从患者开始谈基因检测的整个流程

.从患者开始谈基因检测的整个流程 题记：几颗玉米放进爆米花机器，出来便是爆米花；一个智力一般的高中生放到人大附中，三年后出来就是国际一流大学新生；二两五花肉和几个青椒交给一名厨师，出来的便是香喷喷的回锅肉。可是这中间都发生了啥？是什么重要步骤将初始原料打磨成了成品？10ml的血液或者一块肿瘤组织，最终变成了一份20页的检测报告？这是怎么实现的？中间都发生了什么？本文旨在回答这个问题。基因检测的整个流程可分为哪几个大的步骤？概况性地了解一个事务的框架是很有必要的，因为这样我们心里会有“底”。不管别人怎么分，我简单粗暴地把它分为四个程序：1，检测前咨询部分；2，实验室部分；3，信息分析部分；4，临床解读部分。五脏俱全的基因检测公司应该包含以上所有的四个程序，除非存在部分业务外包的情况，例如有的公司只做临床解读部分。1）检测前咨询部分：不是所有的癌症患者都应该检测，都值得检测，检测目的是为了明确是否可以使用靶向药物，还是仅仅为了玩，选择哪种产品更加适合，这些都是需要在这部分搞清楚。2）实验部分：应该取多少组织样本，测序过程中有哪些细节步骤，这可是个核心环节。3）信息分析：实验部分做完以后所得到的是一大堆序列，不分析就是一堆垃圾，信息部要做的就是从这些垃圾中挑选黄金。4）临床解读：黄金挑选出来不拿去换成大米然后进肚，那也没什么用，基因检测的结果有什么意义，对临床实践又何指导，全在这里了。四个程序，每个程序又包含哪些小工序呢？通过上面的介绍，我们可以大体了解基因检测分为四个程序，也明白四个程序主要做什么。可是，每一个程序又具体涉及哪些小程序呢？剖析程序的过程，就是知识差异化的过程。1，检测前咨询：患者预期、产品选择；2，实验部分：样本获取与运输、DNA制备与文库构建、质控与上机测序；3，信息分析部分：数据分析、报告初稿；4，临床解读部分：检测报告、临床实践、报告解读/人文关怀。总而言之，简单来说，从明确患者的检测目的开始（用药指导，耐药后寻找新的方案，仅检测一个基因或多个基因突变状态等），到选择合适的产品，然后获取规范的样本（血液，组织，唾液等），然后合适的运输方式到达实验室，然后一些列的规范实验室操作及数据分析，最后到科学的检测报告与咨询服务。这就是四个程序所包含的内容。每一个程序分为许多小工序，每一个小工序又有许多学问与讲究。下面将会详细介绍每一个小工序。程序一：检测前咨询部分1.1：患者预期。销售经理、产品经理、主治医生与患者需要充分沟通，明确该基因检测的目的，知道检测技术的局限性，做好患者的预期控制。1.2：产品选择。对于基因检测产品来说，产品选择几乎等同于检测基因的选择。哪些基因需要强行检测、哪些基因推荐检测、哪些基因有一定的检测价值，这些需要阐述清楚。最后，根据患者的经济情况与病情，综合选择（这是理想状况）。实际操作过程中，销售经理往往会以经济利益为导向。1.3：临床信息。患者的临床信息对于基因检测报告者有重要意义，信息掌握越全面报告越个性化，咨询解读也更有针对性。因此，完整详实的临床申请单需要提供。程序二：实验部分2.1：样本类型。需要明确一点，能够运用无创的尽量用无创（唾液与血液），因为没有一个患者希望无缘无故的在自己身上打洞。固体：手术样本，穿刺样本，石蜡包埋组织，石蜡切片组织；液体：全血，血清 血细胞，胸水，腹水，唾液。1）手术样本：（肿瘤组织50mg，癌旁正常组织25mg，收到组织后立即用至少5倍体积的10%中性福尔马林固定液固定），切片25张以上，厚度5 m，肿瘤细胞占比50%，坏死组织区域2）穿刺样本：穿刺一针以上，肿瘤细胞占比50%，坏死组织区域3）石蜡包埋组织：常温保存运输即可，最好是1年以内。4）石蜡切片组织：常温保存运输即可，最好是6周以内。5）全血：6ml-10ml for NGS (Streck管，含有保存液，负压真空抽满)，轻轻垂直平面90旋转10次，6-25（常温）运输，3（7）日内送达，可用干冰/制热剂制造维持环境温度。6）血浆 血细胞 （普通试管）：抽血后 2h 内将全血4 1600g离心 10min，分别收集上清和沉淀至离心管中；上清再 4C 16000g 离心 10min，收集上清血浆转移至 15mL 离心管中。血浆 血细胞样品，均封口膜封口，干冰运输。7）胸水：8）腹水：这两个情况比较少，至少我们公司很少遇到这样的样本。2.2：质控。血液样本是否合格，是否可以进行测序上机，样本质量怎么样？安捷伦2100生物分析仪或者4200 TapeStation核酸分析仪，通过DNA完整值（DIN）来数字化基因组DNA的完整性。如果不用这些仪器，可以通过跑胶来实现这一步。质控不合格，只有重新采样。标准流程只需要0.1-1g DNA，DNA的OD 260/280在1.8-2.0之间，RNA的RIN值8.0。实验中发现，只要RIN值大于7，就可以获得比较满意的结果。（RIN：RNA完整值）。总的来说，质控两个指标：1）足够的DNA量；2）完整的DNA基因组。这个步骤在构建文库后上机测序前完成。2.3：文库构建。简而言之，获取足够量的/目的的/前期适合上机测序而标准处理的DNA。其程序主要有：片段化，连接，扩增。1）片段化：我们总不能直接将那么长的DNA去测序吧，测序仪就只能一次测几百bp的DNA，超声波片段化等方法，获得DNA片段为正态分布200-500bp，通过一定方法（切割琼脂糖凝胶电泳条带）选择所需长度的DNA片段（150-200bp），其它的片段就扔了（不影响覆盖范围）。2）末端修补：上面的方法（物理方法）片段化的DNA，一般来说两端都被破坏了，不再是平平整整的了，而后续步骤需要在两端加测序接头，所以我们得先把这个破坏的两端修补好。修补所需三种酶：5端延伸的酶，5端连接的酶，3端延伸的酶。3）3端加A：片段化且两端修补好的DNA，3端加上一个碱基A，而下一步骤的连接接头3端有一个碱基T，这样就实现了碱基互补而连接起来了。这样做还有以下几个原因：提供连接效率；防止接头与DNA片段多种方向连接；减少接头之间的连接。值得一提的是1）2）3）的步骤可以用WGS Framentation Mix搞定。4）两端加接头：首先明确接头3端有一个突出的碱基T，插入片段3端有一个突出的碱基A；其次，这个工序是在插入片段两端加入东西；这个东西包括以下几个部分：测序接头（P5，P7；测序时用于与种植在Flow Cell上的序列碱基互补配对用），Barcode（用于标识该条DNA片段属于哪个样本，4个碱基），单分子编码序列（Index，用于识别是哪条DNA片段，12个随机碱基）；其中Y型的序列是已经商业化的试剂盒。5）PCR富集：如果样本不够，那么我们就需要扩增它才能上机测序，这就是该环节存在的必要。由于每个经4）处理的片段两端都有P5与P7，因此PCR引物只需设计与它们配对的就行了。如果样本足够，这一步就省了呗。6）文库定量：这里才应该是质控，也就是2.2的步骤。7）基因捕获：我们只将需要的DNA片段去测序，不需要的去测不是浪费钱吗？于是在测序之前，我们就用这个工序将目的DNA挑选出来（为什么要捕获）；目前目标序列捕获方法有3种，NimbleGesn Sequence Capture array，Agilent SureSelect DNA Capture Array，Agilent SureSelect Target Enrichment System，值得注意的是不同捕获方法可能测序仪器有不同的要求（捕获的方法有哪些；罗氏和安捷伦）；我们捕获的探针设计可以自己设计，初步设计，需要检测的位点提交到商业公司，真正的设计还是需要专业的商业公司来干（捕获探针的由来）；例如目标区域为100Kb，好的探针是100%覆盖这100Kb，而有的商业公司达不到，只能覆盖到97%，那么意味着有3%的区域捕获不到，更谈不上对这些区域测序了，所以覆盖率很重要；对于这100Kb的目标片段，前10Kb探针捕获了100个片段，第10Kb-20Kb的探针捕获了10个片段，那么这样的话就是均一性不好，最终可能会得出结论10Kb-20Kb这一段突变频率过高/过低，因此均一性很重要；如果一个探针设计出来想捕获目标片段，却捕获到了别的垃圾片段，我们还对它测序，这不是浪费钱吗？所以，探针特异性很重要。（好的捕获是怎么样的）。8）PCR扩增：PCR再次扩增捕获的DNA片段，上机前再一次加足样本量。9）文库再次定量：相当于上机前的再一次质量检测。2.4：上机测序。通过前面的步骤，我们从患者身上的一块肿瘤组织或者一管血开始，然后分离提纯我们需要的基因组DNA，再把这些DNA打成小片段，然后再在这些DNA小片段两头接上识别标记和测序接头，最后再通过基因捕获技术筛选出目的DNA，根据需求PCR扩增。通过这么多步骤，就是为上机测序做准备。一句话，上机测序的过程就是读取这些DNA小片段的序列，如ATCTGGCTT.(160bp)，这样万级、亿级的DNA片段个数。至于这些DNA片段是怎么样在机器上被测出来的，这又是个大问题，我在液体活检有哪些这篇文章有简要说明，这里不管它，毕竟世界上那么多事情，哪有想管就管得了的呢？至此，实验部分结束。程序三：信息分析部分3.1：下机数据识别。数以亿计的DNA小片段，一大饼，杂乱无章，很多情况是几十个患者的样本都一起的，更乱。一句话，这个步骤将属于不同患者的DNA小片段放进不同的盒子里，分类。这是怎么实现的呢？我们在构建文库的加接头步骤时，同时加上了Barcode序列，同一个患者使用同一个Barcode，不同的患者使用不同的Barcode，那么计算机通过这个Barcode轻松识别然后放进不同的盒子里。值得注意的是，DNA是两条链，有的公司会两条链同时测序以增加准确性，因此一个A患者会有两个盒子属于他（A1：正义链的DNA小片段集合；A2：反义链的DNA小片段集合）。还值得注意的是，如果样本是血液，有的公司会同时检测cfDNA和gDNA，那么一个B患者就会有四个盒子属于他（B1，B2，B3，B4）。3.2：图像转换。下机的时候那些DNA片段最初其实是图像格式的，例如红色表示碱基A，绿色表示碱基T，需要用专业工具将图像格式转换成序列。Illumina公司提供专业软件，只需对其调用就可以完成这一步骤。一句话：图像转换成序列。3.3：比对到基因图上。将这些上以亿级的DNA小片段归位，如果你是1号染色体的第500位到第650位之间的片段，就把你归到这个位置下面。当然，1号染色体上的这个位置下面一般不止一条DNA片段，毕竟有一个概念叫做测序深度，如果测序深度为10000，那么理论上该位置下面就应该有10000条DNA片段。怎么控制是10000条呢？这在上机之前构建文库时，通过调节PCR扩增来实现。一句话：将散乱的DNA小片段比对到参考基因组上，从而实现它们的定位。这个参考基因组是国际权威数据库给出的，供给全世界所有人使用。基因组：http:/hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/；比对软件BWA：http:/bio-bwa.sourceforge.net/；3.4：计算突变频率。假如1号染色体的500位到第650位有10000个DNA片段，那么测序深度就真的是10000吗？在这里需要做一个辨别，如果这10000条DNA片段有9000条是一模一样的，那么我们认为这是一条DNA片段PCR扩增出来的，这9000条只能算作1条，这时候有效测序深度为1001。在某个特定的位点，如果这1001条DNA片段有100条发生同样的与参考基因组不一样的变化，我们就认为该点的突变频率为10%。这10%的突变频率（血液肿瘤驱动基因突变为例）意味着：血液中的cfDNA有10%是ctDNA，从而反应患者的肿瘤病灶有一部分癌细胞发生了该突变，若有针对该位点的靶向药，那么可根据情况推荐使用。值得注意的是，如果有效测序深度只有100，那么就有可能漏掉一些典型的突变，所以有效测序深度足够是非常重要的。这里有一个问题：某个特定位点的变化，怎么样才算真正的突变呢？冷泉港实验室的VarScan软件来判定SNV和INDEL，顺便说一句要判定真正的突变很难，国际上有不同的看法。VarScan：http:/varscan.sourceforge.net/；3.5：1）原始数据过滤；2）数据比对BWA；3）比对文件处理；4）去除PCR重复dedup；5）mpileup文件生成samtools；6）体细胞SNV、Indel变异检测；7）体细胞Fusion检测；8）体细胞SNV、Indel变异注释annovar；9）突变质量检测。程序四：临床解读部分根据基因检测报告结果、患者意愿、医生意见综合判断，最终决定采取何种临床决策。例如：开始使用靶向治疗、继续使用化疗方案、参加某个特定的临床试验、更换化疗方案、维持治疗、家属进行基因检测等。.