细胞增殖与分化课件

细胞增殖与分化细胞增殖与分化 魏亚明魏亚明 博士后，研究员。 广州医学院附属市一人民医院，广州市临床医学研究所，广州市第一人民医院中心实验室主任。 广东省生化与分子生物学会理事。广东省医疗器械评审专家，广州市政府采购与科研成果评审专家。 国内外刊物发表中英文论文100余篇(含SCI收录10篇)，主要从事干细胞发育与分化、血液免疫研究。 细胞增殖包含三方面内容 细胞体积增大 细胞间质增加 细胞数目增多-狭义 细胞周期Cell Cycle 分裂间期Interphase 复制前期（G1) 复制期（S期） 复制后期（G2) 分裂期Divisionphase 核分裂karyokinesis 胞质分裂 cytokinesis 细胞周期蛋白-随细胞分裂其含量周期性变化 细胞周期蛋白与细胞周期依赖性激酶构成异二聚体,前者为调节亚单位,后者为催化亚单位. 细胞周期蛋白随细胞周期进行会降解和新合成细胞周期蛋白 激酶 功能Cyclin D CDK2,CDK4,CDK6 G1-SCyclin E CDK2,CDK3 G1-SCyclin A CDK2 早SDNA起始Cyclin A1 CDK2 早SDNA起始Cyclin B CDK1 G2-M 细胞分泌的具有调节细胞生长与分化的肽类物质，功能类似于激素。 生长因子：神经、表皮、转化、胰岛素样、血小板衍生、成纤维细胞生长等 介素类，干扰素，肿瘤坏死因子。 生长因子受体 -调节细胞生长，临床已有用于疾病治疗 细胞分化： 来自同源细胞 出现差异：形态结构、生化组成、功能 差异稳定 一、早期:细胞内特异转录因子分布差异,导致细胞不对称分裂,子代出现差异. 二、受信号分子调控: 1.旁分泌作用:跨膜传递调节信号,激活或抑制 2.近分泌作用:相邻细胞之间膜蛋白作用 3.内分泌作用:激素与其特定受体结合 三、分化是渐进过程，贯穿于整个生命活动中 四、跨过某一分化点，只能继续分化成熟。 个体发育：基因表达是按一定时空顺序发生差异表达-选择性表达。 细胞决定：见到分化特征之前，已确定未来分化的特定方向。胚胎内、中、外胚层发育 主导基因作用：某一基因激活或打开决定了某一特定分化的发生。 转分化(transdifferentiation)：从一种分化状态转化成另一种分化状态 去分化(dedifferentiation)：已分化细胞在特定条件下失去分化特性，重新进入到未分化状态。-肿瘤细胞（部分去分化） 问题：动物克隆技术是去分化吗？ 每个细胞都含有生物体全部的遗传信息 植物-很早就在进行 能产生多种不同种类的特殊细胞群体。能产生多种不同种类的特殊细胞群体。 干性：干性： 增殖特性增殖特性 自我更新自我更新 不均一性不均一性 多向分化多向分化雌原核和雄原核靠近雌原核和雄原核靠近 二核融合开始分裂（卵裂二核融合开始分裂（卵裂) 2细胞期细胞期 受精卵受精卵 4细胞期细胞期 桑椹胚（第桑椹胚（第3天）天） 胚泡（第胚泡（第4天天) 囊胚（8-16 cells）-全能-完整个体 胚泡-内细胞群-亚全能-任何组织 ESC 的主要特征: 1) 具有多向分化潜能和受精卵的某些特性,可以分化为胎儿和成体内各种类型的组织细胞; 2) 可在体外培养条件下建立稳定的的细胞系,可长期增殖培养并保持高度未分化状态和发育潜能性; 3) 将ES 细胞与816 细胞阶段的胚胎共培养后,植入假妊母体子宫,可发育为嵌合体动物,其遗传特性可进入胚系,遗传给下一代。体外ESC 具有培养细胞的特性,最大特色是可对它进行遗传改造、核转移和冻存而不失去潜能性。Embryonic stem cells 胚胚 胎胎 全全 能能 干干 细细 胞胞 （ESC） 造造 血血 干干 细细 胞胞 骨髓骨髓 基基 质细质细 胞胞 成纤维细胞 脂肪细胞 巨噬细胞 内皮细胞 网状细胞 外外 胚胚 层层 干干 细细 胞胞内内 胚胚 层层 干干 细细 胞胞 中中 胚胚 层层 干干 细细 胞胞 间间 充充 质质 干干 细细 胞胞 Mesenchymal Stem Cell ( M S C ) 间间 充充 质质(祖祖) 细细 胞胞 Mesenchymal Cells (MC) SH 2 / 3 / 4 (+) CD 13, 29, 44, 50, 54, 73, 90, 105, 106, 166 (+) CD 34, 133, 45, 33, 2, 3, 4, 8, 14, 15, 16, 19, 20, 24 ( - ) 构成构成1个人的细胞个人的细胞 100,000,000,000,000，绝大，绝大多数只分裂几次多数只分裂几次 只有特异的干细胞（只有特异的干细胞（Specialized stem cells）才能连续产生一定的组织（才能连续产生一定的组织（tissues）. 有一种组织就几乎对应有一种干细胞，包括有一种组织就几乎对应有一种干细胞，包括 skin, bone marrow, liver, muscle, etc. 他们是成体干细胞他们是成体干细胞-adult stem cells. 造血干细胞 间充质干细胞 神经干细胞 表皮干细胞 肝脏干细胞 胰腺干细胞 肠上皮干细胞 肌肉干细胞 血管内皮干细胞 造血祖细胞造血祖细胞 造血干细胞造血干细胞 某些肿瘤干细胞，如乳腺癌干细胞，某些肿瘤干细胞，如乳腺癌干细胞，白血病干细胞等。白血病干细胞等。 其它？其它？ 体外集落形成实验体外集落形成实验 脾集落生成细胞脾集落生成细胞CFU-S 长期培养再生能力长期培养再生能力LTRA 胎羊宫内移植实验胎羊宫内移植实验 竞争性再植实验竞争性再植实验 体内可见光成像技术体内可见光成像技术 骨髓基质细 胞 成纤维细胞 脂肪细胞 巨噬细胞 内皮细胞 网状细胞 间间 充充 质质 干干 细细 胞胞 Mesenchymal Stem Cell ( M S C ) 成骨细胞 血管平滑肌细胞 软骨细胞 血管外层细胞 肌腱细胞 血管内皮细胞 间间 充充 质质 细细 胞胞 Mesenchymal Cells ( M C ) SH 2 / 3 / 4 (+) CD 13, 29, 44, 50, 54, 73, 90, 105, 106, 166 (+) CD 34, 133, 45, 33, 2, 3, 4, 8, 14, 15, 16, 19, 20, 24 ( - ) 培养培养48-72小时后出现的纺锤形的贴壁细胞小时后出现的纺锤形的贴壁细胞 MSC/MC 的第一步分离 培养培养14天后出现致密贴壁的细胞汇合单层天后出现致密贴壁的细胞汇合单层 造血系统 大剂量放化疗后的支持治疗 免疫治疗 基因治疗 其它疾病的治疗 血色素疾病与血液异常血色素疾病与血液异常 (Hemoglobinopathies and Blood Disorders)巨细胞球缺乏性血小板减少症 (Amegakaryocyte Thrombocytopenia, AMT) 再生不良性贫血 (Aplastic Anemia)先天性血球细胞缺乏症 (Congenital Cytopenia)鎌形细胞贫血 (Sickle-cell Anemia)地中海性贫血 (Thalassemia)Blackfan-Diamond氏贫血 (Blackfan-Diamond Anemia)Evan氏症候群 (Evan Syndrome)Fanconi氏贫血 (Fanconi Anemia)Kostmann氏症候群 (Kostmann Syndrome) 恶性病类恶性病类(Malignancies, Cancers)急性淋巴细胞性血癌 (Acute Lymphocytic Leukemia, ALL)急性骨髓性白血癌 (Acute Myelogenous Leukemia, AML)急性非淋巴细胞性白血癌 (Acute Nonlymphocytic Leukemia, ANL)慢性淋巴细胞性白血癌 (Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL)慢性骨髓细胞性白血癌 (Chronic Myelocytic Leukemia, CML)年轻型骨髓单核细胞性白血癌 (Juvenile Myelomonocytic Leukemia, JML)骨髓发育不良症候群 (Myelodysplastic Syndrome, MDS)多发性骨髓瘤 (Multiple Myeloma)固体性肿瘤 (Solid Tumor)脑瘤 (Brain Tumors)何杰金氏病 (Hodgkins Disease)非-何杰金氏淋巴瘤 (Non- Hodgkins Lymphoma)Ewing氏肉瘤 (Ewing Sarcoma)生殖细胞肿瘤 (Germ Cell Tumors)神经母细胞瘤 (Neuroblastoma)卵巢癌 (Ovarian Cancer)小细胞性肺癌 (Small-Cell Lung Cancer)睪丸癌(Testicular Cancer) 先天性代谢性缺陷先天性代谢性缺陷(Inborn Errors of Metabolism)脑白质肾上腺营养不良症 (Adrenoleukodystrophy)淀粉样变性 (Amyloidosis)巴尔淋巴球症候群 (Bare-Lymphocyte Syndrome)先天性角化不良 (Dyskeratosis Congenita)家族性噬红血球性淋巴组织细胞增生症 (Familial Erythrophagocytic Lymphohististiocytosis)Gaucher氏疾病 (Gaucher Disease)Gunter氏疾病 (Gunter Disease)Hunter氏症候群 (Hunter Syndrome)Hurler氏症候群 (Hurler Syndrome)遗传性神经元蜡样脂褐质沉着症 (Inherited Neuronal Ceroid Lipofuscinosis)Krabbe氏疾病（婴儿遗传性脑白质萎缩）(Krabbe Disease)Langerhan氏细胞组织细胞增生症 (Langerhans Cell Histiocytosis)Lesch-Nyhan氏疾病 (Lesch-Nyhan Disease)骨硬化病（骨质石化病）(Osteopetrosis)白血球粘着缺乏症 (Leukocyte Adhesion Deficiency) 免疫缺乏病变（免疫缺乏病变（Immunodeficiencies) 腺嘌呤去氨酵素缺损 (Adenosine Deaminase Deficiency, ADA)慢性肉芽肿疾病 (Chronic Granulomatous Disease, CGD)严重性联合免疫缺陷疾病 (Severe Combined Immunodeficiency Diseases, SCIDs)X-性联性淋巴组织增生疾病 (X-linked Lymphoproliferative Disease, KLP)Wiskott-Aldrich症候群 自体免疫疾病自体免疫疾病(Autoimmune Diseases)多发性硬化症 (Multiple Sclerosis)风湿性关节炎 (Rheumatoid Arthritis)红斑性狼疮 (Systemic Lupus erythematosus) 糖尿病 (Diabetes)帕金森氏病 (Parkinsons Disease)阿尔罕默氏病（痴呆病） (Alzheimers Disease)脊髓伤害 (Spinal Cord injury)中风 (Stroke)心脏病 (Heart Disease)肝病 (Liver Disease)皮肤移殖 (Skin Transplantation)肌肉营养不良症 (Muscular Dystrophy 抽出自身骨髓血，分离，成体干细胞注射在缺血的下肢肌肉中，诱导血管再生，再生新鲜微小血管并逐渐发育形成微小动脉，向缺血肢体供应血液，改善缺血部位的血液循环，达到治疗下肢缺血的目的。足痛消失，皮肤颜色恢复正常。 自体外周血干细胞移植治疗糖尿病足500例临床研究-解放军463医院杨晓风主任 军事医学科学院军事医学科学院放射医学研究所吴祖泽院士放射医学研究所吴祖泽院士输血研究所裴雪涛教授输血研究所裴雪涛教授正在申报新药：正在申报新药： 即将干细胞生产标准化，生产过程规范化，即将干细胞生产标准化，生产过程规范化，建立相应的产品质控标准和质控体系，向建立相应的产品质控标准和质控体系，向药品一样推向市场，应用于下肢静脉栓塞药品一样推向市场，应用于下肢静脉栓塞治疗，目前处于一期临床阶段。治疗，目前处于一期临床阶段。 收集干细胞（自体来源）-爬片-间充干细胞-10uM/L 5-aza诱导24小时，PBS清洗-IMDM培养2-3周，检测肌节性肌动蛋白，结蛋白，细胞1107，标记后移植。 动物模型制作：结扎冠状动脉前降支，结扎点远端穿刺注入。 移植2，4，6周后病检，发现稳定植入和存活证据，分泌IGF-1和VEGF，产生新血管，改善功能。 直接取骨髓基质细胞，分离单个核细胞或干细胞直接输注，体内诱导，也有效果。 人，大鼠，狗等动物均取得成功，已临床应用。 MSCs诱导分化ISC分为3个阶段: （1）MSCs被诱导分化为nestin(+)细胞(胰岛前体细胞标志) （05h）; （2）nestin(+)细胞增殖后诱导（ 3磷酸肌醇激酶抑制剂和烟酰胺等）成为胰岛前体细胞（6h7d）； （3）ISC成熟阶段（8d28d）。形态上类似正常胰岛，可表达胰岛素、胰高血糖素、胰多肽和生长抑素等蛋白，以及葡萄糖转运体2、葡萄糖激酶、胰十二指肠同源异型盒基因、HNF3等多种胰岛相关基因的mRNA，而且诱导后细胞对多种药物刺激反应敏感，其胰岛素的分泌调节机制与正常细胞相近。DM病人有望利用自身MSCs体外诱导分化为ISC来治疗DM。 胰岛细胞移植治愈七名糖尿病患者-京军区福州总医院 南京军区福州总医院副院长兼泌尿外科主任、全军 器官移植中心主任谭建明教授与 上海市第一人民医院合作完成的。 成人胰岛细胞移植，是从成人胰腺中分离、纯化出胰岛细胞，通 过短期培养，经门静脉行肝内移植。谭建明教授2002年 在亚洲率先建立起大鼠糖尿病模型，建立了经门静脉肝内移植胰岛细胞和无激素免疫抑制剂治疗方案。应用该方法治愈的7名患者中，年龄最大的45岁，最小的13岁。 福建福清患者周某，糖尿病病史10年，多次出现酮症酸中毒，接受胰 岛细胞移植后，完全撤离胰岛素已超过3年。 干细胞移植对 模型动物研究 干细胞移植对 模型动物基础研究的主要供体细胞是， 以及 经诱导分化而制备的神经干前体细胞。 移植前的预先诱导可能提高了供体细胞对局部微环境的适应性， 更易于功能恢复， 从而取得疗效。 动物实验：大树，食蟹猴，猕猴。 机理：1.替代作用；2.神经元营养保护作用 脑瘫，脑缺血，脑外伤等神经损伤国内已有报道。 1999年12月,新密市第一人民医院神经外科专家王武、张美岭、付振峰等与国家自然科学基金会及郑州大学联合成立“神经干细胞移植的基础和临床研究”攻关小组,先后完成了一系例动物试验和临床观察,反复进行了人胚神经干细胞移植的论证工作,并将动物试验成果应用于瘫痪病人的临床治疗。 一男子因车祸致重型颅脑损伤,成为植物人。实施了人胚神经干细胞移植术,将320万个纯化神经干细胞移植到患者体内。术后第四天,患者肢体肌力开始恢复,可自主进食。目前患者运动障碍逐渐消失,僵硬挛缩的肢体变得柔软灵活,基本达到正常人状态 。 上海交通大学医学遗传研究所黄淑帧教授（曾溢滔院士夫人）领衔的课题组，将人脐血内的造血干细胞移植到50头山羊胚胎中，生出的39头小羊，发现羊宝宝的血液、骨髓、脾、肝、肾、骨骼肌、肺、心脏等器官里，都有人的基因，最高的检出率达37%。以肝脏和血液为例，除了外表看上去是羊的肝外，内核都是人的细胞，血液中也表达了人血清的白蛋白。相关研究成果刊登在2006年6月的美国科学院院报（PNAS） 。 曾溢滔院士曾在1999年春培育了我国第一头克隆牛“滔滔”以及乳汁中含有人凝血因子的克隆羊。 如果该干细胞打到卵巢或睾丸组织中，并定植下来，后代会怎样呢？ 2002年月自然医学杂志; 人和鼠的骨髓中都包含着“内皮祖细胞”，这类干细胞能形成红血球和血管。美国加州斯克里普斯研究所的弗里德兰德等人在研究中发现，取自实验鼠骨髓的“内皮祖细胞”被注入鼠眼后，会附着在视网膜内的星形细胞上，与鼠眼内部已有的血管结构相结合形成新血管，这对鼠眼内已退化的血管结构起到了改善作用。 糖尿病性视网膜病主要由视网膜内的血管受损而引起，在糖尿病患者中比较常见，严重的话有可能使人失明。类似的技术有望为治疗糖尿病性视网膜病等疾病开辟一条全新的途径。 干细胞-骨组织工程 干细胞-软骨组织工程 干细胞-皮肤组织工程 干细胞-肌腱组织工程 干细胞-心肌组织工程 干细胞-血管组织工程 干细胞-肝组织工程 干细胞-膀胱组织工程 韦克福雷斯特大学再生医学研究所所长安东尼艾塔拉包皮环割手术者的皮肤样本中，分别提取了单个干细胞。联合使用激素和生长因子，诱导分化成脂肪、肌肉和骨骼细胞。这些分化而成的组织细胞经过三维空间培养后，被植入实验鼠体内进行验证。研究人员设想，将来可以用患者自身的皮肤样本提取干细胞，再培育出各种组织细胞注射回患者体内，修复他们受损的组织。 柳叶刀杂志的报告，接受膀胱组织工程移植手术的7名患有先天性疾病脊柱裂患者移植手术后，小便失禁状况得到明显改善。 培育原理培育原理 “新膀胱”由三层物质构成：外层为肌肉、内层为膀胱上皮，中间是起连接作用的组织蛋白胶原质。 从患者的膀胱上取下活细胞样本，提取细胞、剥下胶原质，将肌肉细胞和膀胱上皮细胞分别置于不同的培养器皿中。一个星期后，将细胞放在一些海绵形状的、由胶原质制成的可生物降解“支架”上。 7个星期，原先的数万个细胞已经繁殖到15亿个左右，布满“支架”，膀胱上皮在内，肌肉在外。将“新膀胱”移植到患者膀胱的上面。这样，新器官会继续生长并与老器官“重组”，取代老器官中丧失功能的部分。 美国：美国：Prohibit ES cell research. Close off all federal funding. 2004 the NIH spent $190 million on adult stem cell and $25 million on embryonic stem cell research 国内：科技部卫生部国内：科技部卫生部2003年出台干细胞研究意年出台干细胞研究意见：见： 胚胎干细胞研究仅限于小于胚胎干细胞研究仅限于小于16天的胚胎。天的胚胎。 国内外合作增多，转移至国内？国内外合作增多，转移至国内？ 低毒性（或无毒性），一次药有效；低毒性（或无毒性），一次药有效； 不需要完全了解疾病发病的确切机理；不需要完全了解疾病发病的确切机理； 自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。应。 可以通过血液循环在体内迁移可以通过血液循环在体内迁移 破坏胚胎（Ethical Dilemma？） 细胞诱导分化发育方向未知 免疫排斥 人 ES cells 治疗Parkinsons 引发病人脑teratoma导致死亡 未知风险 背景背景 造血干/祖细胞移植已成为迄今为止治疗恶性血液病、重度放射病、某些遗传性疾病、肿瘤以及某些免疫缺陷等疾病的最有效措施。造血干细胞移植可以来源于PB、BM、CB等。 问题问题： 脐血细胞数量少，仅可满足儿童需求；移植造血恢复慢；复发率高。 以荷K562红白血病的小鼠模型，采用体外细胞因子诱导分化和扩增形成一定含量的T, NK, 及 DCs免疫细胞的脐血进行干细胞移植，在动物体内观察脐血免疫定向扩增移植后的造血与免疫重建以及GVHD和GVL效应。 Int J Hematol 2008,Mar;87(2):217-224