水稻基因组学的的研究进展

.基因组学课程论文所在学院 生命科学技术学院 专 业 14级生物技术（植物方向） 姓 名 金祥栋 学 号 2014193012 水稻基因组学的研究进展摘 要：随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序的完成，近年来关于植物基因组学的研究越来越多。水稻是世界上重要的粮食作物之一，养活着全世界近一半的人口。同时南于水稻基冈组较小、易于转化及与其他禾本科植物基因组的同线性和共线性等特点，一直被作为禾本科植物基因组研究的模式作物。水稻基因组测序的完成及种质资源的基因组重测序，为水稻功能基因组研究奠定了基础。现综述我国水稻基因组测序和功能基因组研究历史，重点介绍了近年来在水稻基因组序列分析中获得的几项最新的研究结果。关键词 ： 水稻 ；基因组测序 ；功能基因组 ；研究历史 ；基因组学；研究进展 The recent progress in rice genomics researchAbstract: With the completion of genome sequencing ofthe model plant- Arabidopsis and rice，more and more researches on plant genomics emerge in recent years. Rice is one of the most important crops in the world, raised nearly half of the world population. At the same time in south rice Keegan group is smaller, with linear and linear features such as easy transformation and other gramineous plant genome, has been used as a model crop for plant genome research of Gramineae. Genome sequencing and germplasm resources the rice genome sequencing completed laid the foundation for rice functional genomics research. This article reviews the history and function of our genome sequencing of rice genome research, introduces several latest research results in recent years in the analysis of rice genome sequences.前言基因组是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念，是研究生物基因结构与功能的学科，是在遗传学的基础上发展起来的一门现代生物技术前沿科学，也是现代分子生物学和遗传工程技术所必要学科，是当今生物学研究领域最热门、最有生命力、发展最快的前沿科学之一。基因组学的主要任务是研究探索生物基因结构与功能，生物遗传和物理图谱构建，建立和发展生物信息技术，为生物遗传改良及遗传病的防治提供相关技术依据。进入 21 世纪，随着全球化、市场化农业产业发展和全球贸易一体化格局的逐步形成，我国种业正面临前所未有的严峻挑战，主要表现在 ：依靠传统育种技术难以大幅度提高粮食单产 ；土地资源短缺，农业环境污染日益突出 ；种质资源发掘、基因组育种技术亟需创新等。水稻不仅是重要的粮食作物，由于其基因组较小且与其他禾本科作物基因组存在共线性，以及具有成熟高效的遗传转化体系，已成为作物功能基因组研究的模式植物。因此，水稻基因组研究对发展现代农作物育种技术、提升种业国际竞争力和保障粮食有效供给具有重大战略意义。基因组研究主要包括三个层次:结构基因组学，以全序列测序为目标，构建高分辨率的以染色体重组交换为基础的遗传图谱和以DNA 的核苷酸序列为基础的物理图谱。功能基因组学，即“后基因组计划”， 是结构基因组研究的延伸， 利用结构基因组提供的遗传信息， 利用表达序列标签， 建立以转录图谱为基础的功能图谱( 基因组表达图谱） ， 系统研究基因的功能，植物功能基因组学是当前植物学最前沿的领域之一。蛋白质组学，是功能基因组学的深入，因为基因的功能最终将以蛋白质的形式体现。水稻( Oryza sativa）是第一个被全基因组测序的作物，目前栽培稻2个亚种全基因组测序工作已经完成：粳稻品种日本晴(Nipponbare)通过全基因组鸟枪法和逐步克隆法被测序，籼稻品种扬稻6号(9311)通过全基因组鸟枪法被测序。除核基因组外，水稻叶绿体和线粒体基因组也于1989年和2002年分别被测序。水稻2个亚种的全基因组测序完成，一方面开启了植物比较基因组学的大门，另一方面为人们在基冈组水平上鉴定出所有水稻基因并分析其功能奠定了基础，同时也使得人们对植物进化的认识，尤其是对禾本科植物进化的了解，逐步从系统分类和分子标记水平进入到了基因组序列水平。许多研究者通过对水稻基因组序列的分析，利用生物信息学工具，对水稻在基因组水平上的进化进行了大量研究。1、水稻基因组学的研究1.1、水稻基因组测序的开启水稻基因组测序相对简单然而最终目的不是测序注释序列认识基因的内含子或外显子的结构更重要的是知道每个基因的功能。水稻反向遗传学和插入引起的突变为水稻功能基因组研究提供了强有力的工具。继“人类基因组计划”“拟南芥基因组计划”提出之后，各国科学家为抢夺下一个生物学科研前沿，将水稻基因组计划提上日程。 1991 年日本将水稻基因组制图列入研究规划。我国于 1990年开始研讨水稻基因组测序，并于 1992 年正式宣布开展水稻基因组测序，同时在上海成立了中国科学院国家基因研究中心。历时 4 年，中国在国际上率先完成了水稻 ( 籼稻 ) 基因组物理图的构建，为水稻基因组测序提供了材料基础。 1997 年 9 月，日本和中国作为主要参与国牵头发起“国际水稻基因组测序计划” (International Rice Genome Sequencing Project, IRGSP)。 1998 年 2 月， IRGSP 正式启动，主要内容是开展水稻遗传图和物理图的绘制，完成基因组序列的测定及基因序列的注释分析等工作。IRGSP 确定以主要栽培品种粳稻“日本晴”作为测序对象，基于基因组物理图谱进行测序。水稻12 条染色体的测序工作分别由日本 (6 条 )、美国 (3条 )、中国 (1 条 )、中国台湾 (1 条 )、法国 (1 条 )承担，其中印度、韩国、巴西等参与了部分染色体的测序工作。中国科学院上海生命科学研究院国家基因研究中心作为中国大陆的参加单位，承担第 4号染色体的测序工作。由于水稻种质资源丰富且控制重要农艺性状的基因存在大量的序列变异，随着新一代测序技术的发展及测序成本降低，近年来开展了大量种质的基因组重测序。 2011 年，我国科学家对 50 个水稻品种进行基因组重测序并构架遗传变异数据库，首次对野生稻和栽培稻的基因组进行大规模的遗传多样性分析，为挖掘野生稻优良基因，加快高产、优质水稻品种培育奠定了理论基础。1.2我国水稻功能基因组研究计划水稻基因组序列的获得为基因功能研究奠定了基础。“功能基因组学”的主要任务是解析这些序列的功能及组装结构，并在此基础上揭示各种生命现象所涉及的基因及其表达调控的机理，最终阐明基因组的功能。我国在水稻基因组测序取得进展的同时，适时启动了水稻功能基因组研究。 1999 年，科技部通过国家重点基础研究发展计划 (“973”项目 ) 和国家高技术研究发展计划 (“863”计划 ) 开始资助中国水稻功能基因组研究。起初，中国水稻功能基因组研究主要包括 3 部分内容 ： (1) 建立功能基因组研究平台 ； (2) 开展重要农艺性状功能基因组研究 ； (3) 重要基因的分离克隆和功能分析。随着水稻功能基因组研究的深入，逐步拓展了功能基因组组学研究平台，主要包括：种质资源、转录组、表观组、代谢组、表型组及生物信息数据库等组学平台。重要农艺性状功能基因组研究主要包括功能基因和调控因子的分离克隆、重要农艺性状形成的调控网络解析。功能基因组研究的最终目标是应用于基因组技术育种，培育高产、优质、多抗的水稻新品种。2 水稻基因组的测序2.1遗传图谱水稻是已知的单子叶植物中基因组最小的植物之一，基因组大小为450 Mb， 共有12 条染色体。自1988年MeCoueh等6利用IR34583(籼）Bulu Dalam(爪哇）的F2群体构建了第一张水稻分子连锁图谱(含135 RFLP标记）以来，高密度的图谱相继产生。近年来，随着分子遗传学的迅速发展，国际水稻基因组测序计划(International Rice GenomeSequencing Project，IRGSP）成员国以Nipponbare、Kasalath、IR64和Azucena等水稻品种为材料，构建了10个饱和的遗传图谱并与表型的标记进行了整合，以创造新的遗传资源。1998年，Harushima等7构建了一张高密度水稻遗传连锁图，包含2275个遗传标记，覆盖水稻基因组15216 cM。2001年Rice Genome Program(RGP）公布了包含3 267个RFLP分子标记的水稻分子连锁图。还利用次级三体和终级三体(telotrisomics）将经典遗传图和分子遗传图中的着丝粒位置确定，修正了分子图谱的方向，把RFLP标记定位到特定的染色体臂上；Wu等8构建了水稻第11和第12染色体短臂末端重复基因组区域的图谱，重复基因组区域大小是25 Mb，表明水稻也存在大染色体片段的重复区域。上述遗传图谱在基因定位、物理图谱的构建和基因测序中发挥了或即将发挥巨大作用。2.2 物理图谱水稻物理图谱的构建有利于以图位克隆技术分离目的基因 ,因此 ,基因物理定位研究是水稻基因组研究计划的一个重要方面 。国际水稻基因组测序计划(IRGSP）已于2002年12月宣布，利用克隆连克隆(逐步克隆）测定法(clone by clone sequencing），提前3年完成了水稻12条染色体的碱基测序工作。日本在其中发挥着主导作用，并最先以9999的精度完成了最长的第1条染色体的测序工作。另外，中国12家单位，于1998年至2001年利用全基因组霰弹法(whole- genome shotgun sequencing，WGS），构建了籼稻9311基因组工作框架图和低覆盖率的培矮64S草图，并最先向全世界公布了水稻9311全基因组框架图。随后，美国先正达(Syngenta）公司也完成了日本晴基因组工作框架图的测序。两个框架图同时发表在2002年4月的Science第296期第7999页，它们都是对IRGSP的补充。水稻基因组框架图和全长序列的精确测定虽已基本完成，但片段之间或重叠群之间仍存在一些缺口或空隙(gap），如籼、粳两个亚种的基因组工作框架图分别覆盖了水稻全基因组的95.29和93，碱基准确率约99。当前基于物理图精确测序的图谱研究表明，水稻“日本晴”全基因组己获得3721 Mb的高质量精确序列，余下的5分布于12条染色体上的38个间隙(gaps）、10个着丝粒和10个端粒处；水稻全基因组预测有56278个基因位点，因为6498个基因位点编码10432个转录本，所以总转录本为66710；如果去除15236个转座因子相关的蛋白编码基因后，共有41042个基因位点编码非转座因子相关的蛋白，平均9.4 kb含一个基因，其中约29的基因成族出现，约71与拟南芥基因(Arabidopsis，28000-29000个基因）享有同源性(反过来，约90的拟南芥基因与水稻基因享有同源性）。31439个基因位点已经得到ESTs序列、全长cDNA序列、Tiling芯片检测、大规模平行测序(massively parallel sigNature sequencing，MPSS）检测的RNA转录水平上的确认，8226个基因位点的编码蛋白序列与功能已知的蛋白质序列相同或相似，另有13632个基因位点的编码蛋白含有已知的功能域。2.3 EST测序大规模的 ES T 测序对研究水稻基因组很有帮助, 分离和部分测序的 cDNA 克隆不仅有利于构建RFLP 连锁图谱和物理图谱 ,而且还可以了解各类同功酶和基因家族的表达机理。大规模的 EST 测序的最终目的就是要将所有表达的基因进行分类 。 RGP 研究小组从水稻不同组织和愈伤组织中分离和部分测序了 29 000 个 cDNA 克隆, 这些碱基序列翻译成氨基酸序列时存在 3 个可能的阅读框, 通过PIR 数据库同源性检索 ,分析的 cDNA 序列与已知蛋白质的编码序列具有高度同源和相似性的克隆占25 %,还有 75 %的克隆编码未知功能蛋白 9 。到目前为止, 公共的 ES T 数据库中已有 68 000 水稻EST ,私有 ES T 数据库中也有 120 000 多个 ES T , 这些 ES T 主要来自于 5 -末端, 但现在对应克隆的3 -端也在测序 ,这就使我们可以探测多基因家族的不同成员, 有利于构建全长 cDNA 10 。所有公共的水稻 EST 可分成大约 21 000 重叠克隆群 ,这样就可以鉴定相同数目的表达基因, 许多表达基因与其它物种的基因表现出相似性。因为水稻富含 CG 的密码子较多 ,只有在蛋白质水平上进比较, 表明水稻与大多数植物和有机体分享相同的基因,但水稻 ESTs 的 30 %与鉴定的无同源性 。这就揭示在了解水稻基因功能前存在间隙 ,另一方面, 尽管水稻的密码子较多, 拟南芥 ES Ts 的 1 % 2 %与水稻 ESTs在核苷酸序列水平相一致 11 ,这些保守序列可与许多不同基因组杂交 ,尔后进行线性排列。2 .4基因组测序国际水稻基因组测序计划 ( IRGSP) 由 1997 年在新加坡举行的植物分子生物学会议发起 ;1998 年 ,中国、日本、美国和韩国的代表共同草拟了资源共享等组织议程 ;2000 年在美国的 C1emson 召开了协调会 ,对 12 条染色体测序任务进行了分工 (表 1) 。 测序工作分为测序、填补缺口和最后完成三个阶段。对于最后测序结果的标准 , IRGSP 规定为误差率低于 1/ 10000 (精度 99. 99 %) 。 第二阶段是测序工作的瓶颈 ,测序阶段留下的缺口需要补平 ,水稻特殊序列组成 (易于形成二级结构和 GC 富集区) 和重复序列造成的低质量测序结果需要改进22 。 通过各研究机构和私营公司的共同努力 , IRGSP 已于 2002 年 12月宣布 ,利用克隆连克隆 (逐步克隆) 测定法 (cloneby clone sequencing) ,提前 3 年完成了水稻 12 条染色体的碱基测序工作。3 水稻基因组的信息3.1水稻基因组的概述水稻基因组有 12 条染色体 ,第 1 染色体最长 ,第 10 染色体最短 ;核基因组序列总长约 430 Mb ,是拟南芥基因组的 3. 7 倍或人类基因组的 1/ 6. 7 ,预测基因总数达 32 00056000 个 ,可能多于人类基因总数。籼稻是亚洲和世界其他一些地方广为种植的主要水稻亚种 ,同时也是我国杂交水稻的主要遗传背景之一 ,为解决中国人民的粮食问题作出了巨大贡献。 籼稻 93211 基因组框架图 ,共完成 462 万个成功反应 ,得到了 127 550 个重叠群 ,覆盖深度为 4. 2 ,预测基因组长 466 Mb ,实测的全长非冗余序列为409. 76 Mb ,大约覆盖了水稻全基因组的 95129 % ,碱基准确率大于 99 % ;估计基因的大小为 4 500 bp ,预测基因数为 4. 6 万5. 6 万个 ,拷贝基因占基因总数的 74 % ,转位因子占全基因组的 2419 % ,简单重复序列数为全基因组的 2. 1 % ;基因内 GC 含量的梯度明显 ;外显子变异少、内含子变化大 ;水稻与玉米、小麦和大麦之间有广泛的共线性 ,但水稻与拟南芥的共线性是有限的。3. 2水稻全基因组的完成图水稻基因组框架图和全长序列的精确测定虽已基本完成 ,但片段之间或重叠群之间仍存在一些缺口或空隙 (gap) ,如籼、粳两个亚种的基因组工作框架图分别覆盖了水稻全基因组的 95. 29 %和 93 % ,碱基准确率约 99 % ;第 1 染色体和第 4 染色体的全长序列之间也分别还有 8 个和 7 个缺口。 由于无数重复序列 ,第 1 染色体 390 个 PAC/ BAC 克隆中有 4个克隆仍缺乏一致性 ,还属于测序的第 1 阶段 ;16个克隆属于第 2 阶段 ,370 个克隆属于第 3 阶段。 框架图仍需增加更大片段读序 ,构建更大跨度的重叠群(支架) ,填充这些顺序间隙 ( sequence gap) 和物理间隙 (physical gap ) ,结合现有的物理图 ,改善框架图。 全长序列还可用荧光标记终止法、引物步查法和少核苷酸的 PCR 反应等方法填补缺口或纠正组装错误。 最终 ,为世界上所有从事水稻以及其他禾谷类作物研究的生物学家和遗传学家提供一个高度准确并进行精细注释的水稻基因组完成图。4 未来水稻功能基因组学的发展趋势4.1水稻2020研究计划(RICE 2020)RICE 2020 计划是我国科学家基于全球水稻功能基因组研发现状和生物技术手段的不断创新，适时提出的关于水稻功能基因组研究中长期发展的国际合作计划，包括以下主要内容 ：建立国际共享的水稻功能基因组研究的技术平台和基因资源 ；解码水稻全部基因的生物学功能 ；开展系统的表观基因组学和基因表达分析研究，明确基因的调控网络；建立蛋白质组和蛋白质互作组 ；挖掘栽培稻和野生稻的自然变异和基因组多样性 ；发展生物信息学，建立海量数据搜索和分析的数据库平台 ；建立以基因组研究成果为基础的分子设计育种技术。我国水稻功能基因组在 RICE 2020 计划的指导下已取得傲人成果，但考虑到水稻基因组的复杂性， RICE2020 计划的总体目标仍然是下一阶段水稻功能基因组研究的灯塔。4.2重要农艺性状形成的分子网络解析 我国水稻功能基因组研究始终以水稻重要农艺性状的分子网络剖析和基因组遗传改良对技术和基因资源的需求为导向。经过几轮水稻功能基因组项目的实施，我国在水稻产量、品质、抗病虫、抗逆、养分高效利用等重要农艺性状功能基因解析方面取得突破性进展，相关的功能基因及其调控机制表现出较好的育种应用前景。由于重要农艺性状形成的分子网络的复杂性，目前获得的功能基因仍然屈指可数，相关的分子调控机制了解还不透彻。因此，重要农艺性状形成的分子网络解析在相当长的一段时期内仍然是水稻功能基因组研究的重点。未来水稻功能基因组研究将进一步发掘种质资源的多样性，拓展转录组学、表观组学、蛋白质组学和代谢组学等组学研究平台，分离克隆控制水稻重要农艺性状的功能基因及调控元件，应用于水稻重要农艺性状的遗传改良。4.3水稻4D基因组学(RICE 4Dome) 基于水稻基因组测序技术的革新及已有的功能基因组研究平台，从整体上开展水稻 4D 基因组学研究已成为今后水稻功能基因组研究新的增长点。针对水稻重要性状的生物学问题 ( 产量、抗逆、品质、杂种优势等 )，系统研究水稻基因组三维空间结构及其动态变化对基因转录、复制、调控等生物过程的作用机制，对解析水稻生长发育环境适应的分子机理，指导水稻的遗传改良有重大意义。4.4全基因组育种技术 充分利用高通量测序技术获得的大量水稻品种重测序结果，将世界上最先进的分子标记检测技术和我国 10 多年的水稻基因组研究成果积累结合起来，开展水稻全基因组选择育种技术，搭建了水稻全基因组育种芯片技术平台，有望现育种过程的科学控制 ：有目的地选择优良性状相关位点进行组合，创造优良基因型 ；在导入目标性状，使受体亲本主要缺点得到改良的情况下，高度保持其原有优良性状。该技术将对促进我国育种行业转型，从传统育种向以基因组信息为依据的科学育种起到重要影响，提高我国种业创新能力以及与国际种业巨头竞争的实力。水稻全基因组选择育种技术平台的建设和育种应用将为我国其他作物的全基因组选择育种技术提供示范和经验。参考文献1.Galbraith D W, Harkins K R, Maddox J R, et al . 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