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生物化学实验CQMU,双缩脲法测定血清蛋白质含量,张莹基础医学院生物化学与分子生物学教研室,蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。,目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法。化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。其他性质：荧光法。,掌握双缩脲法测定蛋白质的原理掌握分光光度计的使用掌握标准曲线的制作学习分光光度法测定的原理和方法,实验目的,实验原理,双缩脲反应（Biuretreaction）,两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的酰胺键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。,双缩脲法测定蛋白质的原理,蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样可以与碱性铜溶液中的Cu2+发生双缩脲反应而生成紫红色的Cu2+-蛋白质络合物。在一定范围内紫红色颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以用分光光度法测定样品中蛋白质的含量。,方法学评价,操作简便、迅速、受蛋白质性质的影响较小；灵敏度较差，需要样本含蛋白质120mg水平才能检测到；且特异性不高，除含-CONH-的化合物有此反应外，凡是含-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团的化合物也有此反应。,分光光度法的基本原理,分光光度法是利用物质具有对光的选择性吸收特征而建立起来的一种定量、定性分析方法。当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为Io，透射光强度为It。,透光率（Transmittance）T：透射光的强度It与入射光强度I0之比。,透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。,吸光度（Absorbance）A:透光率的负对数。,A愈大，溶液对光的吸收愈多。,Lambert-Beer定律吸收光谱法基本定律,描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度的关系。含义：一束单色光通过溶液时，光能被吸收的程度与溶液的浓度和液层厚度成正比。,AKCL,A为溶液对光的吸光度，反映了物质对光的吸收程度；K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度的条件下对入射光的吸光度。C为溶液浓度；L为溶液厚度；实验中溶液厚度不变，则AKC,分光光度法的基本应用,利用吸收光谱对物质进行定性分析利用吸收光谱对物质进行定量分析,原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测常用方法：比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不同。比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNAA260/A280=1.8纯度鉴定),利用吸收光谱对物质进行定性分析,原理：Lambert-Beer定律常用方法：标准曲线法配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。,利用吸收光谱对物质进行定量分析,标准曲线,标准曲线与样品的测定条件必须一致。,常用方法：标准曲线法标准管法：对个别样品进行测定，且A-C曲线线性良好直接比较测定结果。A标=K标c标b标A测=K测c测b测c测=A测/A标c标,分光光度计的使用,分光光度计设计的原理,分光光度计操作,打开电源开关，使仪器预热20分钟用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上打开样品室盖，按“0%T”键调透射比零盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A)将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。,实验步骤,取试管7支，按下表操作并记录：,混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波长540nm比色，读取各管光吸收值，并记录。,在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标，两管平均光吸收值为纵座标，绘制标准曲线。以测定管的光吸收值在标准曲线中查出该待测血清样本的蛋白质含量。计算待测血清样本中蛋白质的浓度（g/L）。,注意事项,本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须洁净、干燥，蛋白质标准液和血清取量必须准确。双缩脲试剂应该在最后同时加入各个试管，以保证各管反应同时进行。各管加好样后必须充分混匀。显色反应需要2030min才能完成，显色后放置4小时光吸收值稳定。注意分光光度计的正确使用。,思考题,为什么双缩脲法可以定量测定蛋白质的含量？绘制标准曲线时应该注意什么？为什么必须是直线，且横、纵轴不能有截距？,实验报告,由实验小组长统一提交时间：周五下午地点：A3-2302,实验开始！,
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