纳豆及纳豆激酶研究进展

.纳豆及纳豆激酶研究进展王 建，李宏梁(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安 710021)摘 要：纳豆是一种营养价值极高但口味怪异的功能性食品，具有溶血栓作用等多种保健功能，具有极大的应用前景，概括了纳豆的营养保健功能，生产工艺及其优化以及纳豆的风味改善研究；纳豆激酶是从纳豆中提取的一种碱性丝氨酸蛋白酶，具有高效的降血栓作用，而且易吸收，无副作用，有望被开发为新一代的口服抗血栓药物，重点概括了纳豆激酶的制备方法和分离纯化方法，并对纳豆激酶的开发应用进行了展望。关键词：纳豆；溶栓作用；风味；纳豆激酶；分离纯化中图分类号： TS 252.51 文献标识码： A 文章编号：Advance in natto and nattokinase researchWANG Jian, LI Hong-liang （College of Life Science Engineering, Shaanxi University of Science Technology, Xian 710021, Shaanxi, China）Abstracts: Natto have many sanitarian functions, but the taste was specially, had dissolves the thrombus function and so on, had the enormous application prospect, summarized sanitarian functions, the technique of production and optimized as well as the research of natto flavor improvement; Nattokinase is one kind of alkalinity serine proteinase which found in the natto, has highly catalyse fibrinolysis function, easy to absorb and it is safe for health, is hopeful to become a possible drug in the treatment of thrombi, mainly summarized the preparation method and the purification method of nattokinase, and forecast the attokinases development application prospect.Key Words: natto; catalyse fibrinolysis; flavor; nattokinase; purification纳豆是日本的传统发酵食品，它是以大豆为原料经纳豆芽孢杆菌(BacilluSnatto)发酵而成。纳豆具有独特的风味和粘性，与我国的传统食品豆豉相似，但纳豆是由纯菌种发酵而成，时间较短，便于控制，其保健功能也远远高于豆豉。纳豆菌是在20世纪中期被发现并分离出来的，它不仅具有分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质的性能，使发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的成分，而且在纳豆中还发现一些生理活性物质而使纳豆具有多种保健功能，如溶血栓、抗肿瘤、降血压、抗菌等作用，还可预防骨质疏松、提高蛋白质的消化率、抗氧化等。随着社会的进步和科学的发展，纳豆作为功能性食品逐渐受到人们的重视 ，但因纳豆昂贵的价格和具有浓重的氨臭味，难以被国内消费者所接受1，因而开发价格低廉且符合中国人口味的纳豆产品具有广阔的前景2。纳豆激酶（Nattokinase，NK）是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，1987年由日本的须见洋行等人3首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并将其命名为纳豆激酶。此后研究人员对纳豆激酶从不同角度进行了研究，并取得了一定的进展。目前，对纳豆激酶的性质、作用机制、分离纯化等方面都已有了一定的了解，基因克隆、转基因技术也被运用到纳豆激酶的研究当中，并在某些菌株中得到有效表达4,5。许多国家现已相继推出以纳豆激酶为原料的产品，对纳豆及纳豆激酶的研究方兴未艾。1纳豆研究进展1.1 纳豆的营养价值 纳豆是大豆煮熟后经接菌发酵而制成的功能食品，它除了保持原料大豆的营养外，有些成分的含量比煮熟的大豆还要高，如蛋白质、纤维、钙、铁、钾、维生素B1、维生素B2等，特别是钙、铁、钾等矿物质的含量甚至超过了鸡蛋。如果将纳豆与鸡蛋和牛肉作比较，100g纳豆的蛋白质含量相当于3个鸡蛋或80g牛肉6。纳豆中氨基酸含量也非常丰富，这是由于纳豆在发酵过程中产生多种维生素和酶类，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维酶、纳豆激酶、溶菌酶、谷氨酸转肽酶等，由于酶的作用使蛋白质及其它营养物质发生分解，因此纳豆的消化率(85%)比煮熟的大豆(68%)还要高，营养更丰富，也更容易吸收7。1.2 纳豆的保健功能1.2.1 溶栓作用1987年，须见洋行等人通过试验证明纳豆激酶具有强烈的溶栓作用，每克湿纳豆含有的纳豆激酶的酶活相当于现在临床使用的尿激酶1600IU甚至更高。此外，经研究证明纳豆激酶不仅溶栓效果好，还具有许多其它优点，它可经口服被肠薄膜吸收、分子量小、无抗原性、无毒副作用、长期服用安全可靠、在体内半衰期长（约68h）、价格低廉、且属于食源性激酶。因此，较现在临床使用的一些溶血栓药物如尿激酶、蚓激酶、链激酶和组织型纤溶酶原激活剂等更具优势8。1.2.2 降血压纳豆周围的黏性物质中含有一种血管紧张肽转化酶抑制剂（ACE Inhibitor），具有降血压的功能9。1977年，日本帝国女子大学营养学教授林（林右市）的研究小组进行了纳豆预防高血压的实验，他们分别用纳豆和大豆喂养有遗传性高血压的小白鼠，结果发现，食用大豆的鼠血压逐渐升高，4个月内平均波动达到0.033MPa，而食用纳豆的鼠血压4个月内波动最高值仅为0.027MPa，从而证实纳豆具有降血压的功能10。1.2.3 抗氧化作用经研究证实纳豆比未经发酵的大豆具有更强的抗氧化作用，纳豆抑制脂肪氧化的能力达91%，而大豆仅为13%。这是因为纳豆中含有丰富的异黄酮、卵磷脂、超氧化物歧化酶(SOD)、不饱和脂肪酸和维生素E等抗氧化成分，因此经常食用可有效降低血脂、胆固醇及清除脑组织细胞中的过氧化脂质色素。另外，纳豆对由过氧化物(Cumene Hydroperoxide)所引起的细胞伤害也有疗效。1.2.4 防止骨质疏松纳豆菌是目前发现的唯一一种可以产生维生素K2的细菌，其发酵大豆可产生大量的维生素K2（100g纳豆中约含有1000g的维生素K2）。维生素K2可促进骨蛋白质（Osteocalcin）的生成，这种蛋白质可与钙共同生成骨质，增加骨骼的密度，每天食用l0g纳豆就可提供机体足够的维生素K2。须见洋行等研究证实，进食100g纳豆4小时后血液中的维生素K2的浓度最高可达原来的54倍。1.2.5 抗菌作用纳豆菌发酵大豆可以产生多种抗菌素，如杆菌肽、多黏菌素、2，6-吡啶二羧酸等，这些物质对痢疾杆菌、原发性大肠杆菌（0-157、0-111、0-144）、伤寒菌以及沙门氏菌等都具有强烈的抑制作用。须见教授对纳豆的抗菌功能作了研究，结果表明将纳豆加进0-157病菌4天后，病菌全部被抑制而死亡11 。此外，国内学者钟青萍等人研究发现纳豆菌具有广谱抗菌作用，特别是对细菌、酵母菌和霉菌等常见食品污染菌有较好的拮抗作用，对大肠杆菌也同样有效12。 1.2.6 调整肠道功能纳豆菌是一种对人体无病原性的安全菌株，食用后在肠道中可以生长，并能生存几周，分泌各种酶和维生素，促进小肠粘膜细胞的增殖。另外，纳豆菌还可抑制肠道内有害细菌的生长，尤其对痢疾志贺氏菌和伤寒沙门氏菌的抑制效果特别明显，优于乳酸菌；同时纳豆中的纤维素类物质可以与寡糖耦合，从而促进双歧杆菌、乳酸菌等有益菌的增殖，对肠道菌群的微生态平衡起重要的调节作用，从而保证肠功能的正常。1.2.7 抗肿瘤作用 国外研究发现，纳豆菌可有效地抑制或杀灭癌细胞，并可刺激机体免疫系统诱发产生干扰素，起到抑制肿瘤的功效。1967年，日本金泽大学药学院的龟田教授报告了纳豆抗癌动物实验的结果，他将Ehrlich肉瘤分别移植到小白鼠的左右足皮下，23天后，在右足部注入纳豆菌，11天后研究发现右足没有癌细胞生成，而左足有癌细胞生长，从而证实纳豆菌具有抑制癌细胞生长的作用13。1.2.8 防治糖尿病日本学者研究发现纳豆不仅能减缓小肠对糖份的吸收，还能防止进食后血糖的迅速升高14。 纳豆中含有的氨基酸诱导体的有效成份能使小肠中的-葡萄糖苷酶的活力下降，从而抑制摄入的淀粉和蔗糖转化为单糖（小肠只能吸收单糖），起到防治糖尿病的作用。1.3 纳豆生产工艺及优化1.3.1 纳豆生产工艺纳豆是以大豆为原料，经纳豆芽抱杆菌(BacilluSnatto)发酵而成，具有独特的风味和粘性。其一般生产工艺如下15,16：大豆精选清洗浸泡蒸煮冷却接种发酵后熟调味包装（1）纳豆杆菌菌种液体振荡培养，OD6001.6 后放入冰箱备用。（2）选用颗粒饱满，蛋白质含量高的市售大豆。（3）用大豆三倍的水量浸泡一昼夜(室温15 )，沥水。（4）加入3%的食盐和蔗糖，高压锅内121 下蒸煮20 min，以豆子很容易被用手捏碎为宜，冷却至55 以下。（5）在无菌条件下，将事先活化好的菌种喷洒于大豆中搅拌均匀，铺成35 cm 的薄层，恒温培养发酵。（6）发酵结束，将纳豆放入4 冰箱中老化24 h。1.3.2 纳豆发酵工艺优化郭德军等人17 通过正交试验和产品感官评定，得到的纳豆生产优化工艺是：菌种为B-1，大豆浸泡时间为14 h，蒸煮时间20 min（121），接种量4%，最佳发酵温度为37，最佳发酵时间为24 h，NaCl 3%，蔗糖2%，在4下后熟24 h。齐凤兰等人15优化的纳豆生产工艺是：种龄为18h，大豆浸泡时间为14h、蒸煮时间45min(121)、最佳发酵温度为37、最佳发酵时间为18h；纳豆生产的促生长因子为玉米浆3%、NaCl0.5%、无水葡萄糖2%；在4下后熟24 h。熊迎新等人18以实验室优选的枯草杆菌为出发菌株，研究各种因素对菌株产酶的影响。通过单因素实验，确定固体浅盘发酵的最佳工艺条件：种子液(酵母粉2.0%，麦芽糖0.5%，Na2HPO40.3%，KH2PO40.03%，MgSO40.05%)于37、200r/min恒温振荡6 h，按10%的量接种于煮熟大豆，37培养24 h后用生理盐水浸提，离心，即得纳豆激酶供试品液。优化后，1 g大豆可发酵出纳豆激酶1931IU(即1931IU/g)，而发酵工艺优化前只能达到1204IU/g。纳豆生产工艺的优化是以感官和纳豆激酶酶活为评定标准，以纳豆激酶酶活为主，但是纳豆激酶酶活的测定存在制作成本高、费时等缺点，若能将电子鼻、质构仪等高新仪器应用于纳豆感官的评定，在今后纳豆生产工艺优化及纳豆产业化标准制定方面将具有广阔的应用前景。 1.3.3 纳豆口味改善工艺 随着人们生活水平的不断提高，人们对食品的要求己经不仅仅是能够吃饱，更重要的是吃好，吃出健康。在这种前提下，人们不仅注重食品的可口性，更注重食品的营养性和保健性。纳豆正是这种集营养性与保健性于一身的理想食品，但纳豆本身有一种臭苦味，较难为我国人民接，为了使纳豆为更多国人所接受，我国学者正进行口味方面的改进。关茵等人19从纳豆发酵的工艺研究入手，对原料浸泡比例、蒸煮温度和时间、发酵时间、接菌量等进行优化。研究表明，黄豆与水的比例为1:7，蒸煮温度100，蒸煮时间70min，发酵时间20h，接菌量为14%时，制作的纳豆所带有的氨味最少，产品的各项感官指标均良好。王刚20考察了发酵条件对纳豆口味的影响，主要考察了混合菌种发酵和不同培养基添加物对发酵口味的影响，如培养时间、投料比、接种量等因素对发酵口味的影响，同时考察了不同口味调味料对纳豆产品口味掩蔽的作用。结果表明，利用有些菌株在发酵过程中能够产生香味物质，比如乳酸菌利用山碴果珍粉、蜂蜜能够产生口味纯正、柔和的香味，试验中通过接种不同的菌种，通过两次发酵，调节纳豆的口味，得到较为理想的结果：即接种量为4%、食盐的添加量为4%、蔗糖的添加量为8%、山碴果珍粉0.2%、蜂蜜0.1%、发酵培养24h，纳豆的口味较好，没有氨味，而且黏液较多。口味中甜的成分不是很大，结果较好。适合中国人的口味；在发酵调节的基础上，对纳豆产品的风味进行进一步的调节，主要设计了辛辣、酸辣等调味料，将通过发酵改善气味的纳豆，添加不同口味的调味料，使纳豆原有的不愉快气味基本得到了掩盖。刘树兴等人21通过在纳豆食品中加入甜面酱和芝麻酱这两种基础调味料，配以多种辅料，可制成具有良好风味且使用方便的复合调味酱包。结果表明，纳豆复合调味酱的最佳配方为甜面酱与芝麻酱配比为3:4，花椒粉、食盐、白砂糖添加量分别为2%，1.5%，14%。添加5g/kg牛肉香精可增加其风味，添加5g/kg山梨酸钾，于0.1Mpa，121条件下灭菌处理8min，复合调味酱包可长期保存。1.4 纳豆前景展望目前，心脑血管栓塞的患者日益增多，特别是处于潜伏期的患者增多，很多人处于亚健康的状态。现在的药品在实际应用中它们都具有一定的局限性，生产成本高、价格昂贵、毒性强、副作用大、体内半衰期短等。而开发纳豆和纳豆激酶制品将可以解决这一难题。纳豆通过固体发酵制备，以大豆为原料，成本较低，较为容易被广大人民群众接受，特别是处于潜伏期的患者和健康人群所接受，并且我国大豆资源丰富，通过对纳豆这种深加工产品的开发，转化我国的大豆资源，提高产品的附加值，对人民的生活水平和生活质量的提高有较为深远的意义。2 纳豆激酶的研究进展目前，关于纳豆激酶的结构、理化性质、生物学功能溶栓机制等方面国内外学者已经进行了大量的研究，在这方面阐释的已经比较清楚，目前的研究重点主要集中在纳豆激酶的制备和分离纯化。2.1纳豆激酶的制备研究 制备纳豆激酶一般有两种方式，即固体浅盘发酵和液体深层发酵。目前我国许多高校和科研机构都对纳豆激酶发酵条件进行了研究。梁淑娃22通过研究后认为，深层发酵的最佳培养基配方为葡萄糖2%，大豆蛋白胨1%，Na2HPO4 0.6%，NaH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%，CaCl2 0.02%，最佳培养基起始pH值为7.0，接种量为3%，最适发酵温度为35。在此条件下，500mL摇瓶、50L罐和500L罐发酵酶活最高分别达到1903IU/mL、2210IU/mL和1934IU/mL。祖国仁等23对纳豆菌固体发酵条件进行了研究，确定最佳条件为浸泡后的大豆在121高压蒸煮30min，纳豆菌接种量2%，于37发酵24h，再置于4冰柜后熟24h。成熟的纳豆产品纳豆激酶活力可达670.15IU/g湿纳豆。杨慧宁等24以海参为培养基进行液态发酵3d，酶活力可达到245.75IU/mL。黄占旺等25研究了采用米曲霉、纳豆芽孢杆菌混合发酵技术制作纳豆的新工艺。试验结果表明：米曲霉无盐发酵适宜温度60，发酵时间36h42h，用纳豆芽孢杆菌进行二次发酵最佳条件为发酵温度36，接种量1%，发酵时间30h，成品纳豆中纳豆激酶活性314.30IU/g，氨基酸态氮含量0.846%。胡升等26利用响应面法对纳豆激酶的液体发酵条件进行了优化，使发酵液中纳豆激酶浓度从1005.73IU/mL提高到1314.48IU/mL。各位研究者所得出的结论大不相同，这可能是由于所选择的菌株不同或检测纳豆激酶活力方法不同等造成的。目前对纳豆激酶发酵的研究，大多停留在实室摇床阶段，对影响纳豆激酶产率的一些重要因素，如诱导、阻遏等探讨不深，因此对于纳豆激酶的代谢途径以及调控机制等方面还有待进一步研究。2.2 纳豆激酶的分离提取纳豆激酶是胞外酶，可以利用纳豆菌的发酵液提取。方法如下：将纳豆菌的发酵液离心，取上清液，用硫酸铵或乙醇沉淀，再经离心以除去发酵上清液中的粘性物质，主要是果糖（fructose）和多聚谷氨酸(polyglutamine)。离心后取沉淀，溶于缓冲液中便为粗酶液。粗酶液经超滤脱盐、离子交换、柱层析、透析，最后冷冻干燥即得酶干粉。若以纳豆为材料提取NK，只需在上述步骤前增加一步，先用生理盐水浸提，其他相同。刘俊果等27以顺-2-乙基己基磺酸钠/异辛烷反胶团体系为有机相对发酵液中的纳豆激酶进行萃取，经过一次萃取循环，蛋白质回收率约为33.25%，酶活力回收率达到80.2%。刘柳等28研究得出较好分离纯化方案为样品依次经过DEAE-Sepharose FastFlow阴离子层析、CM-Sepha-roseFastFlow阳离子层析和Penpyl-SepharoseCl-4B疏水层析柱，纳豆激酶最终的纯化倍数达到32.2，回收率为13.2%。陆瑾等29利用金属鏊合亲和双水相分配技术对纳豆激酶的分离纯化进行了研究，结果表明，双聚合物系统比聚合物/无机盐系统更有利于纳豆激酶亲和分配；pH值和亲和配基加入量是影响分配的关键因素。高大海等30采用发酵液离心除菌, 20%60%饱和度的硫酸铵沉淀，Superdex 75凝胶过滤层析和SP Sepharose FastFlow离子交换层析对活性组分进行分离提纯，最终纯化倍数和酶活回收率分别为8.4和49%。许芳等31通过超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、SephadexG-100柱层析以及冷冻干燥等步骤进行分离纯化，得到电泳纯的纳豆激酶。陆利霞等32通过硫酸铵分级盐析法和PhenylSepharose疏水柱层析进行分离纯化，用SDS-PAGE电泳验证为电泳纯。综上所述，目前纳豆激酶的分离纯化大数是使用离心、盐析、过滤、层析等常规手段，虽然也可以获得电泳纯的产品，但是由于纯化的步骤多、时间长，从而导致纳豆激酶的回收率普遍不高，酶失活也比较严重。少数研究者也采用了一些新的分离纯化方法，如反胶团萃取、双水相萃取、超滤等，取得了一些成果但并不完善。2.3 纳豆激酶的前景展望纳豆激酶产品在世界各国已开始积极开发，日本、韩国、朝鲜等许多国家已研制出多种以纳豆激酶为主要成分的产品，大多由纳豆激酶与其他种类的酶制剂复合而成，如菠萝蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等，或添加甘油、蜂蜡及卵磷脂、DHA、SOD等营养物质，制成粉剂、片剂、软硬胶囊、口服液或保健食品，但关于临床注射用的纳豆激酶产品还未见报道。为了进一步提高纳豆激酶活力，各国科研人员正通过加强基因工程改良纳豆菌株，生产工艺优化等研究，试图将纳豆激酶的生产引入大规模工业化生产33。在我国，由吉林省雁鸣湖大豆生物技术科技有限责任公司出品的纳豆已经上市。黑龙江省应用微生物研究所已进行了纳豆激酶制剂的生产工艺中试研究，纳豆激酶制剂-恩开胶囊也已进入中试阶段，纳豆激酶的口服药剂也有多家投产上市，如草仙药业的净血酶纳豆胶囊、燕京啤酒公司的纳豆胶囊、天津宝恒生物的蛋白硒纳豆胶囊等34。参考文献：1 陈丽花, 陈有容. 功能性食品纳豆的研制J. 上海水产大学学报, 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