临床诊断方法的筛选及新治疗手段的研究

犬细小病毒病临床诊断方法的筛选及新治疗手段的研究作者姓名：程雪梅指导教师：柴春彦学科（专业）：兽医论文提交日期：2008.5.20学号：1061502019关键词：犬细小病毒病，聚合酶链式反应，诊断，治疗申请学位级别：硕士犬细小病毒病临床诊断方法的筛选及新治疗手段的研究摘要对上海市犬细小病毒病进行了发病率调查，同时进行了治疗手 段的调查。设计了聚合酶链式反应，免疫胶体金试纸条，酶联免疫吸 附试验，血凝试验四种方法诊断犬细小病毒病。并采用单克隆抗体、 干扰素、单克隆抗体干扰素相结合等综合治疗措施对该病进行了分组 治疗。目的是筛选出当前最佳实验室诊断方法，并选择最适合的治疗 措施。结果表明，春季犬细小病毒病在上海市的发病率高，占门诊比 例的19.2%以上，应用PCR诊断诊断犬细小病毒病的准确率达95.7%，而且成本低，敏感性，特异性强，完全可以应用于实验室和临床诊断 中。实验应用的综合治疗措施对犬细小病毒病早期的治愈率达84%，中期的治愈率达 45%，晚期的治愈率为 9%以上，是一种行之有效的 治疗措施。关键词：犬细小病毒病 聚合酶链式反应 诊断 治疗on Diag no sis and Treatme nt of Canine表1犬细小病毒在不同季节的发病情况548例病犬逐月发病情况月份 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12发病数 27 24 32 45 63 34 30 28 97 79 58 31百分率 % 4.9 4.3 5.8 8.7 11.4 6.2 5.4 5.1 17.7 14 . 4 10. 5 5.6图1年平均发展趋势0101520253035第一季度第三季度2001200220032004200520061. 2. 3传染源本病主要传染源为病犬，康复犬，以及无临床症状的带毒犬。病毒随病犬的粪便，尿液，呕吐物，唾液等排出体外，污染食物，器具等周围环境从而使犬感染。病犬在感染的第 34天，即可通过粪便向外界排毒，此时病毒呈单个散在，传染性也最强。710天后随着肠黏膜IgA的产生和随出血进入肠道的IgA等CPV特异抗体的增多，散在的病毒被凝集到一起，感染性降低，血凝性也大大降低甚至丧失。1. 2. 4易感动物本病主要以感染未经免疫的断奶仔犬为主，成年犬发生较少，且多呈良性经过。断乳前后的仔犬最易感染，多以同窝爆发为特征，幼犬（尤其是离乳1 . 53个月的仔犬）平均发病率65. 4%，有时高达100%。在养犬较集中的地方，常呈地方性流行。据统计488例病犬中，最小的为15日龄，最大的为5岁，其中，1月龄以内的7例，23月龄的65例，45月龄的254例，67月龄的71例，712月龄的44例，12月龄以上的 7例。雄性犬206 例，占45. 98%，雌性犬 242例，占54. 02%;警犭431例，占96. 2%，普通家犬 17例， 占 3. 8%。由此可见，本病不分品种，性别，年龄，均可发病，但以纯种警犭易感。年龄与易感性 也有一定的关系，其中以幼龄犬居多。-3-1. 2. 5传播途径本病主要由直接接触或间接接触病犬和污染物而感染，病毒主要由感染犬的粪便，尿液， 呕吐物，唾液中排出，并通过污染的食物，垫草，餐具和周围的环境而使易感犬受到感染。病毒经消化道进入机体，人工皮下，肌肉，或静脉接种也能引起发病。但特定菌丛犬症状较轻，有时仅见体温升高与血细胞减少，需要其它微生物协同作用，才会出现严重的临床症状。还本病的犬康复后，任长期带毒，可从粪尿中长期排毒，成为本病的重要隐性传染源。不经严格消毒的车辆，用具，甚至饲养和医疗人员的衣服，鞋子，器具等也可成为散播本病的媒介。1.2.6不同品种的发病情况 对343例细小病毒病犬的品种进行统计，博美、可卡、京巴的发病数居前3位，占发病 犬总数的60. 64%。各品种的发病情况见表2表2犬细小病毒病犬各品种的发病数品种发病数/只占全部病犬比例%博美 109 31.78可卡 54 15.74京巴 45 13.12黑背27 7.87苏格兰犬 24 7.00吉娃娃24 7.00西施21 6.12八哥10 2.92金毛猎犬10 2.92沙皮7 2.04其他12 3.05合计343 1001. 3发病机理病毒侵入后在感染的头两天，病毒在口咽部位复制，通过血流传播到其它器官，第35天出现病毒血症。虽然通常肠炎病症明显，但细小病毒病感染是全身性的。病毒是通过血流-4一而不是肠腔到达肠黏膜。 基于这个原因，血清抗体效价与保护极其相关， 被动获得的抗体在 足够能量时完全可以保护动物。肠道IgA对保护是非必需的。知道口服 CPV后45天，临床上才明显表现出肠道的症状。一般认为潜伏期为 3至7或8天，第3天首次排毒，常在明显的临床症状出现之前排毒。犬细小病毒病的病理变化主要取决于病毒对分离细胞所需要的必要条件。因此，病毒复制主要在肠，淋巴组织和骨髓。细胞也必须具有适当的病毒受体，因为并不是所有具备细胞增值的组织都受影响。加速细胞增值有利于病毒复制，加重病理变化和临床症状。因此，如果感染犬冠状病毒先于CPV，冠状病毒通过破坏更多的成熟绒毛上皮细胞来刺激肠腺胚上皮的增值，导致双重感染，比其它任何一种感染都严重。在肠道内，细小病毒的复制杀死了肠腺的胚上皮细胞，导致上皮脱落，绒毛变短，呕吐和服泻。淋巴坏死和骨髓增值细胞的破 坏导致淋巴细胞减少，严重者出现泛白细胞减少症。犬细小病毒病能很快产生棉衣，临床症状一出现即可检出细小病毒循环抗体，而在临床发病期间迅速达到高峰，能迅速产生免疫反映是疾病临床症状严重的一个关键因素。能限制病毒血症的程度和持续时间的动物，其症状就较缓和，康复的机会就较大。这可以解释为什么当灭活疫苗保护减弱时应能使犬不发病，对感染的记忆反映之快足以缩短病毒血症。如果犬在感染的急性阶段幸存下来，通常能迅速和完全地从肠炎病状康复，甚至在致命的病例， 都有肠再生的例证。仅仅是现在已很罕见的心肌炎病例可导致心肌损害的慢性进行性疾病。免疫是长期的和完全的，间隔两年再受到攻击应能抵抗感染。1. 4.临床症状：根据临床症状可分为两种：即肠炎型和心肌炎型。1. 4. 1肠炎型：肠炎型又称出血性肠炎，潜伏期 7 一 l4d，主要表现为急性出血性腹泻、呕吐、沉郁、白细胞显著减少等症状。患犬精神沉郁，食欲废绝，呕吐，体质迅速衰弱。不久，发生腹泻，呈喷射状排出，粪便呈黄色或灰黄色，随后粪便呈番茄汁样， 带有血液，发出难闻的腥臭味。体温升高到40 41 C，呈稽留热4。呼吸及心跳增数 （120 200次/min）。1. 4. 2心肌炎型：此型多见于46周龄的幼犬。发病的特征是临床症状未出现就突然死亡，或者是出现严重的呼吸困难之后死亡。病犬常突然病情加重，肌肉震颤，四肢末端和耳鼻发凉，可视黏膜苍白，病犬迅速衰竭，呼吸极度困难 （可持续2030 min），体温升高，心率加快（200次/ mi n- 1-1前言1. 1犬细小病毒病的特性该病病原体为CPV，属细小病毒科细小病毒属，是哺乳动物中最小、结构最简单的一类单链线状DNA病毒。病毒粒子直径 20nm,无囊膜，二十面体立体对称，呈圆形或六边形，其基因组大小约 5KB , CPV基因组有两个主要的开放阅读框架，3端编码结构蛋白，5端编码非结构蛋白1。CPV对外界理化因素的抵抗力非常强，这与病毒的化学组成和解构特点 密切相关。病毒无囊膜，不含脂质和糖类，结构坚实紧密，绝大多数病毒能耐受6 5C连续3 0分钟而不丧失其感染性，个别病毒能耐受更高的温度。在PH3.09.0，于56C病毒保持感染性6 0分钟，而在此条件之外，病毒感染性迅速降低。 低温长期存放的CPV其感染性不发生明显变化。CPV对乙醚、氯仿、醇类和去氧胆酸盐有抵抗性，无论感染性还是血凝性都不受影响。消毒剂可用于灭活CPV,最有效的是福尔马林、氨水和氧化剂等21. 2流行病学1.2.1犬细小病毒病的感染CPV是1978年美国 Appel3等从患肠炎的病犬中分离获得，主要引起犬的出血性肠炎和幼犬心肌炎，并使白细胞大量减少，幼犬的发病率和死亡率都很高。该病发现时间不长，但在欧、美等一些商业饲犬场，相继有流行和造成幼犬群损失的报道，除美国外，己相继在英国。德国和法国发现，当前己成为犬的一种重要传染病，我国亦有本病的爆发流行，并己分离获得多株病毒，研究报道日趋增多，并发现它在抗原性上与猫泛白细胞减少症病毒有密切关系2主要调查了上海地区5家宠物医院从2001年到2007年1500个腹泻有关病例。其中有 654例犬细小病毒病调查结果表明，春季犬细小病毒病在上海市的发病率高，占门诊比例的19.2%以上，该病死亡率达78%,且当前这些宠物医院对该病的治愈率达20%.1. 2. 2季节性本病一年四季均可发生，但在春季（36月）和秋季（911月）发病率较高，共统计了548例呕吐和服泻的病犬，当时疑为犬细小病毒性肠炎分别占全年发病总数的32.1%和42.6%。同时，在临床调查中还发现本病与犬瘟热有间隔爆发的流行特点。结果见表1:- 5-以上），心区听诊有明显的心内杂音，心电图显示多灶性期外收缩（即心肌损伤）。1. 4.3病理剖检：死亡犬极度脱水，消瘦，腹部蜷缩，眼球下陷，黏膜苍白。肠粘膜严重剥落，肠壁弥漫 性充血和出血，呈暗红色。肠淋巴结肿大、充血，肠内容物呈酱油色，具有恶臭味。幼龄死 犬表现为肺淡红及轻度水肿，气管及支气管内有多量泡沫样液体，肝淤血，水肿。心肌软化，颜色变淡，心内膜及心外膜上有出血点。1. 5鉴别诊断1. 5. 1犬细小病毒病：由CPV引起，CPV能在犬肾细胞和猫肾细胞（原代和传代上皮细胞）上生长，在4 C或25C 的条件下，能聚集恒河猴的红细胞，而不聚集其他动物的红细胞，这一生物特性可对CPV作出实验室鉴定提供条件。1. 5. 2犬瘟热：也出现呕吐、腹泻，但症状轻微，没有犬细小病毒病中的西红柿汤状暗红色的腥臭粪便。该病主要以双相热型、神经症状、后躯瘫痪、上呼吸道黏膜和眼结膜的脓性卡他、皮肤上的红色丘疹和硬足掌症为特征。1. 5. 3犬细菌性出血性肠炎：有食人腐败变质食物病史，尽管也发生呕吐、腹泻和脱水，但易与犬细小病毒病相区别。1. 5. 4犬传染性肝炎：以暂时性角膜浑浊，黄疸，囊壁水肿，肝肿大，表面呈花斑状为特征。呕吐、腹泻和脱水较轻，粪便呈黄色粥样，偶尔混有少量血液，且无犬细小病毒病粪便的腥臭味。1. 5. 5犬敌鼠钠盐或杀鼠迷中毒：以内、外出血为特征。外出血表现可视黏膜出血，注射针孔出血和阴道出血；内出血主要见于眼底出血，心包血肿，纵膈血肿及胸腔积血。虽然该病也出现呕吐、腹泻和血便，但症状轻微，粪便中无犬细小病毒病的特异性臭味，且有食人毒饵和毒鼠的病史。维生素KI为本病的特效解毒药，若配合催吐洗胃等治疗措施，初、中期病犬迅速获愈。1. 5. 6犬钩端螺旋体病：多发于夏季（79月），有明显黄疸、血尿，尿在暗视野显微镜下可检查出虫体。1.6实验室检查大细小病毒性肠炎有较明显的临床症状和病理变化，可据此做出初步诊断，但确诊必须依靠实验室诊断。常用的实验室诊断方法有病毒分离、HA/HI试验、电镜负染及 ELISA和PCR- 6-等。病毒分离法虽然较为敏感，但是耗费时间太长，因此一般用于新疫区，或为了对流行毒株进行研究比较7。1. 6.1血液学检查：正常犬血液白细胞数为（611） X 109/ L,犬细小病毒病患犬白细胞明显减少，小犬可降低到（0. 10. 2） X 109/L,多数在（0. 52）X 109/ L,由于其他原因引起的严重腹泻也会使白细胞减少，故此法只能作为辅助诊断。1.6. 2血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HI）:在诊断时，可根据病程决定选择血清学诊断方法。1） HA :取粪便样品和脏器样品处理后，用0. 5%猪红细胞悬液在 4C时按比例混合，充分 振荡后，结果判定的方法是以出现 50%的红细胞凝集为终点，HA效价以出现终点凝集的样品 最高稀释倍数表示。2） HI :将病犬血清、腹水或乳汁样品作I: 5稀释，灭活后连续稀释，分别加血凝素抗原和猪红细胞。判定方法是以完全不凝集为抑制终点，样品的HI效价以其出现终点抑制的样品最高稀释倍数表示。但 Annamaria Pratolli 等8通过比较接种 CPV2或CPV2b灭活苗幼犬的中和抗体反应得出以下结论：HI试验并不总能准确地评估携带有犬细小病毒病犬的真实免疫状况。进行HA试验可以取发病早期的病犬粪便，并用HI试验确定其特异性。发病后期由于肠粘膜分泌抗体，粪便样品血凝性下降或消失，但却经常出现HI作用。通过血凝试验还可以将CPV同FPV和MEV区别开9,101.6.3血清中和试验（SN）本试验在细胞培养物中进行，多采用稀释病毒一固定血清法。临床应用意义不大。1.6.4免疫扩散试验用0. 01 M、pH7 . 4的PBS配制1 %琼脂糖凝胶，制备平板，进行琼脂扩散试验，测定病 毒抗原和相应抗血清的反应，37C湿盒感作，2448 h，即可得出结果。此法简便、经济、特异，但敏感性不高。1.6.5酶联免疫吸附试验（ELISA）此法因其便利、快速、敏感、特异性强，便于自动化，能检测群体特异性抗体而备受人们的关注。1994年，Drane DP等建立了一种 CPVELISA，此法可在野外对犬粪便中的CPV抗原进行快速检测。现在，ELISA检测法在国外已广泛推广，并已有商品化试剂盒。-7-1.6. 5. 1间接ELISA :吴金石等11用蔗糖密度梯度离心和凝胶层吸纯化CPV作抗原，建立了检测CPV抗体的问接ELISA法。其特异性和稳定性良好，结果判定准确明显、 易于把握。1.6. 5. 2 抗原竞争 EL1SA :此法也称竞争性抑制 ELISA，主要用于测定小分子抗原，如CPV。Rimmelzwaan GF等12分别用间接ELISA、抗原竞争ELISA和HI试验对犬血清中的 CPV特异性抗体进行了检测比较，结果发现，两种ELISA的特异性和可操作性比 HI的都高。据报道国外有学者分别用抗原竞 争ELISA和HA试验对犬粪便中的 CPV进行了检测并对结果进行了比较。1.6. 5. 3 双抗体 ELISA :此法建立在单克隆抗体技术之上，对CPV的红血球凝集蛋白具有特异性。Mildbrand MM等(1984年)用双抗体ELISA检测了犬粪便样品中的 CPV。1.6. 5. 4 双抗体加心 ELISA(Das-EIISA):利用此原理已研制出犬CPV酶标诊断试剂盒 13,14，此试剂盒在30 min内即可用肉眼判定结果，具有简便、快捷、特异性高的优点。其方法是：取少许粪便溶于生理盐水中，取一滴悬浊液加到犬 CPV酶标诊断试剂盒，30 min出现明显的沉淀线，即判为阳性。RimmelzwaanGF12分别用DasElJSA和HA试验对犬粪便中的 CPV进行了检测比较，结果发现Das-ELISA的特异性和敏感性都比 HA的高，此后，他们又用Das-ELISA对犬粪便样品中 CPV、犬冠状病毒和轮状病毒抗原进行了检测。1.6. 5. 5 斑点 ElISA(Dot-ELISA):国内有学者应用 Dot-ELISA对CPv进行了快速检测，并发现 Dot ELISA的敏感性比常规ELISA的高很多。Banja-BK等15用Dot-ELISA检测了 171只犬的粪便样品，结果发现cPv和犬冠状病毒的阳性检出率分别是29 . 8%和6. 4%,同时他们发现 CPV病的发病率随犬年龄的增大而逐渐降低。1.6. 5. 6 复合物捕获阻断 ElJSA(Ctb-ELISA):此法可检测病毒抗原，Rimmelzwaan GF等16分别用Ctb ElJSA和间接ELISA检测了犬血清中CPV、犬冠状病毒和轮状病毒的抗体。1. 6.6乳胶凝集试验(LAT):LAT可用于检测CPV抗原和抗体，它是一种可在玻片上进行的试验方法，操作简便，结果容易判定，特别适用于现场检测之用，用它可检测到4ng/ml的CPV抗原。Subhashini-CR 17分别用LAT和PCR法检测了 556份CPV患犬粪便样品，结果发现，就样品的阳性检出率 而言，PCR比L更敏感。国外另有学者分别用LAT、HA、EIJSA对犬、猫及其他毛皮兽粪便样品-8一进行了检测，结果发现，ELISA的敏感性最高，HA和LAT的敏感性分别是 96%和9l % ;LAT、HA EIJSA三者的特异性分别是 92%、95%、93% 。167荧光抗体试验：此法用于检测病犬肠切片、心肌切片以及细胞培养物中CPV ,具有与ELISA相同的敏感性，但被检病料的来源有一定的局限性，用于死后检测。.Rypul K等18分别用间接荧光抗体试验(IFA)、LAT和PCR方法检测了 l8份CPV患犬的病料样品， 并对检出的CPV野型毒株上 的VPI/VP2基因片段进行了序列分析，结果发现，此毒株的系统发生具有高度的相似性。1.6.8病毒分离鉴定将病毒处理后接种犬肾原代细胞或猫、犬肾传代细胞系培养，分离病毒，观察细胞病变 及核内包涵体，以便确诊。Martinello F等19分别用EIISA、HA和病毒分离技术对115份狼粪样品便进行了检测，其中在4份样品中检测到了 CPV，并经电镜检查得到了证实，这是第一次确切的观察到了欧洲狼体内的CPV。1.6.9 PCR诊断技术PCR技术发明以来，因为其快速敏感的特性而倍受青睐，1993年Harasawa R20等人将PCR用于CPV的基因组检测.Mochizuki M21用PCR.病毒分离与HA/HI等方法检测粪便中 CPV 并比较结果，表明PCR方法与用MDCK细胞分离病毒的敏感性相同，比用CRFK细胞分离和HA试验敏感。随后人们为了提高PCR反应的敏感性或特异性，建立了套式PCR、降落PCR等改良的PCR方法22, 23。人们在将PCR方法用于检测粪便样品中病原时发现粪便 中存在的抑制物质使 PCR出现假阴性结果，为了灭活或除去这些物质，可以采用直接稀释 法、改换不同的耐热 DNA聚合酶、离子交换层析法和免疫磁珠吸附法等21 , 24, 25, 26PCR技术是美国PE-Cetus公司人类遗传研究室 Mullis27 ,28于1985年发明的一种 DNA体外扩 增技术，此技术可以在儿个小时内将极微量的目的基因DNA成百万倍地扩增放大，并能够特异性地扩增任何所需要的目的基因DNA片段。PCR技术开始时是手工操作，在不同温度的水浴中往复进行，1987年逐渐制成了自动操作的装置，现在已发展了适合多种不同用途 的仪器.1988年Saiki发现耐热DNA聚合酶29, PCR技术逐步进入应用阶段。我国的毛裕 民也于1988年开始耐热DNA酶的研究，同时我国多个实验室进入应用研究30 o PCR技术首先应用于人p 一珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断31。PCR商品试剂盒的出现使 PCR进一步自动化，因此应用更广泛，但是准备样品也是一个耗费人力的过 程，Jungkind32介绍了一种样品处理的试剂盒COBAS AmpliPrep，试剂盒能使核酸自动释放，用特异的探针捕获靶序列，核酸探针是通过生物素一抗生蛋白链据临床观察，对于呕吐的治疗，确诊为细小病毒肠炎早期的，不应盲目止吐，而应在其生理条件可以承受的范围内任其呕吐，因为呕吐是犬排毒的一种正常反应。若呕吐频繁并且较严重时，临床上用于止吐的药物有胃复安，吗叮啉，爱茂尔，维生素B6，氯丙嗪和阿托品等。临床实践得知，对胃肠呈空虚状态的犬呕吐，尤其是伴有出血性肠炎病征的呕吐，临床上宜选用促使胃肠活动静止下来的止吐药，如爱茂尔，氯丙嗪或阿托品。 这些药的单独应用或对顽固性呕吐的联合应 用，一般均可获得可靠的止吐效果。若选用胃复安或吗叮啉等胃动力性止吐药，不仅止吐效果不确实，而且其促进胃肠正向蠕动的药理效应往往致肠道出血加重。维生素B6在人医用于放射病和抗癌药引起的呕吐或妊娠呕吐的辅助治疗。其止吐作用认为是维生素B6能够促进氨基酸代谢，而氨基酸可刺激延脑催吐化学感受区引起呕吐，故可用于此病的止吐。与其它适宜的止吐药配合使用，效果更佳。腹泻：腹泻多在呕吐12天后发生。早期表现粪稀软，不久转变为稀水，并带淡粉红色。约在腹泻出现2 3天后，即发展为西红柿汁样的 暗红色的腥臭血便，并经常在临床检查肛门插入体温计后立即出现。对于腹泻的治疗应着重消除肠道炎症，减轻肠蠕动防止脱水。 在消除胃肠炎方面除应用抗犬细小病毒血清外，一般临床上应用氨苄青霉素，庆大霉素或卡那霉素，配合应用维生素C,以及早期应用适量的糖皮质激素，即可获得满意的疗效。临床用于腹泻的抗生素有氨基糖苷类，氯霉素类，四环素类和喹诺酮类，对革兰氏阴性杆菌具有抑制或杀灭作用，故在治疗单纯性腹泻是可选用的。但当腹泻发展为出血性时，则不宜选用，因为能引起红细胞生成受阻和血小板减少，加速便血症状而不利于止血。当腹泻伴有频繁呕吐症状时，不应选用对胃肠粘膜具有较强刺激的， 易引起空腹病犬恶心、呕吐反应的土霉素和四环素，否则将会减弱止吐药和止泻药的疗效， 促使病状恶化。喹诺酮类药虽疗效显着，但因口服给药会诱发呕吐，则不宜选用。所以，对 腹泻症状的治疗应选用氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素，卡那霉素或小诺霉素等。给药方法以肌肉注射或静脉注射较合理。临床证明，即使对于严重的肠道感染，在应用氨基苷类抗生素的同时，联合应用广谱半合成青霉素及短期应用糖皮质激素如地塞米松，可获得良好疗效。适时应用减缓肠蠕动的药物如阿托晶(一般用药12次)，腹泻症状即可得到有效控制。便血：血便表现为粪便呈较典型西红柿汁样、有特殊腥臭味，往往伴有体温突然升高，精神萎 顿和心跳呼吸加快等症状，表现为病情比较严重。治疗上，采取治疗腹泻和止血的方法。病初宜较大剂量应用止血敏或安络血，以加强血管壁的正常结构，加速血凝过程。随着病程发展和治疗中抗生素的持续应用，由于肠道壁受抑制，内源性维生素K合成减少或菌素结合在磁珠上的，靶序列一旦被磁珠捕获，即得到提纯。这一过程使常规的样品准备时 间减少了，现在 PCR技术甚至己经发展到使用机器人操作的水平。PCR技术的改良与发展必将极大地推动跨世纪的人类基因组计划研究的顺利进行和提前完成。根据应用目的不同出现了许多改良的 PCR技术，它们包括：联合PCR.套式PCR、免疫PCR、原位PCR、定量PCR 等。联合PCR (multi-PCR,mPCR)是在一个反应体系中加入多对引物对多个目的基因同时进 行扩增的试验方法。联合PCR能够捕获更多基因信息，使应用范围更加广泛，分析的基因更加复杂33;套式PCR (nested PCR)是用第一套引物扩增 15-30个循环，再用第一次扩增 DNA片段内设定的第二套引物扩增15-30个循环。此方法比常规 PCR方法吏为特异。套式PCR可用于更微量 DNA的检测。特别适应于环境样品中微生物检测和单拷贝基因的扩增 34;免疫PCR(immuno-PCR)是将抗原抗体反应与 PCR技术结合起来以检测微量抗原的技 术，比ELISA敏感105倍，因此免疫PCR具有非常广泛的应用前景35;原位PCR(in situ-PCR) 自1990年Haase36等人建立以来发展得很快速，它将PCR技术和原位杂交技术结合起来，既可以检测出低拷贝的 DNA或RNA，又可特异地确定其细胞来源和细胞内定位；定量PCR:由于PCR扩增在某一特定时期的产物呈指数增长，那么最终PCR产物与模板量直接相关。人们利用这一特点进行模板定量。此技术的出现使极少量的RNA定量成为可能，为基因表达的调控研究提供了很好的数据，也使一些与基因数量有关的疾病被人们所认识37。这些改进的PCR技术，大大提高了实际应用能力，促进了分子生物学技术的进一步发展。由于 CPV2、CPV2a和CPV2b三种抗原型之间的差异主要存在于基因组30874451之间8个点突变，本文所设计的引物位于20232470保守区，为 CPV2、CPV2a和CPV2b三种抗原型的通用引物。该引物从犬五联疫苗中只扩增出CPV特异性基因片断，没有扩增出犬瘟热病毒，犬腺病毒n型，犬副流感病毒的基因片断，说明该引物的特异性较强。将粪便上清液稀释1000倍以后仍然能扩增出 CPV特异性基因片段，说明该方法具有较高的敏 感性。在对临床病料检测时以粪便上清液作为模板，只需一步煮沸过程，省去了普通PCR反应时DNA提取的繁琐步骤，不仅节约了试剂，降低了检测成本，而且节省大量的时间， 从而使整个检测在 2. 5h以内完成，达到快速检测的目的。1.7治疗方面现有的治疗细小病毒的方法主要为对症治疗、特异性疗法及支持疗法。1.7.1对症治疗呕吐：呕吐是此病的主要症状，呕吐物可能是食物或无色粘液或混有少量粘液的清水。-11-停止，且因消化道出血又极易造成血浆中诸多凝血因子的丢失，故止血治疗中及时运用维生素K促进血浆凝血因子的合成，尤为必要。对出血症状持续较久的犬，配合应用氨甲苯酸 或止血环酸等纤维蛋白溶解药，会协同上述止血药的药效，加速凝血过程，达到止血目的。在治疗中，必须适量补充葡萄糖酸钙和维生素C,对于降低消化道粘膜毛细血管的通透性，提高止血药的疗效，促进消化道粘膜损伤的愈合，具有十分重要的作用。 脱水：脱水是呕吐、腹泻及便血发展的必然结果，也是病犬死亡的主要原因。其症状主要表现为眼窝凹陷、 鼻镜干燥、皮肤弹性减弱、全身衰弱等，多数病犬渴感明显。 治疗上，最有效的方法是静脉输液， 尽快补充丢失的水与电解质。临床上常用的体液补充剂有葡萄糖、左旋糖酐、生理盐水或复方盐水、氯化钾和 NaHC03等，治疗时应注意糖盐的输入比例，如病犬渴感明显，可将5%10%葡萄糖和复方盐水按2： 1比例静脉输入，输液量一般控制在50100ml/ kg。注意，静输的葡萄糖浓度不能过高，否则体液会向血中转移，造成水分自肾排出，加重脱水。经两次输液，若脱水症状仍未得到纠正，且病犬无饮欲，此时应选用10%的NaCl溶液以增加有限输液量中 NaCl的绝对含量，可提高细胞外液的晶体渗透压，扩充并维持有效循环血 量。此时，病犬脱水状态多可得到改善。同时应注意病犬钾的补充，由于病犬呕吐腹泻，可 导致犬体内钾的丢失， 而病犬通常食欲废绝，钾的摄入量也下降。 在一次大量补充无钾液体时，则易很快促进低血钾症的发生。具体应用时，在每500ml输入液中最多加入 10% KCl溶液10ml，不会引起不良反应。在纠正脱水状态的同时，应注意是否补充NaHC03。如病犬持续腹泻，可造成大量碱性消化液的丢失。机体丢失NaHC03过多，易引起代谢性酸中毒。如频繁呕吐则造成胃酸的大量丢失，引起代谢性碱中毒。 此外，低血钾也可促进碱中毒的发生，故对犬细小病毒性肠炎的治疗是否需用NaHC03，应对具体病例而定。最好根据犬呕吐和腹泻分别发生的时候，次数及呕吐物和大便的数量作出估计。实践证明，对患犬细小病毒性肠炎的大多数病例，在采用上述各种用药方法后便可好转，之后，输液中加入适当剂量的NaHC03，对促进病犬完全好转和食欲恢复具有非常有益的作用。在输液过程中， 一定要掌握好速度，输液速度与本病的康复有一定的关系。一般3月龄以内的犬 5070滴/分为宜，46月龄病犬以6090滴/分为宜，6月龄以上的病犬以100滴/分左右为 宜，对于体质虚弱的病犬，输液速度尤应注意，切忌过快。其它对症治疗：如呕吐可用胃复安注射液 0. 5mg/ kg，肌肉注射，每日3次，呕吐严重者可加大用量为了补充营养，适当增加葡萄糖的用量，每日5g/kg。必要时可静脉注射复方氨基酸注射液20ml/kg，适当增加一些能量合剂，以促进能量的转换及利用，以及促进蛋白质的合成。1.7.2特异性疗法对于病毒性疾病，最根本的是使用特异性抗体进行治疗，临床观察表明，CPV单克隆抗体，特异性好，抗体含量高，针对性强。临床应用效果显着，试验证明，在足量注射犬细小病毒 单克隆抗体8小时后，收集粪便电镜下观察，仅见有连片的病毒颗粒。而五联血清就其含 有的CPV效价而言，要比单克隆 CPV抗体低1 2个稀释度，因此效果稍差，如病犬有 其它病毒（如 CDV）混合感染时，使用五联血清则起到了抗多种病毒的效果。临床上抗体 的作用强调用药时机，CPV感染的早期，使用抗体治疗，效果尤为显着。因为抗体主要作用是产生体液免疫， 不能跟踪病毒进入细胞内将其结合，所以临床上主张早期应用。 而且随着治疗天数的增加，在单抗或五联血清使用一个疗程后，应配合应用干扰素，胸腺肽等细胞免疫促进剂，效果应更为理想。1.7.3支持疗法清理胃肠道：患犬细小病毒病的犬，清理胃肠道尤其重要，因肠道脱落物是细菌繁殖最佳场所，不及时清理，吸收入血，发生脱水性和中毒性休克。方法是用1: 5000洗必太溶液进行灌肠，用量视犬体大小而定。一般在20、30ml / k9。提起后驱，将（人）用导尿管（也可用输液管代替）缓缓送入直肠，最后通过直肠狭窄部，灌致病犬从口中呕出为佳，每次灌 完使犬排泄，直至再没粪便，血污或肠粘膜排出，若不能从口中呕出时，可将灌肠液从口中服30, 50ml（小大酌减）。若无洗必太亦可用0. 9%的生理盐水灌洗（需稍加温）。输液： 输液对于治疗本病至关重要，严重的腹泻，便血及呕吐很快导致病犬脱水，酸中毒乃至休克。输液量可根据脱水的程度来确定，轻度脱水为50ml / kg，中度脱水 70ml / kg,重度脱水互00ml / kg，临床可根据病犬心脏情况，以上三种程度脱水酌加或酌减1020ml / kg。液体以等渗为佳。处方：平衡液0. 5%葡萄糖氯化钠溶液或用0. 9%氯化钠溶液及5%葡萄糖溶液各占50%，并加入其它药品，如维生素C50100mg/kg ,维生素B1 50100ml/ kg,以及其它辅助药品缓慢静脉输入，每日2次。抗菌消炎：为了防止因机体抗病力降低，引起的继发性感染，在清理肠道后，可用吡哌酸（氟哌酸10mg/k9，每日3次，7d为一疗程；或用庆大霉素 5000U/kS内服，每日2次，25d为一疗程：在静脉输液时再加 入氨苄青霉素 4万单位/ kg，每日2次。或小诺霉素 34mg / kg，维生素 C0. 1mg / kg,地塞米松10mg / kg。同时，还可以肌注50 %普杀平 0 . 1ml / kg,或20 %氟哌酸0. 20 . 4ml /kg。止血：在清理胃肠道的基础上，可内服云南白药0. 1g/kg，每日2/u3次，连续应用-35d。也可选用止血敏 0. 52mi，肌肉或静脉注射，每日2次。或肌注安络血 1020mg。 抗休克： 病犬严重脱水时，四肢及各末端发凉，齿龈微血管再充盈时间延长时，即意味着 休克，此时补充血溶量和应用抗体休克药物为当务之急。可选用去甲肾上腺素0. 5mg，或复压敏5mg，或地塞米松 35mg / kg，静脉或肌肉注射。当脱水得到纠正，血溶量补足 以后，可选用扩血管药以改善微循环。如654 2，肌肉或静脉注射 1mg/kg，若不见好转，30min后再重复注射一次。抗酸中毒：患犬精神沉郁，口流粘液或发生休克时，容易导致酸中毒。一般应用5%碳酸氢钠注射液810ml/kg静脉输入，每日12次，以调节酸碱平衡，预防酸中毒。在纠正酸 中毒的基础上给予适当的多巴胺，对增强心肌收缩力，增强心脏排血量，升高血压，增加肾 小球的滤过率，对改善微循环，抗休克均有重要意义。护肝：为保护肝脏和预防心肌炎，可在糖盐水中加入ATP20mg,辅酶A100200mg,或肌苷200600mg 静注。输血：以病初、中期为输血最佳时机。但临诊多见已是中期或中后期了，病犬表现精神不振，喜卧，体温升高或处常温，食欲废绝，呕吐，粪便稀软带多量粘液和血（黑红色），病情较重时，排粪如水注，早蕃茄汁样，腥臭难闻，心跳加快，呼吸困难，此时采用输血疗法配 合大量补液、抗菌，止血治疗也可收到满意效果。当患犬体温下降至36摄氏度以下，机体高度衰竭，体表静脉塌陷，甚至无法进针，输血也难以逆转病程。（1）供血犬的选择两病都要相应的康复犬做供血犬，犬细小病毒病亦可用患犬的母犬供血。前者供血犬的血与受血犬的血必须相合（相合血），即供、受血犬一方的血清1滴在玻片上与另一方全血1滴搅拌后不产生血凝块。后者因有血缘关系，可不用做相合血试验。（2）采血方法 采血用消毒注射器先吸取抗凝剂（4%枸橼酸钠）1ml,然后从供血犬静脉采血9ml,1次采不够可重复多次采。采得的抗凝血立即注入盛有5 %葡萄糖盐水（约100200ml）瓶内，轻轻摇匀并加入12ml（510mg）地塞米松，以防发生过敏，即可供输血。一般是现用现采血，也可冰箱48摄 氏度存放24h,不会丧失其理化及生物学特性，仍可使用。（3）输血量和方法：一般每 kg体重输血2ml,输血量宜多不宜少，1次即可，严重病例可重输1次。本实验的目的在于对临床所见CPV进行正确诊断并提出合理、有效的治疗措施2材料与方法2. 1调查资料2007年8月至2008年1月，在宠物医院实习阶段，正值秋季犬细小病毒病高发时期， 参与诊治了 106条疑似腹泻与呕吐病犬，其中60条疑似为犬细小病毒病，为实验提供了依据。2. 2实验材料2. 2. 1实验动物2. 2. 1实验动物实习期间诊治的 60例呕吐和腹泻的疑似为犬细小病毒病的病犬2. 2. 2实验仪器2.2.2.1韩国SD CPV酶标试纸条STANDARD DIAGNOSTICS , INC , CAT. NO . : 80FK20 10 1, EXP : 2005 1204 组成：1试纸条+1微量塑料滴管，真空包装 *202. 2. 2. 2聚合酶链式反应 PCR（1）SepaGene核酸提取试剂盒（购自三光纯药株式会社）Taq DNA聚合酶、MgC12、dNTP、10X缓冲液（均购自南京天为生物科技有限公司）。（2）引物设计根据GenBank中已发表的CPV基因序列，采用多重序列分析软件进行核酸同源性分析，选 择基因保守序列作为 PCR扩增的靶序列。自行设计引物如下：PI: 5 一 TA CCATGGTACAGArCCAG 一 3P2 :5 一 C TCCTATATCACCAAAGTTA 一 3以上引物由上海生物工程公司合成，并在P,5端标记生物素，由此引物扩增出来的目的片断为226bp2.223酶联免疫吸附试验 ELISA3实验结果3.1不同诊断方法对犬细小病毒病的诊断结果（见表 3）表3不同诊断方法对犬细小病毒病的诊断结果诊断方法检出率准确率假阴性率假阳性率PCR 76.6 95.7 4.3 7.7ELISA 80 91.5 8.5 38.5胶体金试纸条 86.7 89.3 10.6 76.9血凝抑制试验 100 93.6 6.4 23由表3的诊断结果可知，PCR方法诊断犬细小病毒病准确率最高达95.7%，而检出率却最低，只有76.6% ; ELISA方法诊断犬细小病毒病准确率91.5%，而检出率为80%;胶体金试纸条诊断犬细小病毒病准确率达89.3%，而检出率达86.7% ;血凝抑制试验诊断犬细小病毒病准确率93.6%，而检出率却最高达100%。由此可见最佳诊断方法依次为PCR、血凝抑制试验、ELISA、胶体金试纸条。3.2实验犬血常规检查结果4。9/L） 中性1（娃娃）2（欢欢）3（沙沙）4（欢欢）5（咚咚）4. 576. 802. 651. 861. 62686052615926172119270124171000700000采集临床诊断为犬细小病毒病的病犬的末端血，作血项分析，结果见表 表4患犬细小病毒病犬血常规检测结果动物号白细胞数分类(101.62 X 10淋巴单核嗜酸嗜碱早期病犬白细胞数均有下降，但到晚期，白细胞数下降至9/L,说明犬细小病毒病实验诊断一项重要指标，主要表现在白细胞明显减少。-22-3. 3临床个案病例治疗结果3. 3. 1娃娃使用对其方法治疗 3天，在治疗期间，病犬精神仍就良好，对其进行粪检，发现便中的血丝是由于该病犬还患有有蛔虫， 进行趋虫后，体温逐渐恢复正常， 所有进院时病症完全 恢复正常。使用CPV细小病毒试纸条为其检测，检测结果为阴性。于是确诊该病犬治愈康 复出院。3. 3. 2沙沙使用对其方法治疗 3天，在治疗期间，病犬精神仍就良好，体温有所升高，鼻镜有清水鼻涕出现，并伴有轻微咳嗽，对其进行（ 10%NaHCO3 ）气雾治疗；2天后，所有病症完全 恢复正常。使用CPV细小病毒试纸条为其检测，检测结果为阴性。于是确诊该病犬治愈康 复出院。3. 3. 3欢欢使用对其方法治疗 3天，病情没有起色，伴有低热出现，有犬细小病毒病中期转入晚期， 脱水严重，食欲完全废绝，呕吐红色泡沫样稀薄液体，拉稀呈西红柿酱样，腥臭。采用输血 之后当晚高烧 40. 2摄氏度不退，凌晨死亡。3. 3. 4咚咚使用对其方法治疗 3天，病情没有起色，脱水严重，食欲完全废绝，呕吐黄色泡沫样稀 薄液体，拉稀呈西红柿酱样，腥臭。血管塌陷无法输液，主人要求给于安乐死。3.4患病幼犬临床病例整体治疗结果（见表 5） 表5患病幼犬临床病例整体治疗结果 犬名发病天数临床诊断阳性数血清学诊断阳性数治愈数 莎摩犬（白） 比雄犬（白） 金毛猎犬 迷你笃宾（黑） 英国可卡（棕） 西施（黑）2221148410123848123637122- 19-呕吐物为未消化的食物，精神良好，触摸肠道阴性，鼻镜干燥，皮肤弹性一般，根据临床症状，初步诊断为犬细小病毒病肠炎型，使用CPV细小病毒试纸条为其检测，检测结果为阳性。确诊为犬细小病毒病。治疗方案（住院治疗）： 0. 9%Nacl 50ML ，胃复安 0.8ML 5%GNS 50 ML,球蛋白1支 复方盐水 40ML , 654-2 0 . 5ML , DXM 0 . 5ML , ATP+COA 各 1/2 支 乳酸格林氏液10ml,头胞色污钠1g 5%0. 9%GNS 10ML , VB6 1ML , VC 1ML 止血敏1ML肌注 干扰素1支 止吐灵 单克隆抗体15ML肌注 口服双黄连 0. 5ML BID2. 4. 1.3沙沙（吉娃娃）2007年10月25 日,本市陈先生送来 1只病犬就诊，为3月龄雄性0. 5kg吉娃娃犬, 陈先生主诉：沙沙购回7天，从前天开始出现呕吐，昨日拉一天软便，有腥臭味，今晨出现倒地。检查：倒地无力，体温37.1 C，脉搏130次/分钟，呼吸 30次/分钟，大便呈淡黄色，有腥臭味，精神良好，鼻镜干燥，皮肤弹性好，用CPV细小病毒试纸条为其检测。检测呈弱阳性，即确诊为犬细小病毒病早期。治疗方案（住院治疗）： 5%0 . 9%GNS 10ML ，球蛋白半支 复方盐水 10ML , 654-2 0. 5ML , DXM 0 . 5ML 利巴韦林0. 5ML 胃复安0. 5ML肌注 单克隆抗体 2. 5ML肌注 转移因子 2. 5ML （3卩）BID肌注 口服双黄连 0. 5ML BID2. 4. 2犬细小病毒病晚期病例治疗 -24-4讨论4.1几种诊断犬细小病毒病的方法效果分析4.1.1 PCR技术诊断犬细小病毒病效果分析PCR技术具有操作简便、省时、灵敏、特异等优点。目前，PCR技术采用耐高温的Taq DNA聚合酶，并且在有计算机控制的DNA扩增仪中进行，使操作大为简化，一次加入的酶即可满足反应全过程。DNA扩增仪能自动迅速升降温度，只需把反应所需的全部材料混 匀，置入仪器内，反应便依所输入的正确程序进行；应用 Taq DNA聚合酶时，单核苷酸掺入速 率较高，75-80 C时，每个酶分子每秒钟可完成150个核苷酸的合成。PCR每一循环需数分钟，所以，一般常取用 20-30个循环能使目的 DNA达数百万倍扩增的反应只要1至2小时即可完成。在基因分离、突变体构建、DNA测序等方面，PCR方法均较之常规法快速得多；PCR产物的生成是以指数方式增加的，所以欲扩增pg量级的起始物到 ug水平或放大真核细胞单 拷贝基因，通过 PCR方法都是不难完成的。 PCR方法还可用单一双倍体细胞、一根头发、 甚至单一精子进行 DNA定型；作为引物的寡核苷酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否 特异的关键。Taq DNA聚合酶耐高温的性质使反应中引物与模板退火的步骤可以在较高的温度 下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的目的片段也能保持很高的正确程度；另外，5、对原始材料质量要求低。由于 PCR技术有较高的灵敏度和特异性，故仅含微量（ pg, ng）的 目的DNA的粗制品或者总 RNA，就可以用作反应起始材料来获取目的产物。部分降解的DNA材料也可以通过 PCR多次反应循环，最终得到所需的全长 DNA片段。在犬猫病毒性疾病预 防中，注射疫苗是一项重要的措施，并在疫病防治中发挥了很大的作用。但不利的是为利用血清学检测方法诊断疫病带来了困难。检测出的抗体很难区别是疫苗免疫还是感染病毒产生的。因此，病原学检测的重要性越来越受到人们的重视。多数PCR反应中，对模板的要求并不严格。首先，对纯度要求不严，前人有大量的实验数据表明存在一定量的蛋白质或其它物质，只要没有交叉污染，则对实验过程影响不大；其次，PCR反应中模板用量很低，理论上102-104拷贝的模板可满足各种要求的PCR反应。-25-因此，用PCR法作为检测工具，敏感性非常高，也正因为如此，PCR法容易出现假阳性问题。为了尽量避免假阳性的出现，从实验条件到操作上都要严格要求，例如，保持室内整洁卫生，空气流通，操作时配带次性手套，使用一次性加样枪枪头， 并对有关器材进行严格高压灭菌。 另外，在每次 PCR实验时，设立阴阳性对照，也是防止假阳性的重要措施。我们在检测未 知粪便样品时，有 5个样品HA法检为阴性，而 PCR法检测为阳性，为了防止PCR法的检测结果为假阳性，我们进行了重复检测，同时设立阴性对照，反应结果一致。4.1.2 ELISA技术诊断犬细小病毒病效果分析与HA法相比，ELISA的准确度为 91.5%, HA法的准确度为 93.6%。对于强阳性和明显 阴性的样品，两种检测方法的符合率为100%;而HA效价为1:40的10份弱阳性标本，经试剂盒检测 6份为阳性，4份为阴性，并且这些样品均为临床症状明显的晚期病例。分 析原因，有以下几种可能：（1） CPV主要存在于肠粘膜上皮细胞中，晚期病例肠粘膜大量脱 落之后，可能导致排毒量减少38;（2 ）发病后期，肠道中特异性IgA的分泌以及便血中特异性IgG的产生，CPV与其形成抗原抗体复合物随粪便排出，竞争性地干扰了酶标单抗的结合。4.1.3免疫胶体金技术诊断犬细小病毒病效果分析如表3所示，应用PCR方法和胶体金诊断试剂盒，PCR检测方法阳性率为 76.6% ,胶体金诊断试剂盒检测阳性率为 86.7%。胶体金诊断试剂盒的阳性检出率要高于PCR检测方法，但这并不能说明胶体金诊断试剂盒的敏感性高于PCR检测方法，临床治疗效果的追踪调查结果显示胶体金诊断试剂盒诊断为阳性的病例的治愈率高于PCR检测方法诊断为阳性的病例的治愈率，表明免疫胶体金试剂盒检测出的某些弱阳性的病例并不是犬细小病毒感染，而是普通的肠炎，PCR检测方法的准确性高于胶体金诊断试剂盒，胶体金诊断试剂盒存在假阳性的现 象。这种假阳性现象的产生可能由于粪便中所含有的复杂的成分有关（细菌、细胞碎片等），这些成分和免疫胶体金复合物或检测线上的抗体之间发生非特异性的结合，从而产生假阳性的信号；检测时间过长也会产生假阳性的信号；为了追求检测的灵敏度，必然加大检测抗体的用量，但是假阳性现象也会随之产生39。-26-4.1.4血凝抑制试验诊断犬细小病毒病效果分析由于肠炎型犬瘟热、犬冠状病毒、轮状病毒感染，以及某些细菌、寄生虫和急性胰腺炎 也常呈现肠炎综合症，所以临床诊断并不能确诊犬细小病毒病，确诊需要进行实验室诊断。 但是目前实验室诊断中 HA要求红细胞质量较高，需要新鲜的猪红细胞，也可以使用猫或恒河猴红细胞，但是这些红细胞都不容易获得，而且价格较为昂贵。 况且有报道显示有些毒株缺乏HA活性，给该病毒的 HA诊断带来了一定的困难40。HA方法主要的缺点是敏感性不高，可能由于感染犬的肠腔内的抗体吸附到病毒颗粒表面，使HA活性失活，阻止了病毒和细胞受体的结合，敏感性大大降低41相对于传统的方法来说，PCR检测方法具有敏感性高、特异性强，操作简便、快速等优点，在病毒感染的早期就能做出快速的检测，而且PCR检测方法所需要的试剂都很容易获得，不需要免疫