发酵工程知识点总结

第一章1发酵和发酵工程的概念发酵狭义：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动，来制备微生物菌体或其代谢产物的过程。广义：凡是培养细胞（动、植物和微生物细胞）来制得产品的过程。发酵工程研究发酵工业生产过程中，各个单元操作的工艺和设备的一门科学5、分批发酵，分批补料发酵分批发酵（batch-process）:在生物反应器内投入限量培养基后，接入微生物菌种进行培养， 完成一个生长周期，获得产品的微生物培养方法。是目前传统发酵工业所采用的主要发酵形式。在分批补料发酵：发酵的开始投入一定量的培养基，在发酵过程的适当时期，开始连续补加碳或（和）氮源或（和）其他必需基质，直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后， 将发酵液一次放出，这种操作方式称为补料分批发酵。这种发酵方式能保持较高的活菌体浓度，目前，基因工程菌发酵常采用此方法3、诱变育种和分子育种的定义。诱变育种的含义应用微生物遗传和变异理论，用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用分子育种的含义分子育种（分子克隆、基因工程）是分子水平上的育种方法。根据需要，用人工的方法取 得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移到受体细胞使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传形状。3、初级代谢产物和次级代谢产物的定义。1初级代谢产物的定义：微生物代谢产生的，并且是微生物生长与繁殖所必需的代谢产物 初级代谢产物种类：有机酸、氨基酸、核苷酸、蛋白质（包括酶）、多糖、核酸等2次级代谢产物的定义：微生物代谢产生的，与微生物生长与繁殖无明确关系的代谢产物； 种类包括：抗生素、激素、毒素、色素、信息素、生物碱等。2、发酵工程研究的内容发酵工业用生产菌种的选育：自然选育诱变育种基因工程育种发酵条件的优化与控制生物反应器的设计发酵产物的分离、提取和精制3、发酵类型1按发酵产品的类型划分2按发酵工艺是否需氧划分厌氧发酵：如酒类发酵、酒精发酵、丙酮丁醇发酵、乳酸发酵和甲烷发酵通风发酵：如酵母菌生产、抗生素发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵和酶制剂生产等3按发酵工艺培养基的状态划分固态发酵：主要应用于传统酿造业。液态发酵：，是目前发酵工业所采用的主要工艺。4、发酵工艺培养方法发酵工艺培养方法有：固态发酵工艺和液态发酵工艺1固态发酵工艺 固态薄层发酵固态厚层（通风）发酵2液态发酵工艺液态表面发酵（浅盘发酵）工艺液态深层通风发酵（Submerged fermentation）液态深层通风发酵是指在无菌条件下，在 液体培养基内部进行微生物培养，获得产品的过程。它包括向发酵罐中通入大量无菌空气、 搅拌使空气均匀、培养基灭菌和无菌接种。液态深层通风发酵是发酵工业使用的主要工艺。第二三章二、微生物的生长和繁殖的条件1、营养物质：水、C源、N源、生长因子，矿质元素。2、 pH值：通常细菌、放线菌在中性；酵母、霉菌在偏酸性条件下生长3、 温度：通常细菌最适生长条件为370C;放线菌、酵母、霉菌在 280C生长4、 湿度：5、气体：CO2、O2等 3、微生物纯培养生长曲线及在发酵工业中的应用A、迟缓期（适应期）特点：生长速率等于零细胞合成新的成分适应新的培养基或别的培养条件细胞形态变大或变长对外界不良环境敏感实际意义：种龄：1对数期“种子”，迟缓期较短；2迟缓期或衰亡期“种子”，迟缓期较长接种量：1接种量大，迟缓期较短；2接种量小，迟缓期较长；培养基成分:1培养基成分丰富的，迟缓期较短培养基2成分与种子培养基一致，迟缓期较短B、对数生长期影响因素：营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量营养成分：营养越丰富，代时越短增殖噬菌体的最适宿主菌龄因工程菌发酵要尽量延长对数期菌种：不同菌种的代时差异极大 培养温度：影响微生物的生长速率 对数期的实践意义代谢、生理研究的良好材料发酵生产中用作“种子”的最佳种龄C、稳定期特点：细胞生长速率为零； 活细胞总数维持不变，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，菌体总数达到最高点。细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化，细胞成分合成缓慢，G+染色发生变化稳定期的实践意义发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期导致了连续培养原理的提出和工艺技术的改故又某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段,称作代谢产物合成期；D、衰退期特点：细胞以指数速率死亡，有时细胞死亡速率降低是由于抗性细胞的积累；细胞变形退化，有的发生自溶，G+染色发生变化。影响衰亡期的因素及实践意义菌种的遗传特性有关：有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡，有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞；营养物质和有毒物质有关： 补充营养和能源以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间5、微生物合成次级代谢产物的基本特征。A、次级代谢产物具有种属特异性B次级代谢产物在菌体稳定期合成C、次级代谢产物不少是结构相似的混合物D、次级代谢产物合成受多基因调控6、提高次级代谢产物产量的方法。A、 补加前体类似物 如青霉素生产补加苯乙酸能增加青霉素G;加苯氧乙酸得到青霉素 K。B、 加入诱导物如加蛋氨酸能增加头孢霉素 C的产生；加巴比妥可提高利福霉素产量C、 防止碳分解产物的阻遏或抑制：如限量流加法发酵D、 防止氮分解产物的阻遏或抑制如限量氮源E、选育耐前体物质的突变株、耐抗生素的突变株、毒性的突变株、营养突变株第四章菌种选育1、微生物纯种分离方法有哪些？1、固体稀释平皿倾注法（混菌法）最常用的微生物纯种分离方法2、涂布分离法3、平板划线分离法4、单细胞挑取法5、组织分离法6、利用选择培养基分离法7、其他方法 2、从自然界中分离和筛选微生物菌种的步骤1定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。2采样：有针对性地采集样品。3增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。4分离：利用分离技术得到纯种。5发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。微生物菌种的分离和筛选实例从自然界中分离产？-淀粉酶枯草芽胞杆菌1、确定采样地点：2、处理样品：3、增殖培养：4、选择培养基分离：5、 挑选单菌落于斜面试管，280C培养；6、摇瓶培养：280C,23天，取出，过滤；7、测定菌株的？-淀粉酶活性6、菌种衰退的含义及菌种复壮的方法。菌种的衰退：生产菌株几乎都是人工诱变变异株，都是代谢调控失控菌株，遗传特性很不稳定，极易发生自然变异。因此，在使用和保藏过程中，生产菌株会逐渐向不利于生产方向发生变化，这种变化称为菌种的衰退方法 A、纯种分离：选取典型性状的单菌落B、淘汰衰退个体C选择合适的培养条件4、原生质体融合定义及主要步骤定义用脱壁酶（细菌和放线菌用溶菌酶，酵母和霉菌用蜗牛酶和钎维素酶）去除微生物的 细胞壁，制成原生质体，用聚乙二醇促进原生质体融合，从而获得异核体的这一技术叫原生质体融合。步骤 标记菌株的筛选：营养缺陷型和抗药性标记 原生质体的制备：脱壁酶脱壁 原生质体的融合：聚乙二醇促进融合 原生质体的再生：再生培养基培养再生壁 融合子的选择：选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 生产性能筛选。第五、六章培养基、灭菌1、葡萄糖（转化）值（DE）;DE值：表示淀粉糖的葡萄糖组成，是指糖化液中的还原糖（以葡萄糖计）的含量占干物质 的百分率。DE值=还原糖（葡萄糖）含量（）/干物质含量（） X 100%6、培养基分批（间歇）灭菌概念及过程； 概念：将配制好的培养基输入发酵罐内，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后， 维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度。分为升温、保温和冷却三个阶段1、种子的扩大培养概述及一般过程菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称为种子制备。将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁（茄子）瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。3、发酵培养基筛选原则；总体原则：根据微生物化学组成成分以及微生物生长和繁殖条件所需营养物质（水、C源、N源、生长因子以及pH值、温度、湿度、气体等）首 先确定培养基 C/N比，再用正交试 验确定原材料 的浓度的配比。具体做到：1）必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。2）有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。3）有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。4）有利于提高产物合成速度，缩短发酵周期。5）尽量减少副产物形成，便于产物的分离纯化。6）原料价格低廉，质量稳定，取材容易。7）所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。8）有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。2、淀粉水解糖的生产工艺；生产工艺有酸法、酶法、酸酶法三种 酸水解1200C以上盐酸或草酸淀粉乳高温液化酸水解其中盐酸的水解淀粉能力高，但酸法水解缺乏专一性，A淀粉酶液化B糖化酶糖化淀粉 90950C 寡糖 55600C 葡萄糖具有高度的专一性，副产物少，纯度高，糖色浅，与酸法相比，可以转化较高浓度的固 形物，提高效率，减少损耗，降低成本，所得母液还可以利用，而且在常温常压下进行， 设备工艺都比较简单。酸酶法投料浓度，淀粉乳淀粉含量在 34%40%（ 1820Bx）为酸法的两倍，节省费用，缩短 时间，DE值（糖化率）可达 96%，纯度高，糖液色浅，容易结晶析出，用酸量少，仅为酸 法的20%，产品质量高。（注：有先酸后酶法和先酶后酸法两种）7、发酵工业常用空气除菌的方法。1、加热灭菌：用蒸汽、电能、空气压缩过程中产生的热量进行灭菌。2、 静电除菌其原理是含有灰尘和微生物的空气通过高压直流电场，气体产生电离，产生的离 子使灰尘和微生物等成为载电体 ，载电体被捕集于电极上，达到除菌的目的。吸附于电极上的颗粒、油滴、水滴等须定期清洗，以保证除尘效率和除尘器的绝缘效果3、介质过滤除菌：用一种介质将空气中的各种微粒和极少量的游离微生物捕集起来予以除 掉。介质过滤除菌是目前发酵工业中最常用空气除菌方法。4、培养基配制中各成分的定量方法；理论计算法设微生物生长和产物形成化学方程式为：碳源和能源 +氮源+其他所需物质t细胞 +产物+CO2+H20+热量将该方程进行定量表达，就可对培养基进行经济设计，计算出得到一定量菌体所需营养物质的最小量。第七、八章 种子培养、工艺控制2、影响种子质量的因素1、培养基2、培养条件3、种龄 4、接种量孢子质量的因素1、 培养基2、培养温度和湿度 3、培养时间和冷藏时间 4、接种量4、影响发酵温度变化的因素及其控制。因素1、生物热（Q生物）：菌体生长繁殖产生的热；2、搅拌热（Q搅拌）：搅拌时，液体与液体之间、液体与设备之间摩擦产生的热；3、蒸发热（Q蒸发）：排除气体引起水分蒸发所需的热。4、 发酵过程热量可用以下公式表示：Q发酵=Q生物+ Q搅拌-Q蒸发 温度的控制2、温度控制方法夹层通入温水或冷却水来调节温度5、控制pH方法。1、将培养基调配成菌体生长和发酵产物产生的最适pH ；2、先将培养基调配成菌体生长的最适pH，再发酵的过程中通过补料的方法来调节发酵的最适pH,如加氨水、酸、碱；补加氮源如尿素等都可以达到稳定的pH作用。&发酵过程中泡沫对发酵的影响和消除的方法影响1、使发酵罐装量减少；2、大量逃液，导致产物的损失；3、泡沫顶罐，培养基从搅拌轴封渗出，增加了染菌的机会；4、影响通气搅拌的正常进行，造成发酵异常；5、使微生物菌体提前自溶，又使更多泡沫产生；6、迫使加入消泡剂，这将对发酵工艺和产物的提取带来困难。消除泡沫的方法1）机械消泡：通过机械强烈振动或压力变化2） 消泡剂消泡：消泡剂为表面活性剂，主要有油脂类、高碳醇、脂肪酸、聚醚类、硅酮 类等6、影响供养的因素。1、空气的流速（通风量）：一般控制在 0.51.0 v/v min范围内，即1 : 0.51vvm。2、罐压：罐压的高低还与氧和 CO2在培养液中的溶解度有关。一般控制在 0.050.10mp范围内。3、搅拌： 搅拌形式、搅拌转速；5、发酵液的理化性质7、空气的分布：4、发酵液的粘度6、泡沫：&发酵罐的结构：（最主要是搅拌转速和通风量）7、补料分批培养、作用及适用范围。1、补料分批培养的含义：是指在分批培养过程中，间歇或连续的补加一种或多种成分的新 鲜培养基的培养方法。2作用1、可以控制抑制性底物的浓度，使底物浓度保持在发酵最适浓度范围；2、 可以解除或减弱分解产物对代谢过程的阻遏；3、可以使发酵过程最佳化。3适用范围1、高菌体浓度培养即高密度培养系统；2、存在高浓度底物抑制系统，特别是用甲醇、苯酚等作底物的系统;3、受代谢物阻遏的系统4、希望延长反应时间的系统从土壤中分离、诱变及随机筛选柠檬酸高产菌种选育过程。一、从土壤中筛选产柠檬酸的黑曲霉菌株1、确定筛选产柠檬酸的菌种种类，采集样品： 取霉腐土层，筛选黑曲霉菌株。2、选择合适的培养和纯种分离的方法：固体稀释平皿倾注法分离土壤中的黑曲霉， 在平板培养基中添加碳酸钙，待培养长出菌落 后，挑取透明圈大的菌落于斜面。3、挑选产酸的单菌落斜面菌种，进行生产性能的测定：即确定所筛选的黑曲霉菌株产的是柠檬酸。二、菌种的诱变育种1、将黑曲霉接种于斜面活化；2、制备出发菌孢子悬液并进行活菌计数；3、诱变剂处理：可先单一，后复合处理：1） 物理因子：紫外线诱变和丫射线诱变处理；2）化学因子：硫酸二乙酯、亚硝基胍处理；3、用加碳酸钙的平板分离诱变处理后的孢 子，待菌落长出后，挑取平板上透明圈较大的 单菌落200个于斜面培养基，300C培养长出孢子 后，进行摇瓶初筛。4、摇瓶初筛：5、摇瓶复筛：若产率不高，还必须进行第二轮诱变育种三、变异株稳定性试验：转接10代，考察传代后，各代菌株柠檬酸 生产率是否有较大的变化；四、菌种特性考察，菌落特征、菌丝形态及产生孢子的情况进行考察;五、中试验证菌种是否适合工业化生产；六、大型投产试验，进行工业化生产。1、发酵工业常用的微生物的种类，主要的发酵产品。发酵工业常用的微生物有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。细菌：1、枯草杆菌与中性蛋白酶和 a -淀粉酶；2、乳酸杆菌、双歧杆菌与酸奶、微生态剂；3、醋酸杆菌与醋酸；4、棒状杆菌与谷氨酸5、大肠杆菌与基因工程受体菌；6、目前正在研究和开发的重要细菌代谢产物枯草杆菌与溶栓酶；大肠杆菌与天冬酰胺酶放线菌：是一类呈分枝状生长， 主要以孢子或菌丝体繁殖的单细胞原核型丝状微生物，是抗生素的主要生产菌，目前发现的近万种抗生素中，80%来源于放线菌。如 链霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、金霉素、土霉素、放线菌素D、红霉素、螺旋霉素、白霉素、制霉菌素等。酵母菌：啤酒酵母（面包酵母）：应用十分广泛，除用于传统的发酵行业夕卜，还可用于提取核酸、麦角固醇、细胞色素C凝血质和辅酶 A等；同时，还可用作食用、药用和饲料用酵母。假丝酵母（有较强合成能力，可用于农产品废弃物及食品生产废水的处理。红酵母但能同化某些糖类，产脂能力较强，可从菌体提取大量脂肪。并能合成3 -胡罗卜素。发酵工业上常用的霉菌有：根霉、曲霉、青霉、木霉和红曲霉等。根霉分泌淀粉酶、蛋白酶，能产生酒精、芳香脂类物质，是酿酒所必需的主要菌。毛霉能糖化淀粉并能少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白能力。多用来做豆腐乳、豆豉。有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶。对甾族化合物有转化 作用。米曲霉：具有较强的蛋白分解能力和糖化能力。用于酱油和酿酒生产。黑曲霉是发酵工业应用最广的曲霉菌，具有多种酶系，是糖化酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、植酸酶和葡萄糖氧化酶生产菌。黑曲霉能产生多种有 机酸，如柠檬酸、衣康酸、葡萄糖酸、抗坏血酸、没食子酸等。 。栖土曲霉：栖土曲霉含有 丰富的蛋白酶系，为蛋白酶生产菌。青霉能产生多种酶和有机酸。木霉主要用于纤维素酶的生产。红曲霉能分泌淀粉酶， 产生红色素，产生酒精，产生降血压和降血脂的药物，。产黄头孢霉：本种霉菌产头孢霉素N和头孢霉素C,其衍生物称为先锋霉素。5、基因工程菌培养发酵的一般步骤。以TNF-a （肿瘤坏死因子）大肠杆菌工程菌生产TNF-a为例1、菌株：TNF-a 工程菌，含氨卞青霉素抗性基因2、 仪器设备：恒温振荡摇床；10L发酵罐；分光光度计；高速冷冻离心机3、培养基：1） 发酵培养基（g/L）:蛋白胨 240g，酵母膏120g,甘油40ml , KH2PO4 12g, K2HPO4 122. 5g。2）补料培养基（g/L）:甘油170,酵母膏 71,蛋白 71。4、发酵类型：高密度分批补料发酵5、培养发酵1 ）菌种活化：保存菌种在含 Amp 100mg/L的平板上划线分离获得单菌落，取平板上单菌落接种到含Amp 100mg/L的LB培养基中（4OmL/250mL三角瓶）,37, 190r/min 摇瓶培养过夜。2）三角瓶种子：按4%接种量接种到含 Amp 100mg/L的LB培养基中（100mL/500mL三角瓶）,220r/min ,370C培养6小时作为发酵用种子；3）发酵罐发酵(1) 培养基的配制及灭菌：10L体积的发酵罐,装7L发酵培养基，121 C高压灭菌20min。温度降到100 C以下，设定 搅拌转速150r/min,通气量0.91.0 vvm。(2) 接种及发酵：冷却后，恒温37C ,将转速和通气设定为搅拌转速250r/min,通气量1.0 vvm,为100%。调试好各发酵参数。接种700mL己预培养好的种子菌液，进行发酵培养。(3) 诱导表达：发酵2h左右，发酵液 OD600约0.80，加入IPTG至终浓度为20卩mol/L,继续发酵培 养5h，发酵45h后开始提高转速，每0.5小时提高大约50 r/min,至发酵停止时达到大约 500r/min,发酵过程中根据菌体生长和溶氧变化情况及时调整。4 )菌体收集发酵完毕后，4C 4000r/min离心10min,收集菌体，用生理盐水洗涤 23次，-20C保 存备用。5)发酵过程中的分析菌体浓度测定：OD测定：用分光度计测定OD600重量测定：发酵菌液经 5000r/min离心30分钟，称菌体湿重，650C烘至恒定，称细胞干重。OD值、菌体湿重、细胞干重之间的关系通常为：一个单位的OD值约为干菌0.4g/L, 1g湿菌体相当于0.2g干菌体。