细胞凋亡分子机制及检测学习教案

会计学1第一页，共106页。 细胞发生代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化(binhu)，此即细胞死亡。细胞死亡包括坏死和凋亡两大类型。相比起细胞坏死，细胞凋亡是更常见的细胞死亡形式。 在20世纪70年代，科学家们发现了细胞凋亡，这一研究成果获得了2002年诺贝尔生理/医学奖。第1页/共105页第二页，共106页。第2页/共105页第三页，共106页。 细胞程序性死亡的概念是1956年提出的，PCD是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常(zhngchng)组成部分。 特征:即散在地、逐个地从正常(zhngchng)组织中死亡和消失,机体无炎症反应，而且对整个机体的发育是有利和必须的。 细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡则是一个形态学概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交互使用，具有同等意义。第3页/共105页第四页，共106页。凋亡概念的形成 1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞。这些细胞的溶酶体并未被破坏(phui)，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集,从其周围的组织中脱落并被吞噬,机体无炎症反应。 1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。第4页/共105页第五页，共106页。细胞凋亡的形态学及生物化学研究(ynji)阶段（1972-1987）1）利用光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究(ynji)。2）染色体DNA的降解：细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解。3）RNA/蛋白质大分子的合成。4）钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。 5）内源性核酸内切酶：细胞发生凋亡是需要这种核酸内切酶参与的。第5页/共105页第六页，共106页。细胞凋亡的分子生物学研究阶段1）细胞凋亡相关基因及其调控2）细胞凋亡的信号转导3）细胞凋亡各种分子相互作用及相互关系4) 细胞凋亡的临床应用基础研究阶段 细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够有利于疾病机制(jzh)的阐明，以及新疗法的探索及问世。 第6页/共105页第七页，共106页。第一节 概述(i sh)一、细胞凋亡概念(ginin)和特征第7页/共105页第八页，共106页。 细胞坏死（necrosis）是在各种致病因素（如缺氧、物理、化学和生物学因素）的剧烈刺激下的病理性死亡。其特点是: 引起死亡的因素剧烈，死亡迅速。表现为能量代谢下降膜通透性增加细胞水肿细胞器破裂，细胞溶解，DNA不断裂内含物释放引起炎症(ynzhng)反应。第8页/共105页第九页，共106页。 细胞凋亡:细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,结束其生命的生理性死亡，是受基因严格调控的细胞自杀现象。凋亡过程中，细胞骨架蛋白分解细胞和细胞器浓缩而不裂解染色体DNA断裂(dun li)和形成凋亡小体细胞内含物不外泄，不引起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。第9页/共105页第十页，共106页。第10页/共105页第十一页，共106页。第11页/共105页第十二页，共106页。或巨噬细胞吞噬，而不引起周或巨噬细胞吞噬，而不引起周围组织围组织(zzh)(zzh)的炎症反应。的炎症反应。第12页/共105页第十三页，共106页。胸腺细胞(xbo)正常(zhngchng)凋亡(dio wn)第13页/共105页第十四页，共106页。第14页/共105页第十五页，共106页。第15页/共105页第十六页，共106页。第16页/共105页第十七页，共106页。第17页/共105页第十八页，共106页。Ladder Pattern of Apoptotic Cells第18页/共105页第十九页，共106页。第19页/共105页第二十页，共106页。 未成熟B细胞（immature B cell）完成骨髓发育阶段后，进入血液循环。尽管它表达膜表面抗原受体，但不具备免疫活性。因此，在结合抗原后，细胞不被激活，而是通过凋亡被清除(qngch)。 只有经过不同阶段的过渡期，分化为成熟B细胞，才具有免疫活性。 过渡期B细胞的发育、成熟是受复杂的调控。一方面，细胞的生存机制促进未成熟B细胞的存活与发育，保证了B细胞成熟的顺利完成。另一方面，70%的细胞凋亡，消除潜在自身反应性B细胞，实现了对自身组织的免疫耐受。第20页/共105页第二十一页，共106页。 由HIV感染引起的艾滋病有一个重要特征是随着病情的发展，CD4T细胞数进行性减少，其主要原因是：1，HIV感染细胞后产生一些调控性基因产物，这些产物使未被感染细胞对CD95介导的凋亡高度敏感（即通过Fas-FasL应答而使未被感染的细胞凋亡）；2，被HIV感染的CD4T细胞大量复制子病毒，导致(dozh)细胞死亡，同时又使更多的细胞被感染。随感染时间的延长造成免疫系统进行性损伤和崩溃。 由此可见:HIV即可引起细胞凋亡也可引起细胞坏死.第21页/共105页第二十二页，共106页。第二节 细胞凋亡(dio wn)相关基因和蛋白质Caspase的含义表现在两个方面（）它们为半胱氨酸蛋白酶类，并且把半胱氨酸作为对底物裂解时的亲核基团(j tun)；（）它们为天冬氨酸蛋白酶类，切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。 第22页/共105页第二十三页，共106页。Asp 特异性半胱氨酸蛋白酶. caspase能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但不完全降解一种蛋白质。 是一类促进细胞(xbo)凋亡的蛋白水解酶，在诱导细胞(xbo)凋亡中起关键作用，成为细胞(xbo)凋亡的“中心处理器”，即各种细胞(xbo)凋亡信号通过传递最终激活胱冬酶，胱冬酶通过水解不同的蛋白质引起细胞(xbo)凋亡。第23页/共105页第二十四页，共106页。第24页/共105页第二十五页，共106页。 caspase 酶原(mi yun) 前结构域 + 大亚基 + 小亚基 大 异二聚体 小 大 大 异四聚体 活性形式 小 小第25页/共105页第二十六页，共106页。第26页/共105页第二十七页，共106页。 活化Caspase为四聚体，两个小亚基相邻排列，两个大亚基围绕在小亚基的周围；每一大小亚基形成一球状分子(fnz)，球状分子(fnz)的核心为个螺旋环绕的6个片层样结构。两个异二聚体以小亚基相连。每一活化Caspase分子(fnz)含有两个酶活性中心，这两个活性中心可能独立发挥作用。 第27页/共105页第二十八页，共106页。Crystal Structures of Human Caspases Structure of Caspase-7 with Inhibitor 第28页/共105页第二十九页，共106页。Caspase 作用： 是一类(y li)蛋白水解酶，可特异水解底物蛋白分子中天冬氨酸残基羧基侧的肽键，从而激活该蛋白质或改变蛋白质的活性，从而促进细胞凋亡。 N A-B-C-D-X C 不同的Caspase对ABCD种类要求不同。第29页/共105页第三十页，共106页。 Caspase是细胞凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信息传递途经最终激活caspase，caspase通过水解不同的蛋白质改变(gibin)细胞特性，引起细胞凋亡。其中caspase 3 的作用最重要。但并非所有的凋亡过程都有caspase 的参与。第30页/共105页第三十一页，共106页。第31页/共105页第三十二页，共106页。3 Caspase的底物(d w)1、细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白。2、与DNA损伤修复(xif)相关的蛋白质和酶，阻止DNA损伤的修复(xif)。 如：DNA依赖性蛋白激酶、DNA复制相关蛋白。3、激活DNA酶，促进DNA断裂。第32页/共105页第三十三页，共106页。第33页/共105页第三十四页，共106页。二、死亡受体及相关蛋白 是一类(y li)参与外源性细胞凋亡途经的蛋白质：* 死亡配体（细胞外）死亡受体（细胞膜）相关蛋白（中介蛋白，细胞内）激活caspase 诱导细胞凋亡第34页/共105页第三十五页，共106页。第35页/共105页第三十六页，共106页。Fasassociated protein withdeath domainTNF receptor-1associated death domain protein Apoptosis第36页/共105页第三十七页，共106页。第37页/共105页第三十八页，共106页。第38页/共105页第三十九页，共106页。caspase激活(j hu)的DNA酶（caspaseactivated deoxyribonuclease，CAD） ICAD（inhibitor of CAD） 第39页/共105页第四十页，共106页。第40页/共105页第四十一页，共106页。第41页/共105页第四十二页，共106页。 (2) TRADD（TNFR-1 相关死亡结构域蛋白） 从TNFR-1接受(jishu)死亡信号，然后传递给FADD. This protein can also interact with receptor FAS, and is involved in the Fas-induced cell death pathway 第42页/共105页第四十三页，共106页。第43页/共105页第四十四页，共106页。第44页/共105页第四十五页，共106页。三、凋亡蛋白酶激活(j hu)因子类（apoptosis protease activation factor, Apaf） 一类促进细胞(xbo)凋亡的蛋白因子，参与细胞(xbo)凋亡的线粒体信息传递途经。 细胞(xbo)凋亡与线粒体膜电位及通透性改变有关。凡是诱导细胞(xbo)凋亡的因素，都可使线粒体的膜电位下降，膜通透性增加，线粒体膜通透性转运孔（MPT）开放，释放出多种可激活caspase的蛋白因子，包括细胞(xbo)色素c(Cytc)，凋亡诱导因子(AIF)。 第45页/共105页第四十六页，共106页。第46页/共105页第四十七页，共106页。第47页/共105页第四十八页，共106页。第48页/共105页第四十九页，共106页。第49页/共105页第五十页，共106页。第50页/共105页第五十一页，共106页。 凋亡(dio wn)诱导因子是一类存在于线粒体内外膜间隙的保守的黄素蛋白，具有双重功能。在细胞正常的生理状态下，AIF作为线粒体氧化还原酶，能催化细胞色素c（Cyt-c）和NAD之间的电子传递，当细胞受到凋亡(dio wn)的刺激时，线粒体膜通透性改变，AIF从线粒体转位到核内，与线粒体蛋白质endonuclease G (Endo G)一起引起细胞染色体的凝聚和DNA大的片段化。第51页/共105页第五十二页，共106页。apoptosis-inducing factor 第52页/共105页第五十三页，共106页。第53页/共105页第五十四页，共106页。四、Bcl-2家族(jiz) Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），并且通常有一个羧端跨膜结构域(transmembrane region ,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的结构域。根据(gnj)功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类，一类是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一类是促进凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid、Bad。第54页/共105页第五十五页，共106页。第55页/共105页第五十六页，共106页。第56页/共105页第五十七页，共106页。第57页/共105页第五十八页，共106页。第58页/共105页第五十九页，共106页。 虽然Bcl-2蛋白存在(cnzi)于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，但主要定位于线粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道 ，或者开启线粒体的PT孔，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活caspase，导致细胞凋亡。第59页/共105页第六十页，共106页。第60页/共105页第六十一页，共106页。bcl-2 二聚体抑制凋亡，促进细胞(xbo)增殖bax 二聚体促进(cjn)凋亡p53 促进 bax 蛋白(dnbi)的合成第61页/共105页第六十二页，共106页。第三节 细胞凋亡(dio wn)通路第62页/共105页第六十三页，共106页。目前发现细胞凋亡(dio wn)有3条通路：死亡受体通路线粒体通路内质网通路第三节 细胞(xbo)凋亡通路第63页/共105页第六十四页，共106页。一、细胞凋亡的三条(sn tio)通路第64页/共105页第六十五页，共106页。Fasassociated protein withdeath domainTNF receptor-1associated death domain protein Apoptosis第65页/共105页第六十六页，共106页。第66页/共105页第六十七页，共106页。第67页/共105页第六十八页，共106页。第68页/共105页第六十九页，共106页。第69页/共105页第七十页，共106页。第70页/共105页第七十一页，共106页。第71页/共105页第七十二页，共106页。第72页/共105页第七十三页，共106页。第73页/共105页第七十四页，共106页。第74页/共105页第七十五页，共106页。积累，影响细胞凋亡。积累，影响细胞凋亡。第75页/共105页第七十六页，共106页。第四节 细胞(xbo)凋亡的检测一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割(fng)成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。第76页/共105页第七十七页，共106页。（放线菌素D） 第77页/共105页第七十八页，共106页。姬姆萨染色（肝组织）。A：对照组；B：处理组，凋亡细胞核染色质致密分布(fnb)于核膜下。AB第78页/共105页第七十九页，共106页。图1光学显微镜所见：箭头所示细胞膜皱缩，细胞核裂解成大小不一的核片段。瑞氏染色400图2透射电子显微镜所见：箭头所示大量(dling)凋亡小体形成，其内可见致密染色质和完整细胞器。透射电子显微镜8000第79页/共105页第八十页，共106页。2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜(一种高级的荧光显微镜 ) 一般以细胞核染色质形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩(nn su)状态；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。第80页/共105页第八十一页，共106页。第81页/共105页第八十二页，共106页。3、透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；a期细胞核 的 染 色 质 高 度 凝 聚(nngj)、边缘化；b期细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 第82页/共105页第八十三页，共106页。（人外周血白血病T细胞(xbo)）第83页/共105页第八十四页，共106页。二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白(dnbi)，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。第84页/共105页第八十五页，共106页。第85页/共105页第八十六页，共106页。Annexin V/PI双染色法 PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示(zhsh)并结合一种染料以检测细胞膜完整性的检测方法。 第86页/共105页第八十七页，共106页。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过(tu u)完整的细胞膜，但在凋亡中晚期细胞和死亡细胞，PI能够透过(tu u)细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及坏死细胞区分开来。第87页/共105页第八十八页，共106页。结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死(hui s)细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。 第88页/共105页第八十九页，共106页。第89页/共105页第九十页，共106页。第90页/共105页第九十一页，共106页。三、线粒体膜势能检测 线粒体跨膜电位的下降被认为是细胞(xbo)凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞(xbo)核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞(xbo)凋亡不可逆转。 JC-1染料在正常细胞(xbo)内聚集在线粒体内，形成多聚体，发红色荧光；而在凋亡细胞(xbo)内，由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。荧光显微镜或流式细胞(xbo)仪检测。 第91页/共105页第九十二页，共106页。 用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，在37，5%CO2培养(piyng)箱培养(piyng)46h，利用细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）进行检测，通过流式细胞仪分析。第92页/共105页第九十三页，共106页。四、DNA片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂(dun li), 形成50300kbp长的DNA大片段, 或180200bp整数倍的寡核苷酸片段。 大分子染色体DNA片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂(dun li)成为50300kbp长的DNA大片段。其不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术。第93页/共105页第九十四页，共106页。 180200bp整数倍的寡核苷酸片段在凝胶电泳(din yn)上表现为梯形电泳(din yn)图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶使DNA标记，然后进行电泳(din yn)和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。第94页/共105页第九十五页，共106页。第95页/共105页第九十六页，共106页。五、末端转移酶标记技术 -TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量(dling)的3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介 导 的 缺 口 末 端 标 记 法 （ t e r m i n a l - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，没有3-OH形成，很少能够被染色。第96页/共105页第九十七页，共106页。TUNEL技术检测BAK基因(jyn)过表达后癌细胞凋亡 第97页/共105页第九十八页，共106页。 TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整(wnzhng)的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。 第98页/共105页第九十九页，共106页。六、Caspase-3活性检测 Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物(d w)，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。第99页/共105页第一百页，共106页。1、Western blot 分析 分析Procaspase-3，活化(huhu)的Caspase-3及其对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。第100页/共105页第一百零一页，共106页。第101页/共105页第一百零二页，共106页。2、荧光分光光度计分析原 理 ： 活 化 的 C a s p a s e - 3 能 够 特 异 切 割D(Asp)1E(Glu)2V(Val)3D4-X底物，水解(shuji)D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解(shuji)后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。第102页/共105页第一百零三页，共106页。第103页/共105页第一百零四页，共106页。七、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。1、将凋亡细胞裂解后高速离心(lxn)，其上清液中含 有核小体2、在微定量板上吸附抗组蛋白抗体3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合4、加辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合5、加酶的底物，测光吸收。第104页/共105页第一百零五页，共106页。NoImage内容(nirng)总结会计学。凋亡小体很快被周围邻近(ln jn)间质细胞或巨噬细胞吞噬，而不引起周围组织的炎症反应。核酸内切酶在核小体连接处将DNA链切断，从而最终产生寡聚核小体。1、光学显微镜和倒置显微镜。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合。5、加酶的底物，测光吸收第一百零六页，共106页。