悬浮细胞（1）贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面， 自身分泌或培养基中提供的贴 附因子才能在该表面上生长。两种形态： 成纤维细胞型和上皮细胞型（2）悬浮细胞： 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。（3）兼性贴壁细胞：生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。2、什么是接触抑制现象？P84当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与其周围的细胞相互接触时， 细胞就停止增殖。此时若能保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间，但细胞密度不再 增加，所以该现象又称之谓接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现 象随之消失，细胞可多层生长。细胞密度也就可大大增加。 3、动物细胞的生理特点P83（1）细胞的分裂周期长 动物细胞分裂所需的时间一般为1248h，它不仅随细胞种属的不同而不同，就是同一种属的，不同部位的细胞其所需的时间也不同。周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M） （2）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 (3)正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 (4)动物细胞对周围环境十分敏感。动物细胞对各种物理化学因素，如渗透压，pH，离子浓度，剪切力，微量元素等的变化耐受力很弱。 (5)动物细胞对培养基的要求高 氨基酸、维生素，多种无机盐和微量元素，细胞生长因子、贴壁因子。 (6)动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外，还在与糙面内质网上结合的核糖 体上进行。（游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。）3、动物细胞作为宿主细胞生产药物的特点；P85（1）优点：产品多分泌在胞外，收集纯化方便，得到较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，因此与天然产品更一致，适于临床（2）缺点：培养条件要求高，成本贵，产量低第三节生产用动物细胞的要求和获得1、生产用动物细胞的种类及其特点P86用于生产的动物细胞有三类，即原代细胞、已建立的二倍体细胞系、以及可无限期传代 的转化细胞系，以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞。 (1)原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过分碎，消化而获得的细胞悬液。用得最多的是鸡胚细胞，原代兔肾或鼠肾细胞，以及血液的淋巴细胞。 (2)二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选，并纯化出某种具有一定特征的细胞株。该细胞株仍具备“正常”细胞的特点，一般均从动物的胚胎组织中获取。 (3)转化细胞 这类细胞是通过某个转化过程形成的，它常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了“正常”细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。由于转化的细胞具有无限生命力，而且常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，故更适于大规模工业化生产的需要。 (4)其他：融合细胞系（物理法如高压电场和化学法如仙台病毒、聚乙二醇）和重组工程细胞系2、真核细胞基因表达载体的构建，使用的载体有两类：（1）病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒；（2）质粒载体：穿梭质粒载体P883、重组DNA导入动物细胞的常用方法：融合法、化学法、物理法、病毒法，最常用磷酸钙沉淀法、 电穿孔法P894、生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库（MCB）、生产用细胞库（MWCB）或工作细胞库（WCB）P91第四节 动物细胞的培养条件和培养基1、动物细胞的培养条件P92(1)器材的清洗和消毒 器材的清洗:浸泡、刷洗、泡酸、冲洗 器材的消毒灭菌: 物理消毒/化学消毒(2)水质 :电阻值大于18M,去热原。(3) pH:7.27.4(4)渗透压:290300mOsm/kg(5)温度:哺乳动物370.5 C；(6)空气:氧的饱和质60%,氧分压 40.7kPa2、培养动物细胞的培养基的种类和组成P95动物细胞培养基大致可以分成三类：天然培养基，合成培养基和无血清培养基。 （1）天然培养基：血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定（2）合成培养基：成分明确、大量供应，DME、MEM、DMEM等（第一个合成培养基是199培养基；氨基酸：12种必需氨基酸+谷氨酰胺维生素：形成辅基和辅酶糖类：能源，用葡萄糖和谷氨酰胺无机盐：维持渗透压其它成分：核酸前体和氧化还原剂如谷胱甘肽添加5%10%小牛血清：作用是提供生长因子和激素；提供贴附因子和伸展因子；提供结合蛋白；提供必需脂肪酸和微量元素（3）无血清培养基： 无血清培基的优点如下： 提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批间差异的影响。 减少了由血清带来病毒、霉菌和支原体等微生物污染的危险。 供应充足，稳定。 细胞产品易于纯化。 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性。 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验结果的分析。（简答题时候可以不写优点） 无血清培养基加入添加剂：生长因子和激素（胰岛素）；结合蛋白（鉄传递蛋白和白蛋白）；贴附因子和伸展因子（胶原等）；有利细胞生长的因子和元素（谷胱甘肽）第五节 动物细胞培养的基本方法1、细胞传代；P101原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。传代方法：（1）悬浮细胞：加生长液，然后分种（2）贴壁生长细胞传代：采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。第六节 动物细胞大量培养方法和操作方式1、动物细胞大规模培养的方法P103（1）悬浮培养 悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，不但细胞体积较小，较难采用灌流培养，因此细胞密度一般较低。（目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐式生物反应器和气升式生物反应器。） 2贴壁培养 贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上，细胞才能生长繁殖的培养方法。较容易采用灌流 培养的方式使细胞达到高密度。但操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。 3贴壁悬浮培养 微载体培养：可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，载体的体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内。 包埋和微囊培养：包埋和微囊培养培养细胞不是贴附在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。 包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；可采用多种生物反应器进行大规模培养。（目前最普遍的是琼脂糖和海藻酸钙凝胶） 结团培养 ：结团培养的实质是用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养，所以它也是一种贴附悬浮培养。该培养方法操作简便，节省了微载体的成本。 2、动物细胞培养的操作方式；P106动物细胞培养的操作方式一般可分为分批式、加料分批或流加式、半连续式、连续式和灌流式。 （1）分批式操作 （一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累。最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，往反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。） （2）半连续式操作 （该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一 段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数 量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被 广泛采用。） （3）灌流式操作 （该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将 部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。它与连续式操作不同处，在于取出部分 条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出部分细胞。） 括号部分的内容重在理解 第七节 动物细胞生物反应器1、动物细胞生物反应器必需具备的基本要求；P107（1）一切材料，对细胞必须无毒性。（2）具有良好的传质、传热和混合的性能。（3）密封性能良好（4）对多种物理化学参数能自动检测、调节和高精度控制（5）可长期连续运转 （6）容器内面光滑，无死角（7）拆装、连接和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修。设备成本尽可能低。2、动物细胞生物反应器的类型及特点；P108（1）搅拌罐式生物反应器（目前最广泛应用的动物细胞反应器）：靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性（2）气升式生物反应器：其特点是结构简单，操作方便。（3）固定床式生物反应器：结构简单、装填材料无毒且利于细胞贴壁，剪切力小的特点（4）流化床式生物反应器 ：可连续操作（5）袋式或膜式生物反应器：可取出某些有害代谢物（6）中空纤维生物反应器：用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度高，如果控制系统不受污染，能长期运转。3、反应器及检测；P114（1）温度检测元件：电阻温度计；（2）PH：复合式参比电极（3）溶氧：极普电极或电流式覆膜电极第十节 动物细胞制药的前景与展望1、动物细胞制药有哪些新进展？P135（1）改进表达载体，提高表达水平和产量：采用更强的启动子和增强子更好的利用扩增系统或寻找高表达位点采用和改造更好的宿主细胞（2）利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本：采用代谢工程改造工程细胞改进培养工艺，降低生产成本（3）抑制细胞凋亡，延长培养周期（4）采用糖基化工程，提高产品质量（5）转基因动物的研究（6）组织工程的研究2、代谢工程：采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需求，减少某些代谢产物的产生和无害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力。P137第四章 抗体制药第一节 概述P1431、抗体：即Ig，指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。2、1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（McAb）。3、单克隆抗体：将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的特异性完全相同的高纯度抗体。 单克隆抗体有缺陷：分子量过大；鼠源性抗体；所以要改造：降低单克隆抗体的免疫源性和降低其相对分子量。P144第二节 单克隆抗体及其制备（重点）1、克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。P1482、什么是单克隆抗体？它是如何制备的？P144（1）抗原与动物免疫制备高纯度抗原：抗原可以用化学合成，如精制地高辛。 多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。用抗原免疫脾细胞的制备 ：有体内免疫法和体外免疫法 。体内免疫就是将抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠产生免疫反应，B细胞迅速增殖；体外免疫小鼠脾细胞的悬浮液与抗原一起培养后，再分离脾细胞。 （2）细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养骨髓瘤细胞：和免疫动物同源，目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠（最常用）和 LOU大鼠。脾细胞和骨髓瘤细胞融合：脾细胞（1108）和骨髓瘤细胞（2107）混合，在聚乙二醇诱导下融合2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。（常用PEG相对分子量4000，浓度为40-50%， 二甲基亚砜增加融合率）选择性培养:选择培养基 为HAT培养液。 次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。其上脾瘤融合细胞可以生长，脾脾、瘤瘤融合细胞死亡。（培养基中需要加入饲养细胞才能繁殖，常用饲养细胞是小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞等）（3）筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。克隆化：有限稀释法（将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。）和软琼脂法（将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的）（4）杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。另外还检测抗体特异性、纯度、分子量等。（5）单克隆抗体的大量制备 体外培养法和体内诱生法，多采用后者 体内诱生法：降脂烷注射小鼠腹腔后再接种杂交瘤细胞，取腹水，离心 ，取上清。（6）单克隆抗体的纯化 依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。 体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：离心 取上清，超滤，盐析。分离：凝胶过滤用于IgG IgM单抗纯化；阴离子交换层析IgG单抗纯化；亲和层析 IgG单抗纯化。3、ELISA法：酶联免疫吸附试验，基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。原理：酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。P147第三节 基因工程抗体及其制备（即鼠源性单克隆抗体的改造）1、基因工程抗体：过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床临床诊断、预防、治疗及基础理论研究等领域。P1502、Ig分子结构P150（1）由2条重链(简称H链)和2条轻链（简称L链）组成Y字型结构分子，链与链之间由一对或一对以上的二硫键互相连接（2）Ig分子氨基酸端L链的1/2与H链的1/4的氨基酸组成及顺序多变，构成可变区(简称V区)，V区中某些特定位置构建抗体和抗原特异结合的关键部位，称为互补决定区（CDR）它赋于抗体以特异性。（3）羧基端L链的1/2与H链的134的氨基酸组成及顺序较恒定，构成恒定区(简称C区)，它决定Ig分子的异种抗原性。（4）L链有VL和CL连个功能区，H链有VH、CH1、CH2、CH3四个功能区，VL和VH的CDR区共同构成一个抗原结合部位。3、基因工程抗体及其特性和制备方法（P152图4-4）（1）人鼠嵌合抗体：在基因水平上将鼠源单抗的H 和L链可变区（V区）基因分离出来，分别与人Ig的H 和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H 和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。人IgC-小鼠IgV（2）改形抗体（CDR移植抗体）：用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig 分子中CDR序列，则可使人的Ig 分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。小鼠CDR替代人CDR（3）Fab抗体：重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。（Fd：重链V区及CH1功能区）完整L链+重链V区+CH1功能区（4）Fv抗体：由VH和VL组成的具有完整抗原结合位点的最小抗体片段；VH+VL（5）单链抗体：即scFv，由VH和VL通过连接肽（接头）重组并表达而成的一种小分子抗体，其分子量为整个Ig分 子的1/6具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。VH-多肽-VL（6）单域抗体：只有VH或VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。其分子量仅为整个Ig分子的1/12。VH或VL（7）最小识别单位：即MRU，只含有一个CDR多肽的抗体，也为超变区多肽。第四节 多功能抗体及其制备1、双功能抗体：bisFvs，即双特异性单链抗体，（天然Ig是由两个完全相同的VH和VL区域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位）经人工设计构建的双特异性抗体由两个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药物、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体。P1552、多功能抗体：在scFv的基础上，可以把两个或两个以上的scFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。P1573、抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，称之为抗体融合蛋白。P158第五节 抗体工程1、抗体工程：指利用重组DNA和蛋白质工程技术，对抗体基因进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞后，表达抗体分子，或用细胞融合、化学修饰等方法改造抗体分子的工程。P159现在普遍使用噬菌体作为抗体库技术的载体。6噬菌体抗体库技术基本方法（过程）P159噬菌体抗体库技术：它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。基本过程：噬菌体抗体库技术基本路线为用RT-PCR方法扩增抗体全套可变区基因（VH+ VL），重组到噬菌体载体中，并通过与丝状噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，把Fab段或ScFv表达到噬菌体表面。通过“吸附洗脱扩增”的富集过程，从中筛选出特异性抗体的可变区基因。（右图）第六节 抗体诊断试剂一、三大类抗体诊断药物：血清学鉴定用抗体制剂、免疫标记技术用抗体制剂、体内导向诊断药物。P161二、抗体诊断药物有哪些类型？P1611. 血清学鉴定用的抗体类试剂 （1）鉴定病原菌用的抗体试剂 （2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂 （3）妊娠诊断试剂 （4）抗ABO血型系统血清2、免疫标记技术用的抗体类试剂P164给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。 （1）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。 （2）免疫酶抗体诊断试剂：酶标诊断试剂 a、 HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂 b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶标诊断试剂 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂 d、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂 e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂 f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂（3）放射免疫用抗体诊断试剂 把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。 常用的标记抗体试剂： a、 HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记，灵敏度0.1 ng/ml b、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记，灵敏度0.1 ng/ml c、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记 d、 AFP放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记，灵敏度15 ng/ml e、 CEA放射性核素标记抗体诊断试剂： 125 I 标记，灵敏度1 ng/ml 3、导向诊断药物 由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药物还未爱临床广泛应用。三、CD单克隆抗体系列P169应用以单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一种白细胞分化抗原归称为CD（cluster of differentiation）。人CD的编号已从CD1命名至CD247，大致分为13组。 第七节 抗体治疗药物1、抗体治疗药物有哪些？P173以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。（1）放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。（2）抗癌药物偶联的抗体药物常用的抗癌药物 氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。抗体类药物逆转耐药性（3）毒素偶联的抗体药物在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。 第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达。特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。（3）免疫毒素的临床应用 治疗肿瘤、自身免疫病，并能克复组织移植排斥反应，可单独给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药。第五章 植物细胞制药第一节 基本概念1、植物细胞的全能性。P177植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。第二节 植物细胞工程发展简史（略）第三节植物细胞的形态及生理特性1、植物细胞是由细胞壁、原生质体、后含物三大部分组成P1812、细胞壁、质体、液泡三部分是植物细胞特有的结构，动物细胞没有3、植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的积累主要在稳定期（植物细胞培养时期：延迟期、加速期、对数期、稳定期四个时期）4、植物培养细胞的生理特性;P183（1）生长阶段特征v 延迟期：细胞数量不变，核酸及蛋白合成较快v 加速期：最大生长期，最大细胞浓度v 对数期：细胞数呈对数增加v 稳定期：细胞高液泡化，非常脆弱（2）植物细胞与动物细胞、微生物细胞比较特征哺乳动物细胞植物细胞微生物细胞大小（m）1010010100110生长悬浮、贴壁悬浮悬浮营养要求很复杂较复杂很简单生长速度（倍增时间：h）慢；15100慢；20120快；0.55细胞分化有有限分化无环境影响非常敏感敏感一般细胞壁无有有产物存在部位胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外产物浓度低低高含水量-约90约75供氧需求12520301001000产物种类疫苗、单抗、酶、生长因子、激素、免疫调节剂酶、天然色素、天然有机化合物等发酵食品、抗生素、有机化合物、酶等第四节 植物细胞培养的基本技术1、植物材料的准备；P185 植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料。植物组织培养时表面处理的常用灭菌剂是次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞。2、植物细胞培养的培养基组成P186（1）无机盐： 大量元素：N, S, P, K, Mg, Ca, Cl, Na 微量元素：Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni等（2）碳源：糖类，肌醇等；也可直接通过光合作用吸收CO2（3）植物生长调节物质P189生长素类: 吲哚乙酸（IAA）、分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）植物组织和细胞培养物的生长主要取决于生长素和分裂素的比例。高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂，而低浓度生长素和高浓度分裂素刺激细胞生长。（植物激素：指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（1M）时即能调节植 物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素是目前已发现植物组织中可以形成5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。）（4）氮源：蛋白质水解产物或各种氨基酸。（5）维生素：B族维生素、生物素、肌醇。3、植物细胞大规模培养的方法及特点；P191（1）大规模植物细胞悬浮培养成批培养法（分批）：最适于植物细胞培养的反应器是气升式反应器将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式半连续培养：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养基进行家换。连续培养：利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜配演技以使细胞生长环境维持稳定。（2）固定化培养将细胞固定在固定化反应器上（内），放入新鲜培养基中进行培养，或连续流入新鲜培养基，进行连续培养及收集产物，因将细胞固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物理化学梯度，易于细胞组织化，易于控制条件和获得较高含量次级代谢产物。第五节 影响植物次级代谢产物激积累的因素1、影响植物次级代谢产物积累的因素有哪些？P192（1）生物条件：外植体、季节、休眠、分化等（2）物理条件：温度、光（强度、时间、光质）、通气、PH和渗透压（3）化学条件：无机盐、碳源、生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体等（4）工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌、培养方法等2、重要影响因素P193（一）外植体选择：不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。（二）培养条件的影响（1）内在因素 接种和诱导：次级代谢产物的产率与外肢体的大小、细胞密度与营养成分相关 培养基的基本组成：培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮培养细胞的物质基础，尤其是稳定期的次级代谢产物的积累。（磷、氮；铜是次级代谢产物积累的必要元素） 碳源：糖是使用最广、作用最强的碳源，对次级代谢产物影响主要取决于使用的糖种类、糖浓度及其次级代谢产物的生物合成过程。 植物生长调节剂：不同植物激素及其不同组合形式均可显著影响次级代谢产物的产生。 O2和PH：植物细胞正常呼吸需要氧气，所以需要供氧；一般最利于培养植物细胞的PH在56 渗出物：其它代谢产物也会影响产物产量（2）外在因素温度:代谢产物产生最佳温度是2028； 搅拌频率：适宜 培养容器 光：光照时间、光质、强度都有影响（三）两步法培养：第一步 使用适合细胞生长的培养基（生长培养基），第二步使用适合次级代谢产物合成的培养基（生产培养基）。P197第六节 植物细胞培养的生物反应器1、植物细胞反应器的选择取决于：生产细胞的密度、通气量、提供的营养成分的分散程度。P1992、植物细胞大规模培养的生物反应器P201（1）机械搅拌式生物反应器：反应器内温度、PH、溶氧及营养物物浓度易控制。（2）鼓泡塔生物反应器：没有运动部件，操作不易染菌，有较高的热量和质量传递，容易放大，但是流动形式难以确定，混合不均。（3）气升式生物反应器：低剪切力，混合与氧传递效果好，运动部件不易染菌，操作费用低，但是高密度培养时候混合不够均匀。（4）转鼓式生物反应器：比较适合高密度培养，但是难于大规模操作，放大困难。（5）固定化细胞生物反应器：细胞可长时间重复使用，保护细胞免受剪切力，以实现高密度培养，有利于次级代谢产物合成，易于连续化操作。第七节 进展与展望1、植物细胞培养有哪些新进展？P204（1）诱导子在植物细胞工程中的应用：利用诱导子进行有目的次级代谢产物调控及生物合成。（