资源描述
发 布击此处添加 点击此处添加中国标准文献分类号 华人民共和国认证认可行业标准 基因检测方法 验证 评价指南 on of MO 4790 （ 草案 ） 布 施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 目 次 前 言 .基因检测方法 验证 评价指南 . 范围 . 规范性引用文件 . 术语和定义 . 符号和缩略语 . 转基因检测方法 验证 评价 .录 A （资料性附录） 量对实际 影响 . 11 附录 B （资料性附录） 对 取方法的评价（抑制试验） .录 C （资料性附录） 中间浓度 阳 性 对照 的生产 .录 D （资料性附录） 基于实时 转基因含量平均值、标准偏差和相对可重复性标准偏差的评估 . 言 本标准是根据 准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写中的要求进行编写的。 本标准等同采用欧盟委员会联合研究中心组织编写的 4790 多个实 验室转基因分析方法 验证 的验证方法 （ of MO 。 本 标准 由国家认证认可监督管理委员会提出 并归口 。 本 标准 起草单位： 中华人民共和国 北京出入境检验检疫局 。 本 标准 主要起草人： 饶红、 韩玥、 郭铮蕾、徐姗、李伟 。 本标准系首次发布的认证认可行业标准。 转基因检测 方法 验证 评价 指南 1 范围 本标准规定了转基因 检测 实验室 方法 验证 评 价 的术语和定义、利用协同实验数据 和 /或实验室内部数据 进行 方法 验证 评价 的程序、方法、报告与表示。 本标准适用于 转基因检测 （如实时荧光 方法 验证 过程的评 价 、报告和表示。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 基因产品检测 通用要求和定义 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 方法 确认 of 认是 通过检查并提供客观证据，以证实某一特定预期用途的特定要求得到满 足。 (7025 方法验证 of 证是通过 提供客观证据，确认特定要求得到满足（ 000:2000 验证一个实验室能够充分按照标准要求进行操作需要实验室提供客观证据，证明对于所用的样品基质，能满足检测方法规定的性能指标。 通常，标准要求是 真实度 （ 一般用偏差形式表示 ） 和精确 度（一般为重复性和再现性），反映在测量不确定度中。客观证据是从 实验室实际数据中得到的真实 度和精确度。 可重复性标准偏差 可重复性（重现性）标准偏差是指在可重复性（重现性）条件下获得的测试结果的散布的分布状态的度量标准。相同地，“可重复性（重现性）变化”或“可重复性（重现性）变化系数”可以被定义或用于在可重复性（重现性）条件下获得的测试结果的散布情况的度量标准。 实验室样品 原始样品经过混合、缩分得到的一定数量样品。用于制备试样和存查样品 。 分析样品 验室通过研磨制备的样品，必要时进行混匀。 检测部分 于检测或分析的 样品 ，其一次用于分析物提取的整体的量。 检测结果 试结果是从 文中用到的） as in 从不同分析样品的不同检测部分得到的 本文中用到的 ) as in 用 对 工作溶液 续 定量 检测低 限 定量分析过程的低限是指被检测的样品在合适的精确度水平上能被检测出的最低含量或浓度，并且依据 727条款【 2】或【 3】，经过合作实验的满意证明或单一实验室的确认 。 实际定量检测低限 实际 定 /估计）目标种类基因拷贝数的情况下，能定量到的可信的（如 95%置信水平 ）最低相对目标 检测低限 定性方法的检测限是指被检测物能被可靠检出的最低浓度或含量 。 但是不必进行定量，并且已经经过合作实验的证明或单一实验室的确认。 实际 检测低限 实际 定 /估计） 目标种类基因拷贝数的情况下，能检测到的可信的（如 95%置信水平 ）最低相对目标 特异性 法只对特定特性或分析物有反应的特点。 动态范围 定量检测范围 of 合作实验室证明了分析过程内的浓度间隔具有适当水平的精确度和 真实 度。 真实度 量实验结果的平均值和 认可参考值的一致性。 注：真实度（可信度）的量度标准通常是以斜率来表示的。可信度也就是所提到的“平均值的正确度 ”。 精确度 规定条件下所获得的独立测试结果之间的一致性。 扩增效率 个循环达到 100%效率时，使理论斜率达到 率（ %）可用以下公式计算： 效率 =(10(率 ) 100 R2 2是判定系数，是通过线性回归分析得到的标准曲线的相关系数（测量的 平方计算出的。 稳健性 析方法的稳健性是指在通常的使用情况下，检测方 法不受微小、但有意的方法参数改变的影响，仍然能保持其测量可靠性的能力。 4 符号和 缩略语 下列符号和缩略语适用于本标准。 CR to a 脱氧核糖核酸 MO 洲 盟 因改造 基因生物 际标准化组织 际电工委员会 of 测限 of 量检测限 合酶链式反应 5 转基因检测方法 验证 评 价 取和纯化 质量的 管这个 标准 关注的是 是 为 个实验室确认的方法、标准方法（如 /或其它可利用的方法。 步骤： 对于已经确认的 次分 2份至少 2次（推荐 3次）进行 果可能 的话，不在同一天内进行，并且由不同的操作者操作。提取的 ，通过 控制 扩增效率和 用 实时荧光 否存在 抑制剂 ， 见附录 B）。适用于一种基质的 上步骤需要针对不同基质进行。对于一个 试的基质不能含有转基因成分。 度 步骤：提取的 验收标准：在验证过程中，当用于 取的 取的方法应该能产生出满足检测目的的 少达到所需的 如果 方法不能 从特定基质上提取 满足检测目的的 实际的 录A） 。 取物中不含抑制剂 步骤：每个 40L）。从这个工作溶液， 进行 一系列稀释，如 4个稀释点被用来进行实时荧光 个稀释至少 2个 从 4个稀释点得到标准曲线。 检测抑制剂的 ，特定分类基因参考系统）。工作溶液中总的日常检测中 用的 ， 。 验收标准：测量 该 < 测量 t)< 抑制剂曲线斜率在 抑制剂实验的例子见附录 B. 如果提取的 进行实时荧光 对 异性 特异性应该在方法确认时就已经研究过了。因此，在方法验证时不需要对特异性再进行研究。在对几种转基因成分共有的基因要素做方法筛选时，方法在进行应用后，应该在实验室内（如果不具备方法确认的数据）先进行和市场上新的转基 因物质交叉反应的检测。这也只有在具备新转基因成分的阳性对照样品时才能进行。 力范围、 数、扩增效率 步骤：动力范围、 真实 度和精确度时，从标准曲线可以自动得出。 应采用至少两条标准曲线的平均值 （见表 1）。 动力范围验收标准：动力范围必须覆盖预期使用的值。可以用转基因成分 %或 拷贝 数范围表示。 例： 标转基因浓度或当目标为 500拷贝时的 50和 2500基因组拷贝 扩增效率的验收标准：对定性和定量方法，标准曲线斜率的平均值在 相当于扩增效率在 90 实 度 步骤：真实 度应该接近规定值（如 值），或根据方法的预期使用需要，而且至少在接近 实 度的测量可以用标准参考物质（ 至少 2个浓度（如 1%），可能的话，用在动力范围之上的 第 3个 浓度（如 5%）。或者，用一个更高比例的标准参考物质制成参考样品（如 1%）。附录 检测条件（反应量、 该和日常检测一致。至少要得到 16个 测的设计实例见表 1、 图 2和图 3. 附录 关或不相关的转基因成分平均值、标准偏差和相对重复性标准偏差的计算方法。 如果没有标准参考物质进行真实 度的评估，可以用能力验证材料或能力 验证 的 。 验收标准：真实 度在可接受参考值的 25%内，或 2之间。 对可重复性标准偏差（ 步骤：重复性的评估和真实 度的 评估 方法相似。是在重复条件下通过 复性适用于所有转基因水平的测试。 检测条件（反应量、 该和日常检测一致。至少要得到 16个独立测量结果。检 测的设计实例见表 1、图 2和图 3. 附录 关或不相关的转基因成分标准偏差和相对重复性标准偏差的计算方法。 验收标准：相对重复性标准偏差应 25%，在方法的动力学范围之上。 量限（ 评估 可 以确定相对 %）和 /或绝对 拷贝 数）。 相对 骤： 阳性对照样品可以用目标转基因的 10次 0次平行进行分析。 5%。为了建立准确的 要用低浓度的转基因物质配制溶液。 绝对 骤： 1%的 已 知阳性对照样品的一系列稀释可以用 10次 80， 60，40， 20， 10， 5和 1）。 量的 5%。标准曲线应该覆盖 概率分布建议 1个拷贝应该给出大约 30%的阴性结果。因此，为了验证稀释系列的拷贝数大致正确，1个拷贝的稀释液至少一个平行结果得是阴性的。 10次 要标准曲线满足 效率的要求。其它的标准曲线只需要在每个点做 2个 验收标准：当 有确认数据时， 或 好于）那些数据。 测限（ 评估 可以确定相对 %）和 /或绝对 拷贝 数）。 相对 骤：一个低转基因浓度的阳性对照样品可以用 10次 果所有平行的结果都是阳性，这表示 绝对 骤：计算一个方法 95%置信水平的 要 每个 浓度进行 60个 于此方法并不实用，建议计算少量平行，如 10次平行的假阴性率。假阴性率要低于 5%（如， 10个 这个方法可以进行 假阴性率是指一个已知阳性样品被检测成阴性的可能性。当分析物的量接近方法的 会出现假阴性率的增加。选取稀释的系列，使其能代表基于对方法性能的认知的高于和低于预期 20、 10、 5和 1拷贝）。 10个平行都是阳性的最低浓度是 率分布建议 1个拷贝应该有大约 30%的阴性结果。因此，为了验证稀释 系列正确的拷贝数，至少 1个拷贝稀释的一个平行需要是阴性的。见表 1. 验收标准：当有确认数据时， 实际 出了本文的范围，因为 要取决于样品而不是 方法。但是应该对每个样品确定 健性 在对方法进行协作实验前，在方法开发或优化时就应该对稳健性进行研究， 因此，在验证研究中不用对稳健性再进行评估。 关样品 当有新的转基因产品出现在市场上时，实验室希望得到检测方法的通知。但是，在方法验证阶段通常只有有证 参考 物质。因此，通常使用有证 参考 物质 进行验证 。如果没有 有证 参考 物质，可以用其它的转基因阳性 样品 。也可以对日常样品 或添加参考物质的日常样品进行额外 检测。 表 法的验证设置实例 预实验确定 合适浓度 在 范围里至少测试 3 个目标浓度（取决于植物物种） 如， 300米 应大约 110000 内源性 基因拷贝， 应大约 37 拷贝。 数和扩增效率 例 1： 2 个标准曲线的最低要求 每个曲线用 5 个校准点，做 3 个 行（ 3） 所有斜率都应该在 间，所有 应该 2： 4 个标准曲线 每个曲线用 5 个校准点，做 2 个 行（ 2） 用 4 个斜率和 平均值进行 验证 。 例 3： 2 个校准曲线 每个曲线用 8 个点，做 5 个 行 （ 5） ，覆盖 最低浓度。用所有 上部分的斜率和 平均值 进行 验证 。 ，精确度， 少两个转基因水平（一个近似于标签阈值，一个近似于 荐将动力范围的上限作为第三个水平） 例 1：每个转基因水平做两个 取的平行，每个提取 /板做 2 个 行，4 个板得到 16 个测量结果，每个转基因水平得 到 8 个评估 *（图 2） 例 2：每个转基因水平做两个 取的平行，每个提取 /板做 4 个 行，2 个板得到 16 个测量结果，每个转基因水平的到 4 个评估 *（图 3） 为了评估中间精密度，由同一个实验员在两天里分别进行 验，如果可能，由两名实验员实验。 一个低浓度的 10 个 行（如 80、 60、 40、 20、 10、 5 和 1 个拷贝）。当拷贝数测量 的 于 25%并且标准曲线覆盖了这个点的一系列浓度中的最低浓度。 一个低浓度的 10个 20、 10、 5和 1个拷贝）。 *如果基于经验，实验室能够证 明两个经验丰富的操作者的平行和一个操作者的平行是一样的，就无需两个操作者 完成重复 了。 注意： 也可 同时评估表 1 中的参数。 注意：针对一次实验 ， 标准曲线和样品要在同一个板上。两次实验（如内 源 基因 和转基因实验）可以在两个不同板上进行，每个板使用相同的样品稀释液和同一个标准曲线。 图 2：精确度 /真实 度实验设计（例 1） 图 3：精确度 /真实 度实验设计（例 :2） 附 录 A （资料性附录） 量对实际 影响 如表 2所示，在 基因样品中， 目标分类单元特定序列 的拷贝数是目标转基因成分的 1000倍以上。这表示，对于 10个拷贝的绝对 要将 10000个 目标分类单元特定序列 的拷贝进行 实际 果绝对 0个拷贝，用 1000000个拷贝进行 么实际 见表 2）。应该对每个样品进行实际 表 量对实际 响的例子 因拷贝数 绝对 标转基因 复制数 ) 实际 %） 100,000 10 0,000 10 000 10 1 A B 附 录 B （资料性附录） 对 取方法的评价（抑制试验） 景 已知的抑制 扰 而影响目标 是，一个样品中抑制剂的最终的量取决于样品的性质。样品被加工的程度越深， 物 生 代谢物如多酚、脂类和能够与 可以通过子洗涤剂、乙醇、异丙醇和苯酚。 为了在 以采取不同的措施。这个附录说明了 率和 以及检测用于 抑制的作用基本上取决于抑制物的浓度。当 制物的效果通常会在 连续稀释样品的反应效率的评价和对不含抑制剂的未稀释样品的理论 界循环次数）和测量 可以 得到 果只有最高 浓度 是这会影响实际的 但是，在特定情况下连接在 样就会导致可以扩增的 骤 以通过用 目标分类单元特定序列 系统，每个 制运行）的连续 4倍稀释（ 1:4、 1:16、 1:64和 1:256）的 4个点分析 2个 达到 接下来的 关的水平的 做“未稀释”样品（工作稀释）。从这个浓度开始准备四倍稀释液（从 1:4到 1:256）。为了评估抑制剂的存在， 4个按系列稀释的样品的 用线性回归计算得到一个等式。从线性回归推算出的“未稀释”样品的 被接受的 三个条件：回归线的斜率在 定系数（ 于或高于 测量 于 每个稀释得出的两个 下图蓝色格的“工作稀释”反映了“未稀释样品”。 例 A：可接受 足所有标准 例 B： 制。 尽管 超过 限制 (尽管 接近这个值 )， 未稀释的样本和 1:4 稀释样品 发生了 延迟反应 (说明 量不佳 。 后者对斜率的 影响 表现为 斜 率 比可接受的 (坦 。 例如 C:制。这是另一 种 取 物质量低 的情况 。 连续稀释 的斜率在可接受范围内 ,然而 ,基于四点直线的 未稀释样本的 推断 应低于测量 (23)。 未稀释样本显示出上升的延迟，以至于不如后来的 1:4 稀释样本 明显 。 因此 ,当线性回归的斜率 落在 范围 明 混 合物 的提取物 抑制 增。 例 D:在这个例子中 ,回归直线的斜率 在 受 标准 之外 (- 然而 , 与 例子 B 相反 , 未稀释样本和第一 个梯度稀释 样本没有出现 迟 。 列显示后续 梯度稀释 样品的 测量 间的 区别。这些值总是大于 反应效率 100%时的 期望值 2。基本上 ,稀释列 表现的 好像 稀释 样品 中的 计算 的少。 因此 ,我们不希望把这 些 样本归为受 抑制 化合物 影响的样本 。然而 ,如果排除技术错误 (移液错误 ),也 没有其他 能明确识别 的 原因 , 不应该排除对附含目标 制剂可能性的推测 。 B C 附 录 C （资料性附录） 中间浓度 阳性 对照 的生产 一些参考 物质 只在一个或几个有限的 转基因 浓度 可用 。可能需要将 阳性 材料与非转基因材料 混合生产其他 转基因 浓度 ， 如确定相对 以通过测量 同一板子上同一标准曲线的阳性转基因和阴性转基因 的参考基因 来完成。 这两个 稀释因子可以使用以下公式计算 : X = (A/B)*(1 X =实际稀释系数 (转基因材料必须 被稀释 多少 以抵消 浓度 的差异 ) A =阳性转基因 参考基因拷贝 数 B =阴性 转基因 参考基因拷贝数 Y =理论稀释因子 ，如 从 10%转基因到 基因 =100x 例子： = 100% = 0% 的每个 L 参考基因校准曲线 上 量化未知样品 结果： A (来自 ): 10 拷贝 /5L B (来自 ): 8 拷贝 /5L 从 100%转基因生产 10%转基因 相当于 10倍稀释 (理论上 Y=10)。 X 必须像 Y 一 样 用 于 计 算 混 合 的 体 积 。 如果 X=那么 实际稀释 因子 X ：(10/8)*(101=(10/8)*9) +1= 90/8 + 1 = = 所以 1L A 需要与 混合。 在将这两个 到一起后， 全 混合。 混合物的纯度可以通过 100%的混合物的标准曲线 ， 分别在 3天 以 3个平行 分析 3个样品 。 C D 附 录 D （资料性附录） 基于实时 转基因含量平均值、标准偏差和相对可重复性标准偏差的评估 大部分实验设计已经写明如何从 用两种方法计算出的平均值再通过两个步骤相加 。 下 面详述 从目标基因和参考基因拷贝数测量值 开始 的过程。通过 这些测试结果 , 计算 转 基因 含量的 估计 值 和标准偏差。大多数实验过程提供几个这样的 转基因含量和标准偏差 值 (例如 , 在相同或不同的板 子上 运行 )。需要和适当 时 ,这些 评估 可以 通过 标准方式 相加 ,例如通过转基因含量计算 算术平均 值 。 目标和参考基因拷贝数估计 转基因含量 估计 转基因 分比需要 用到 两个 实验 :一个试验是用来检测目标 转基因 X)， 另一种是用于确定内 源 参考基因 Y)。 转基因 分比的估计 通常 使用以下的 比率法： . (1) 都是随机 变 量 1。 1 一个随机变量可以被认为是一个 值 不固定值 的量 ，但可以根据概率分布取不同的值 (例如，可能是由测量不确定度决定的 )。 通常 使用大写字母 表示一个 随机变量 (即 ， ，使用 小字母 表示实际值 ， 即测量结果。 标准的做法是 将 目标和参考基因 一式两份或 一式三份等 来进行试验 。 这样将分别得到 2到 3个转基因目标 到 3个 参考基因 着需要根据这两组检测结果计算转基因百分比 的平均值。 然而 没有计算 随机变量 比率 的均值和方差 的 准确公式 ， 但存在近似 值。平均值， 用 独立随机变量 比率 的方差 接近于 (2) 和 (3) 其中 是目标转基因 是参考 这些近似 值 假设 之间 不 相关 。 标准偏差 用 表示。标准偏差组分中的相对可重复性标准偏差 后用标准偏差的分量计算 ； 以下示例给出了 算方法 。 所有这些计算可以 用 子 在这些例子中 ,我们使用 些例子对应表 1中给出的示例 并 详细演示 了 一个 板子所 需 的 计算 ， 然后描述 如何 计算几个 板子 结果的总和。 示例 1:两个 每个提取 的转基因 目标和参考基因都在四个 板子上通过 两个 行测试 这个设计 针对每个板子 提供了两种 转基因估计值 和标准偏差 ， 因此 总共有 8个转基因估计值( 8个标准差 (这 8个转基因估计值 和标准差 都得自 使用方程 (1)和 (2)计算 两个 测试结果 中目标基因拷贝数和参考基因拷贝数。如果 得到 所有 8个 转基因估计值 的平均值 ， 这个平均价值取决于 16个 目标基因的拷贝数和 16个参考基因的拷贝数 的 测试结果 ， 这当然也适用于组合标准差。 提取 1: 因此， 163977， x) = y) = 104227922。 将适当的值放入方程(2)得出一个平均值 使用方程 (3)和上述 值 开方 得到 标准差 提取 2： 这 里， 166498， x) = y) = 62518562。 将适当的值放入方程 (2)得出一个平均值 使用方程 (3)和上述 值 开方得到 标准差 结合板 子： 在四个不同的板 子重复 整个过程 ，除了 还得到 平均值 , 标准差 , 样本 转基因 的总体 平均值 可以通过 术平均 值 计算 。 使用 个提取的 平行 数 (在这个例子中 n = 2)，用 量 (这里 k = 8)， 整体平均 的标准差 ；在这个示例中分母的区间是 16 8 = 8。相对可重复性标准差 。 示例 2： 两个 为每个提取 的转基因 目标和参考基因都在 两 个 板子上通过 四 个 行测试 这个设计 针对每个板子 提供了两种 转基因估计值 和标准偏差 ， 因此 总共有 4个转基因估计值( 4个标准差 (这 4个转基因估计值 和标准差 都得自 使用方程 (1)和 (2)计算四 个测试结果 中目标基因拷贝数和参考基因拷贝数。如果 得到 所有 4个 转基因估计值 的平均值 ， 平均 值取决于 如上述示例 1中的 16个 目标基因的拷贝数和 16个参考基因的拷贝数 的 测试结果 ， 这当然也适用于组合标准差。 提取 1: 因此， x) =1433394， y) = 57700642。应用方程 (2)得出一个平均值 使用方程 (3)和上述值 开方 得到标准差 提取 2： 这里， 14187， 157308， x) = 747515， y) = 89272181。应用方程 (2)得出一个平均值 使用方程 (3)和上述值 开方 得到标准差 结合板 子： 在两个不同的板子重复整个过程，除了 还得到 平均值 样本转基因的总体平均值 可以通过 术平均值 计算 。使用 行 数 (在这个例子中 n = 4)，用 (这里 k = 4)， 整体平均的标准差 ；在这个示例中分母的区间是 16 4 = 12。相对可重复性标准差 。
展开阅读全文