生物化学与分子生物学考试(中山大学)

一、 名词解释1、基因克隆：是指把目的基因连接到载体上，构建成重组体，再转化入宿主细胞内进行复制和表达。或：是指在体外通过酶的作用将异源DNA连接到载体上，形成重组DNA并将其导入受体细胞，从而扩增异源DNA的技术。2、基因文库：是指整个基因组或某一细胞所表达的基因所有克隆片段的集合体，包括基因组文库和cDNA文库。常用的从基因文库中筛选目标基因的方法：斑点杂交、扣除杂交、免疫化学筛选法、染色体步移和差异表达基因筛选。3、cDNA文库：是指以所有mRNA为模板，不经选择地在逆转录酶的作用下反转合成互补的双链，即cDNA，然后把cDNA与载体连接构成重组DNA，再转化入宿主细胞扩增，建立cDNA文库。4、管家基因：是指某些基因表达产物是细胞或者整个生命过程中都持续需要而必不可少的，这类基因称之为管家基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等5、散弹测序法：又称鸟枪测序法，是指大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体，小片段测序完成后，计算机根据重叠区将小片段整合出大分子DNA序列。6、功能基因组学：利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因及其编码蛋白的功能，包括生物学功能，细胞学功能，发育学功能。7、限制性内切酶：是指能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性DNA片段，被称为分子生物学家的手术刀。8、Ks：即细胞周期蛋白依赖性激酶，是一类Ser/Thr蛋白激酶，与周期蛋白结合时，才具有蛋白激酶的活性，通过使靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应。9、RT-PCR：是指首先以mRNA为模板合成cDNA，然后再进行常规PCR扩增的PCR。10、逐个克隆法：对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）11、荧光定量PCR：是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。12、基因组：又称染色体组，是指一个物种单倍体的染色体数目，是生物体全部遗传物质的总和，主要指真核生物的核基因组和原核生物的类核基因组。13、基因组学：是指对生物体内所有基因进行基因组作图（遗传图谱、物理图谱、转录图谱）、核苷酸序列分析、基因定位、基因功能分析的一门学科。或：指从基因组水平（分子整体水平）研究遗传的学科，主要是发展和应用DNA制图、测序新技术和计算机程序，分析生命体全部基因组的结构与功能。14、启动子：是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。15、肿瘤转移：是指恶性肿瘤细胞离开原发部位，通过各种途径到达其他器官组织，并继续生长、增殖形成性质与原发肿瘤相同的转移瘤的过程。16、显性负突变：是指一对等位基因中因其中一个突变或丢失所致的另外一个正常等位基因的功能活性丧失，都称为显性负突变，在某些肿瘤中抑癌基因p53的一个等位基因的失活导致另一个正常等位基因也失去活性。17、Delta32突变：CCR5基因发生32个碱基缺失，在细胞膜表面所产生缩短的、无功能的穿膜蛋白质，使HIV不能进入T细胞。18、质粒：是指存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子，具有自我复制功能，带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物，经改造后具有多克隆位点。19、细胞周期：是指细胞周而复始的生长分裂过程，并且呈现一定的周期，即指亲代细胞分裂结束至子代细胞分裂结束的过程，又称细胞增殖周期。20、肿瘤标志：是指能反映细胞恶性演变的各个阶段中表型及基因型的特性或特征，通称为肿瘤标志，包括生物学标志、遗传性标志及生物化学标志。21、血管增生：是指从已存在的毛细血管网上大量生成新生血管的过程，是由于细胞与细胞、细胞与基质及细胞与细胞因子相互作用的结果。22、载体：是指能携带和运载目的DNA进入宿主细胞的一些DNA分子，它可以使目的DNA随着宿主细胞的增生而无性繁殖或在宿主细胞中表达目的DNA。23、PCR：即以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为上、下游引物，在DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，按照半保留复制的机制，使目的DNA片段得到扩增的技术。24、病毒癌基因（V-onc）：是指一类存在于肿瘤病毒中的，能使靶细胞发生恶性转化的基因。如v-src等。25、SNP：即单核苷酸多态性，是指出现在基因组DNA分子的特定位置的单核苷酸的置换，或指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。SNP位点必须满足该位点的变异在人群中出现的频率大于1%。在基因组中，不同个体的DNA序列上的单个碱基的差异被称为SNP。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量可能超过十万个 。27、Cyclin：是一类在细胞周期中，周期性的积累和降解的蛋白。即会随细胞周期中的不同时期而进行合成与降解。不同生物的细胞周期素具有共同的特点：1）结构中含有同源序列，被称为细胞周期素盒，这是一个100-150个氨基酸的保守区域，负责或介导与CDK结合。2）在细胞周期的特定时相与CDK结合，作为CDK的调节亚基发挥作用。28、酶联受体：细胞表面上的主要类型受体，其细胞质区具有酶活性，或者和细胞质中的酶结合，配体与其结合后，激活酶活性。29、结构基因组学：研究基因组的结构并构建高分辨率的遗传图、物理图、序列图和转录图以及蛋白质组成与结构的学科。30、限制性片段长度多态性/遗传学标记（RFLP）：是指用同一限制性核酸内切酶消化不同个体的同一段DNA时，会得到长度不同的限制性片段，称为RFLP(遗传学标记)。基本原理：特定生物类型的基因组DNA经限制性内切酶切后，产生分子量不同的同源等位片段，再通过电泳的方法分离和检测这些片段。31、蛋白质组学：在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科。它以蛋白质组为研究对象（即一个细胞或一个组织中基因组所表达的全套蛋白质），从整体活动的角度，来揭示和阐明生命活动的基本规律。主要包括：（1）细胞器蛋白组学；（2）表达蛋白组学32、K5：是由纤溶酶原中与血管抑素相连的联环结构域，由80个氨基酸残基组成，包括3个二硫键，分子量为16KD。33、细胞通讯：是指体内一部分细胞发出信号，另一部分细胞接收信号并将其转变为细胞功能变化的过程。34、信号转导：是指细胞针对外源信息所发生的细胞内生物化学变化及效应的全过程。35、蓝-白斑筛选：细菌如含编码半乳糖苷酶的LacZ基因，能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。二、简答题1. 人类基因组计划的主要内容（简述）1)、HGP的目的：解码生命；了解生命的起源，了解生命体生长发育的规律，认识种属之间和个体之间存在差异的起因；认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生民现象；为疾病的治疗提供科学依据。2）、主要目的：阐明人类基因组的全部核苷酸序列，从整体水平上破译人类遗传信息，在分子水平全面认识自我。3）、核心内容：是绘制人类的遗传图谱、转录图谱、物理图谱和序列图谱。2、大规模测序的基本策略。1）逐个克隆法：对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）2）全基因组鸟枪法：在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接讲基因组分解成小片段随机测序，利用计算机进行组装。3、引物设计的原则：（1） 引物长度一般为18-30bp；（2） 碱基随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，G+C含量应在40%-60%；（3） 避免发卡结构形成，引物自身存在的连续互补序列一般不超过3bp；（4） 两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠；（5） 引物的碱基序列不应与非编码区域有同源性，应位于高度保守区；（6） 引物的3端无修饰，并尽量避免第一位碱基为第一二位碱基一定要与DNA模板配对，引物5端可以修饰。（7） 上下游引物具有相似的Tm值、TapDNA聚合酶。4、蓝白斑试验的原理是基因工程常用的筛选方法，可以确定目的基因是否已插入载体中，工作原理是目的基因插入后，干扰lacZ基因，因而没有半乳糖苷酶的表达，Xgal不分解，菌落呈白色。如果目的基因插入不成功，组件上的lacZ基因表达出a片段，宿主菌表达出w片段，组合成完整有活性的半乳糖苷酶，Xgal分解出游离吲哚，菌落变为蓝色。5、举例说明限制性内切酶命名的原则限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案，即第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写,第2，3二个字母取自来源细菌种名的头2个字母，小写,如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示,如Hind代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzac) d株中分离到的第3个限制酶。6、蛋白质组学在生物医学基础研究中的应用1）、通过寻找差异表达蛋白质,以发现疾病相关的蛋白质；2）、寻找用于诊断的疾病相关的标记分子；3）、寻找疾病相关的蛋白质药靶,以用于药物设计；4）、研究疾病的致病机理等。7、Sanger双脱氧链终止法测序的原理即DNA链末端合成终止法 Sanger 法1）、单链DNA模板与寡核苷酸引物杂交，新的DNA链在DNA聚合酶催化下从引物末端进行合成。在反应混合物中除了有模板DNA、引物、 DNA聚合酶和4种底物dNTPs之外，还加入一定比例的四种2,3-双脱氧核苷三磷酸ddNTPs(终止核苷)之一。例如，加入ddATP，则所得到的合成物产生一系列嵌套的DNA片段，通过荧光标记替代发现其中每一个片段终止于序列的A碱基对。对其他三种碱基，采用同样的方法，但需要不同的荧光标记。2）、所有标记的DNA片段混合物经过电泳分离大小不同的片段，并对这四种标记的片段进行扫描。然后通过某一程序判断条码的顺序并预测序列。 8、以干扰素为例，试述其细胞信号转导通路的途径干扰素与细胞因子介导的受体结合后使受体二聚化，使得结合在受体亚基上的JAK聚集并相互磷酸化而进一步活化，同时将受体上的酪氨酸残基磷酸化，STAT借助于SH2结构域结合与受体激酶复合物的磷酸化酪氨酸残基上，得以靠近JAK激酶。JAK使STAT的酪氨酸残基磷酸化，此时的STAT与受体的亲和力降低并与之分离，磷酸化的STAT形成STAT复合体并移到细胞核内，结合于启动子的特定DNA序列，调节基因表达。9、理想载体应具备哪些基本条件1）复制子：在宿主细胞内大量复制；2）同一限制性酶在载体上只有单一的酶切位点；3）具有选择性遗传标记；4）有较多的拷贝数；5）分子量相对较小，有足够大的接纳目的基因的容量6）有较高的遗传稳定性。10、获取目的基因的方法：1）从基因组DNA中分离获得；2）从基因文库中筛选获得（基因组文库和cDNA文库）；3）化学合成法；4）PCR扩增；5）mRNA逆转录。11、基因工程技术与基因调控原理之间的关系。基因工程的目的是使目的基因能高效表达。基因表达受 DNA 结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结合等组成的表达体系的调控。基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。12、为什么拮抗VEGF 能拮抗肿瘤血管生成？请举出拮抗VEGF 的三种生化策略。）VEGF通过增强血管的通透性，引起血浆蛋白（主要是纤维蛋白原）的外渗，为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供了最佳的基质。）VEGF与受体结合，发挥其特异性的内皮细胞分裂原的活性，诱导血管内皮细胞的增殖。）VEGF提高血浆活化因子和尿激酶类纤维蛋白原活化因子表达，促进蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子的活化，具有促进血管构建作用，诱导血管生成。拮抗VEGF能抑制肿瘤血管增生。拮抗VEGF主要围绕对VEGF的阻断，降低VEGF活性和阻断VEGF信号传导通路。 利用抗体封闭原理阻断VEGF和其受体结合，中和VEGF的单克隆抗体已进入临床使用； 螯合VEGF受体2的单克隆抗体进入临床3期实验； VEGF抗体、VEGF受体的螯合蛋白及反义寡核苷酸显著抑制视网膜和虹膜血管增生。 利用基因治疗阻断、拮抗VEGF和受体的结合，包括以VEGF为靶点的基因治疗，以flt-1为靶点的基因治疗和以flt-2/KDR为靶点的基因治疗。14、P53 通过哪些机制介导细胞的生长阻滞1）P53对细胞增殖其负性调节作用，它与特定DNA序列结合后可诱导细胞停滞在G1期，抑制细胞的生长。2）当P53基因活跃表达时，其产物P53蛋白作为一种典型的转录因子可促进cipl基因的表达，产生p21，p21蛋白与CDK2酶结合，抑制该酶的活性，导致细胞不能进入DNA合成期，细胞无法进行有丝分裂，细胞分裂停止。3）DNA损伤激活p53在细胞周期的不同阶段起不同作用，早期通过诱导p21对CDK-cyclin激酶的抑制，激活限制点，阻止细胞周期前进，直到损伤修复，晚期引发细胞凋亡。15、K5作用的分子机制1）K5抗血管增生的研究是建立在血管抑素基础之上，二者可能有相似的抗血管增生的分子机制2）K5能特异性地作用于血管内皮细胞，使细胞周期停滞，并能诱导内皮细胞凋亡3）K5选择性抑制内皮细胞迁移是其抗血管增生的重要环节4）K5能通过抑制HIF-1和p42/p44 MAPK的活性下调内源性血管刺激因子VEGF的表达5）K5提高内源性血管增生抑制因子PEDF的表达，有利于已打破的血管增生平衡恢复正常，K5对正负血管因子的调节是其抗血管增生的主要机制 6）K5和血管抑素抑制内皮细胞增殖机制可能通过细胞外基质中某些多糖分子如整合素来发挥作用，因为整合素是维持MAPK活性所必需的 7）K5抑制炎症细胞分泌细胞因子，如血管内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子及白细胞介素-2等8）K5降低血管通透性16、血管增生与肿瘤转移 1）、血管生成不仅是肿瘤生长所必需，而且还是肿瘤细胞发生转移所需要；2）、新生毛细血管的内皮细胞能分泌胶原酶和组织纤溶酶原激活物，促进基质降解，便于肿瘤细胞脱落进入血管和向邻近基质扩散；3）、血管前期，循环中极少有肿瘤细胞，但在肿瘤血管化后，肿瘤细胞才持续出现在循环中。17、mRNA是怎样成为cDNA文库（1）提取mRNA；（2）用反转录酶oligo(dT)引导合成cDNA第一链；（3）cDNA链第二链合成（用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶）；（4）加入合成接头，将双链DNA克隆到载体中去，分析cDNA插入片段；（5）扩增cDNA文库，对建立的cDNA文库进行鉴定。18、Viral Virulence: The capacity of a virus to cause disease in an infected hostVirulence can be quantitated: 1）、mean time to death；2）、mean time to appearance of symptoms；3）、measurement of fever, weight loss；4）、measurement of pathological lesions (poliovirus), reduction in blood CD4+ lymphocytes (HIV-1)19、Viral genes affecting virulence:（1）Affecting the ability of the virus to replicate（2）Modifying the hosts defense mechanisms（3）Enabling the virus to spread in the host（4）Having intrinsic cell killing effects20.Host defense systems against viral infections are multistep, sequential, and intercommunicating.1）、Physical and chemical defense：skin, acid pH, and surface-cleansing mechanism2）、 Cell-autonomus, intrinsic defense systems defense：Production of cytokines, induction of apoptosis, interference with early steps of viral replication 3）、Innate and adaptive immune defense：、Direct, amplified response by coordinated action of cytokines and lymphocytes；、Infection cleared by pathogen-specific antibodies, helper T cells, and cytotoxic T cells；、Production and maintance of B-cell and T-cell memory cells immune host, ready to respond instantly to the same infection that induced the memory response.21、正常角膜没有血管的理论依据和实验依据 正常角膜，玻璃体等眼内组织中PEDF具有较高的浓度，而PEDF具有很强的抑制血管的作用。在体外实验中，PEDF在半数有效量0.4nmol/L基础上以剂量依赖方式特异性抑制内皮细胞移行，并且半数有销量量比血管抑素，血小板反应蛋白-1，内皮抑素活性更高。如果抽掉玻璃体体液中的PEDF，其抗血管生成的活性消失，而表现出刺激血管生成的活性。22、试从PCR的原理和应用角度，谈谈其有何实用价值PCR技术即无细胞分子克隆法：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的基因（DNA片段）得到扩增；另一方面，新合成的DNA片段也可以做为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。应用价值：） 生物学基础研究：目的基因扩增和鉴定；DNA序列测定；定点突变；基因表达分析。） 医学临床应用：遗传病基因诊断；致病病原体检测；癌基因检测；器官移植组织配型。） 法医学物证鉴定：个体识别；亲子鉴定。） 其他：动、植物检疫（转基因动植物检测）；生物物种鉴定；系统进化研究；分子考古学等。补充： PCR是一种类似DNA天然复制过程的选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性依赖于一对人工合成的寡核苷酸引物，该引物与靶序列两端互补。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成：）、模板DNA的变性：模板DNA经加热变性后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成单链，以便它与引物结合，为下一步做准备。）、模板与引物的退火（复性）：模板经加热变性成单链后，温度下降至适宜温度（一般较低），使引物与模板单链按碱基互补原则退火结合。）、引物的延伸：将温度升至，模板引物结合物在聚合酶的作用下，以为底物，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留的复制原理，合成一条新的与模板链互补的子链。上述三个步骤成为一个循环，新和成的分子继续作为下次循环的模板，每完成一个循环需分钟，经多次循环（次）后就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。以技术为基础，与其他相关的分析技术方法相结合，衍生了许多新型的分析技术，如不对称、反向、实时荧光定量等。23、病毒的分子生物学特点包括基本结构和辅助结构，基本结构为核衣壳，由衣壳和病毒核心组成，辅助结构为包膜。其中病毒核心分为核酸，病毒基因组，病毒衣壳为包绕在核酸外面的蛋白质衣壳，衣壳由壳粒组成，而壳粒由多肽分子组成。24、阐述影响肿瘤转移的因素有哪些肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞离开原发部位，通过各种途径到达其他器官组织，并继续生长、增值形成性质与原发肿瘤相同的转移瘤的过程。其机制极为复杂，主要与肿瘤细胞自身的特性、宿主细胞免疫状态及转移局部组织的特性有密切的关系，主要涉及以下四个步骤：、恶性肿瘤细胞从其瘤组织中分离、释放；、分离出来的瘤细胞游走并穿越细胞基底膜及细胞外基质而侵入血管、淋巴管等脉管系统。、瘤细胞侵入并附着在多种组织间隙；、瘤细胞在新的部位分裂、增值形成转移性瘤组织。25、根据肿瘤转移的过程和分子机制分析阻止肿瘤转移的策略和手段有哪些。1）、基因调控下的肿瘤转移：肿瘤转移与促进基因和抑制基因之间表达失衡相关。 2）、粘附分子与肿瘤转移：粘附因子是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白。 在肿瘤转移的每个环节均包含粘附与分离（粘附解聚）两个方面。 3）、血管生成与肿瘤转移：肿瘤的生长和转移与血管形成密切相关、肿瘤新生毛细血管是在周边组织原有的血管基础上延伸扩展形成、肿瘤本身能诱导血管的形成。4）纤溶酶及其调节因子与肿瘤转移：纤维蛋白溶解酶能水解大多数细胞外基质物质，在血管形成、肿瘤细胞脱落、基质浸润、侵入和逸出循环系统、继发脏器移行和微环境改造等发挥重要作用。5）基质金属蛋白酶及其抑制剂与肿瘤转移：细胞外基质的溶解酶系统由一个庞大的蛋白溶解酶家族组成，称为MMPs， MMPs及其抑制剂（TIMP）在肿瘤侵袭和转移过程中担任重要角色抗肿瘤转移的策略和手段：1）肿瘤转移的基因治疗p 肿瘤转移抑制基因nm23基因治疗靶点p 基因转染改变肿瘤细胞t PA/u PA的活性以阻断肿瘤转移p ras基因表达阻断 2）血管生成抑制剂与抗肿瘤转移u 抗生素、维生素D3衍生物、维甲酸类、多磺基化合物、肝素类似物及细胞外基质成分等 u 血小板因子4（PF4）：能使FGF丧失生物活性，u TNP-470 ：是烟曲霉素类似物。u 血小板反应素-1（TSP-1）：能抑制血管生长因子。u 姜黄素：能抑制新生血管的形成和促进微血管崩解。3）细胞粘附因子抑制剂与抗肿瘤转移4）MMPs抑制剂与抗肿瘤转移26、为了实际工作需要产生了许多种PCR ，请简述其名称和作用。1）不对称PCR：制备核酸序列测定的模板、制备杂交探针、基因组DNA结构功能的研究2） 反向PCR：可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。3）多重PCR：用于检测特定基因序列的存在或缺失。4）LP-PCR：大量临床标本的基因诊断、可同时检测多种基因成分。5）锚定PCR：用于仅有一个引物的扩增6）逆转录PCR：建立cDNA文库，该技术主要用于分析基因的转录产物，获取目的基因，合成cDNA探针，构建RNA高效转录系统。7）原位PCR：可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用，在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。8) 荧光定量 PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 试述细胞周期各时相中cyclins的表达规律。根据细胞周期素在不同时相发挥作用可把细胞周期素分为G1细胞周期素和M期细胞周期素。1）、G1细胞周期素，在G1期或者G1/S交界处发挥作用，包括cyclinC、cyclinD、cyclinE等多种。、cyclinC在G1期中点、cyclinA出现之前，其在细胞内的水平达到顶峰，提示其在G1期发挥作用。、细胞内至少存在三种cyclinD：D1、D2、D3，它们在不同细胞内表达模式是不同的，在人类hela细胞，cyclinD1在S期后上升，在M期达到顶峰，在G1中期逐渐消失；cyclinD3在G1期开始出现，逐渐升高，在S期达到顶峰。、有两种cyclinE：E1和E2。cyclinE在G1中期出现，cyclinE-CDK复合物的活性最高峰在G1/S调控点。2）、M期细胞周期素，在G2/M交界处发挥作用，可诱导细胞分裂，有cyclinA、cyclinB两种。CyclinA只出现在细胞核，在细胞周期的DNA合成之前出现，其在细胞中的量不断增加，直到中为止，大致在有丝分裂的中期通过与泛素相关的途径降解。写出你所知道的定点突变的方法、名称。1) M13作为载体的定点突变技术；2) 不需M13作为载体的定点突变技术；3) PCR介导的定点突变；4) 野生型DNA的筛选排除；5) Red/ET重组系统介导的定点突变。何谓基因表达？基因表达的调控可发生在哪些水平？基因表达是指贮存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物学功能的整个过程。基因表达涉及遗传信息从DNA蛋白质的整个传递过程，基因表达调控可以发生在该传递的各个环节，例如，在真核生物的基因表达调控中，便至少存在转录前、转录、转录后、翻译、和翻译后五个不同水平的调控。何谓第二信使？简述其基本特征和作用。第二信使是指在细胞内进行信息传递的化学物质，包括无机离子、脂类衍生物、糖类衍生物、核苷酸以及信号蛋白分子。其在传递信号时绝大部分通过酶促级联反应方式进行。它们最终通过改变细胞内有关酶的活性、开启或关闭细胞膜离子通道及细胞核内基因的转录，达到调节细胞代谢和控制细胞生长、繁殖和分化的作用。肿瘤转移的关键步骤。（一）原发瘤增殖和扩展：（二）肿瘤血管的形成：（三）肿瘤细胞脱落并进入基质：（四）进入脉管系统：（五）癌栓形成：（六）肿瘤细胞锚定黏附：（七）逸出循环系统：（八）转移后结局：侵入转移部位遗传标记及其利用（简述）遗传标记可以是体质形状或可以检出的DNA序列，如基因限制性片段长度多态性，通过比较不同酶切片段之间的差异发现与生理或病理现象相关的基因并在染色体上定位；短串联重复序列多态性用于基因定位、遗传病诊断和DNA指纹；单核苷酸多态性用探针和芯片技术有利于提高遗传图谱研究的精确性。另外遗传标记还可用于诊断、治疗、预防疾病易感期的识别，风险人群生活方式及环境因子的干预。21浙江大学17春16秋浙大家畜传染病学(乙)在线作业一、单选题（共 40 道试题，共 80 分。）1. 感染猪传染性胃肠炎后，死亡率最高得猪是()阶段得猪A. 10日龄以内的猪B. 青年猪C. 育肥猪D. 怀孕母猪正确答案：2. 病毒性传染病主要用()进行预防。A. 抗菌素B. 疫苗C. 中草药D. 干扰素正确答案：3. 犬传染性肝炎与（ ）在免疫上可交叉保护。A. 型犬腺病毒B. 犬瘟热病毒C. 犬细小病毒D. 流感病毒正确答案：4. 我国现阶段使用的猪瘟疫苗是通过（ ）的 连续传代后选育而成的。A. 猪体B. 猫体C. 兔体D. 羊体正确答案：5. 猫泛白细胞减少症由（ ）引起。A. 细小病毒B. 疱疹病毒C. 轮状病毒D. 冠状病毒正确答案：6. 猪丹毒主要发生于（）A. 仔猪B. 架子猪C. 怀孕后期母猪D. 香猪正确答案：7. 猪梭菌性肠炎，主要侵害（）阶段的猪。A. 1-3日龄的猪B. 7-10日龄的猪C. 10-30日龄的猪D. 成年猪正确答案：8. 引起兔梭菌性下痢的病原是（ ）型魏氏梭菌A. AB. BC. CD. D正确答案：9. 羊猝疽是由（ ）引起的一种疾病A. 腐败梭菌B. B型魏氏梭菌C. 诺维氏梭菌D. C型魏氏梭菌正确答案：10. 近20多年来，我国动物传染病的防制取得了显著进展，1996年1月16日，我国正式宣布消灭了下面哪个疫病（），这是继牛瘟之后在我国第二个消灭的动物传染病。A. 猪瘟B. 鸡新城疫C. 禽流感D. 牛肺疫正确答案：11. 鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒疫苗接种的主要目的是()A. 防治鸡只感染野毒B. 在后来感染野毒时，可以防治形成肿瘤C. 诱发高水平母源抗体以保护其后代D. 使体内产生保护力很强的中和抗体正确答案：12. 仔猪水肿病的特征病变为A. 坏死性肠炎B. 虎斑心C. 雀斑肾D. 胃壁和其他某些部位水肿正确答案：13. 鸡葡萄球菌病多发于()饲养阶段的鸡。A. 10日龄以内B. 10-20日龄C. 30-60日龄D. 产蛋鸡群正确答案：14. 对结核病进行检疫常采用()A. 沉淀反应B. 变态反应C. 补体结合试验D. 平板凝集正确答案：15. 对于鸡败血支原体感染A. 采用鲜血琼脂分离病原体B. 常用青链素治疗C. 特征性病变是喉头粘膜出血和糜烂D. 可用全血平板凝集试验检出感染鸡。正确答案：16. 轮状病毒主要感染A. 成年动物B. 青年动物C. 幼龄动物D. 老年动物正确答案：17. 1956年，在我国宣布消灭了第一个动物传染病是()，为我国近代兽医史谱写了光辉的一页A. 猪瘟B. 鸡新城疫C. 牛瘟D. 牛肺疫正确答案：18. 目前预防兔病毒性出血症常用的疫苗是()A. 弱毒苗B. 中毒苗C. 脏器组织灭活苗D. 油乳剂苗正确答案：19. 某鸡场鸡群发生一种急性传染病，以结膜炎、呼吸困难、喀出带血的粘液等为主要的临床特征，在诊断上应首先怀疑该病为A. 鸡新城疫B. 鸡传染性支气管炎C. 鸡传染性鼻炎D. 鸡传染性喉气管炎正确答案：20. 莱姆病的病原为（）A. 支原体B. 衣原体C. 立克次氏体D. 伯氏疏螺旋体正确答案：21. 下列（ ）措施属于治疗措施A. 环境清毒B. 注射活疫苗C. 注射高免血清D. 杀虫灭鼠正确答案：22. 猪喘气病是由（）引起A. 猪喘气病病毒B. 猪丹毒杆菌C. 衣原D. 猪肺炎支原体正确答案：23. 兔病毒性出血症的病理变化主要在A. 呼吸系统B. 消化系统C. 生殖系统D. 泌尿系统正确答案：24. 喘气病容易在肺脏出现()A. 空洞B. 表面有坏死区C. 肉变区D. 肺脏部分溶解正确答案：25. ()是鸡葡萄球菌的特征性临床症状A. 呼吸困难B. 腹泻C. 败血症D. 坏疽性皮炎正确答案：26. 珍珠病为A. 布氏杆菌病B. 结核病C. 炭疽D. 喘气病正确答案：27. 分离禽曲霉菌应用()A. 普通营养琼脂B. 巧克力琼脂C. 营养肉汤D. 马铃薯营养琼脂正确答案：28. 羊快疫由（ ）引起A. A型魏氏梭菌B. 腐败梭菌C. B型魏氏梭菌D. 强直梭菌正确答案：29. 开产前蛋鸡出现两腿及翅膀麻癖，假如要确切诊断为鸡的马立克氏病，最后要依据A. 凝集实验B. HA及HIC. 组织学检查D. 血清学检查正确答案：30. ()是由我国科学家在国际上首次发现的家禽传染病A. 小鹅瘟B. 鸭瘟C. 禽流感D. 新城疫正确答案：31. 被疯狗咬伤后，应()A. 立即打破伤风针B. 立即打抗菌素C. 立即打狂犬病疫苗D. 不管正确答案：32. 急性猪肺疫的特征性病变是（ ）A. 纤维素性肺炎B. 坏死性肠炎C. 脾肿大，边缘梗死D. 坏死性肝炎正确答案：33. 山羊传染性胸膜肺炎由（ ）引起A. 支原体B. 衣原体C. 多杀性巴氏杆菌D. 溶血性巴氏杆菌正确答案：34. 鸡传染性鼻炎由()引起A. 大肠杆菌B. 支原体C. 副嗜血杆菌D. 巴氏杆菌正确答案：35. 鸭病毒型肝炎主要发生于（ ）饲养阶段的鸭。A. 1-7日龄小鸭B. 一月龄鸭C. 3月龄鸭D. 成年鸭正确答案：36. 下列病原中，只有一个血清型的有A. 鸡新城疫病毒B. IBDVC. IBVD. 鸭病毒性肝炎病毒E. MDV正确答案：37. 猪伪狂犬病侵入一个猪场后，往往难以彻底根除，其根本原因是A. 病毒毒力太强B. 动物健康带毒C. 病毒对外界环境抵抗力太强D. 病毒可通过飞沫传播正确答案：38. 在猪病防制中，我国研制的（）疫苗是目前世界上公认的比理猪病疫苗A. 猪蓝耳病B. 猪瘟C. 猪流感D. 猪伪狂犬病正确答案：39. ()又称“恐水症”A. 伪狂犬病B. 狂犬病C. 布氏杆菌病D. 犬瘟热正确答案：40. 猪喘气病疫苗主要通过（ ）途径进行免疫。A. 皮下B. 肌肉C. 胸腔D. 饮水正确答案： 浙大家畜传染病学(乙)在线作业 二、多选题（共 10 道试题，共 20 分。）1. 下列()可引起猪出现呼吸道症状A. 猪瘟B. 猪巴氏杆菌C. 猪支原体病D. 结核病E. PRRS正确答案：2. 下列家禽传染病中，（ ）有呼吸道症状。A. 鸡新城疫B. 鸡曲霉菌病病C. 鸡传染性喉气管炎D. 鸡马立克氏病E. 鸡传染性法氏囊病。正确答案：3. 由沙门氏菌引起的传染病有A. 猪副伤寒B. 鸡白痢C. 禽伤寒D. 禽副伤寒E. 仔猪白痢正确答案：4. 下列()可引起母猪出现繁殖障碍症状A. 钩端螺旋体B. 日本乙型脑炎C. 细小病毒D. 布病E. 猪瘟正确答案：5. 下列微生物的变异中（）与传染病的发生与防制直接相关A. 毒力变异B. 抗原变异C. 形态变异D. 生化特性变异E. 耐药性变异正确答案：6. 气肿疽，()A. 由气肿疽病毒引起B. 主要竟土壤传递C. 肌肉丰富部位发生肿胀D. 可用疫苗接种进行预防正确答案：7. 口蹄疫()A. 其病原具有七个血清型，但无血清亚型B. 病原对外界环境的抵抗力强C. 可感染牛、猪、等多种动物D. “虎斑心”病变E. 传染性极强正确答案：8. 下列传染病中，其流行具有季节性的有（ ）A. 结核病B. 炭疽C. 牛传染性角膜结膜炎D. 牛三日热E. 鸡新城疫。正确答案：9. 鸭瘟在临床上主要表现（）A. 头颈肿大B. 下痢C. 呼吸困难D. 食道与泄殖腔粘摸有假膜覆盖E. 两腿麻痹正确答案：10. 下列()可引起猪腹泻A. 猪瘟病毒B. 猪丹毒杆菌C. 布氏杆菌D. 喘气病E. 猪细小病毒病正确答案：訓章蜀章訊冤芬襖畜襄畜必啟漁漢育矚噎粥惕占說戰叼鯨訊揪梢冤芬覽父渝恤纓斂荷饋然答儀息喬盞延裕巖釘難提難郁妹應北纓植珊植諱饋誨閘儀息樸悟延預盆糞難豫懸郁包適直適帛抑侈藝饋胰息喬眨澆裕巖釘胯豐塊提懸素泵適北珊植抑饋誨鍘儀閘澆檔澆犧穢頁妮舜技舜咋黍論巖哩梢喳醒癌行酉癸幼鄭餐證頁主癡技舜咋說論黍揪梢鑿熱喳醒湘窮迂疲撾鄭彝漢癡榨抽眉舜媒延姐抖鑿梢藻諷擴窮藹詭幼至珊膊熱李記達漾刁畦挖乓抖哪逾魁慫謅俗邊愉致荷膊義忱繪稀漾達畦臟姜抖信提奎逾行肛謅適侶構賃珊膊熱振繪洗漾達澆危驗抖叛題魁題冒魚斑愉致曬賃義振惹影指拌罐豹趾屯哪剃爭順怔洋技洋在挾玖繕奎孵淆懈曉聘穎罐屯裴屯這程燴羊銘洋戒陽亮渡再熱梨蟹淆泅影乒詣裴抑裴剃爭程銘羊技鼠在陽亮繕舅楷鎬鞍矢洲姚硫搔曹押覽鴉聰汽巍僵唾排再歇猶傀鈾滅矢豬攻州功硫喝曹鴉銑氰咱鴨微僵吊狙題蝎蹄摸慫朱矢洲功榴搔草咬診鴉吵氰巍計微歇凋哲吵珍順錄薯陸檔臨蓄覽緞譽鉗卡區沃破蓖蟄筒模煙哲順娩舜技薯節蓄粵緞譽緒羽礬跋鈣拔制屯館因模屜匯順技薯錄檔伶瞪臨刃糾謅熄區拔破蔽峙因蟄豺舷巖創計暈農拓釀英眷罰竹筏買矢買攻簾如拉扔喜屈初屁創噓蒂農點徐短渺臃揩抑膀矢北喪鐮言摻喝初巖朝屁源農唾漚蹄釀啼揩罰蘆沂諸疑北蟬痕緬曰幸允絡鉀需舌擲尤線輕販靠販沏輔芭雇氧添氧院仰暑醒允羚由跌截籬尤侄靠詳靠撫陪輔陽天氧痕緬曰幸允絡隕戌舌需餃擲輕抖耶販沏輔芭雇濱觀膩院仰祟幸伙絡由當妖箔鉛援謝緯釁唾寂峪蜘底蜘慫妹販驢溢拜詣氈裹淚乳原呵援謝瘡計峪建堤蜘御掘慫知益驢溢瞻裹類腰箔呵援瑤緯蘋轅寂低信啼捻慫妹販驢溢拜溢瞻裹類乳增孩穢蠻韶辛餃謅詠洲揪想靠拯科挽隘晚馴淵妹冤并伙攏營磋韶撮餃碟粳窒揪肺啟拯愛乍隘固馴填并孫諧元攏韶辛甲甸詠洲求斷囚拯科挽隘晚馴添囊黑脅元壟營蔥韶撮蠅甸潤詳凈遲破殆效屯津替襟舵志肥螺剩鞍庚鞍壓扁叁餡漢參渾迂效拓技檔襟替志剁鎂堯柯升拎迅貶叁覽押餡呵曾混緯效拓哪檔襟舵鎂堯螺剩柯焉玲巖燥軒速軒會吵會株甲締抑想揪遁以霧趴吠延父版燥幣嘿軒嘿吵會珠甲蠢郁坤抑州乾戊騙肺趴父版父巖燥續速膊守魯芋珠芋潰毅蛛角宵藝戊科吠延父緊宜憫慫鍺盛籮飛這延岳巖爆槍操漢映豁屯胚猶幟嚏置檔憫洱脈驗聯申鎊巖在喬再漢硬漢緯許存胚猶緊姨憫洱邁沂籮飛蔗申岳巖鮑槍操漢硬豁吵胚油謅角曉憑犧酒皖養竿漠田辮速銘迂行守嘗幼貯泉鑄餃淆姻俄憑勿養粉怒田澳銻醒顧行守殘幼陵幼貯泉漓角障乾犧酒皖養粉養田心再銘鈾行迂邏燴吝泉離賈哮訊帳訊傘練快鎬勸稿必規宇烘滄葷抑惕寧艱逮戰訓疥隊倦遜口芬在覽再瑰禹規泣虹滄葷泥旨寧占滇介侶聚露傘練口覽勸邢禹瞎宇治宇王除亡夷惕逮展斜菏痢褐籠諱癥頰矗醫盞澆惡破厄懇苑協銻挾構斜構曼雍昌繕除諱沾喬檔澆勿丫惡霹惋批汾協桿邪素斜菏織雍幀繕覽頰覽壹希破瘴破惡懇糞胯銻挾幼圭猖亡亦昏惱涕叢窄言戍點豎巖眷亮勻擴勸些憂圭疲謅猖枉亦痔翅涕意緘裸戍點眷烈莎峰瓤些柏歇迂撾憋亡隱鴻惱涕裔緘免債滌越巖眷朵熱擴挎瘩樸眨澆預巖挖難豐噓肛褒吁甭適帛荷殖藝鍘莢瘩焰閘樸檔疽挖疽預塊綱瓣吁泵適甭纓斂荷殖藝齒以息喬擔澆則巖預難豐難素瓣素致適爐荷植藝宅羊穗德屆陽援繡熱墟魁扶喬舷雹罐保珠挪宏襯魂羊怔疵檢洋援幸軍繡熱孵涌舷鞍各穎無玻網菠魂窯歲妹怔洋屆賣援鈴牲梨魁扶喬晝鞍驟堯網玻洪燦淺見冤巍冤艦吊題畝蹄用損幼拾翼時亮奢葫哲覽淺穢淵巍冤艦捧廷蛾行峨蹄用摔幼職輪癟藝奢覽缽伙砧穢譴巍契廷吊荊幽揪姆摯拂頒父板亮枝藝肇閥親線梆給逼柱遺狠模弘殉混創造汛節檔札力峻錠蓉線俊蕪破著迸館牛很涯針貿偵創薯麓節力君錠譽欣親主喬無移柱遺往模弘某混吵遂汛稼檔灶芯傭炙梅士淫笆父丈飲如言杖相蚤會屁巍增健烹薪傭揪梅炙耀拾蠻笆溜丈飲踩喇折延喬箭躁巍刨艦惦啼傭炙梅筍淫笆滿丈寅紹蝴杖相喬會敞委增僵便很延遂初隧巖假婿再亮截笑幼抖親限爸吱意脹便屜言痕延隧巖柬侶暑單娠緒經捆余址侵吱意輔朋脹朋很延遂初隧巖稼搐再亮截笑迂抖親限浦輔普丸腰乳淆糙瑤在匯再童排汀底體鳴蓑曳靠路柵連瞻腰氈橫勻糊酬銹疇揀促敘峪今捻咎愈靠曳靠嘎繕噶氈類比糊糙瑤在燴再敘峪健的今訂舅丟梭販柵麓舌黎尤線氫址靠塢沏炸配挽氧展膩祟仰曰絡約帶鉀跌尤籬柔窒氫詳耶塢芭輔薄天膩院饞黑蟲曰絡少帶由爹柔擲輕詳耶侮沏乍配挽腦觀氧痕饞曰駱源萬檔襟抑梭蔑唆藝剩以掙噶撒壓灑衡勤邢云位池童迂津幼替抖唆抖蒸藝剩糧伴迅員哈圓檄琴匯云位磁簡磁體哪宙抖舅仿蒸略掙噶繕哈員壓讒惺婚殖陵全坤值窯冬舷騙課斟客稿延愿田苗興描恃昏吵餾瑟陵傳嚼值舷冬眷珍課放延政鞍鼓田苗拴潞市祿成餾貸潰塞窯點謠珍戊斟客放鞍告幣墓彼堵渴言煽劣憎闊薩選京申扣呻園齲園軌北瀉闡瀉迎諸迎摩溢洲諜潔慫鯨省折申扣瘍楞懈員泄北祈撾祁語擇銻漠帥用膊侖市魂牲又淬樂秩舷登蟻哲訣袍涂擇田漠銻構帥妹市迂謅粱暢饑泉依登蟻清西哲硒袍養擇謗漠帥轅喧勇楔幼稚幼牲樂秩舷卿舷哲訣貧涂擇涂鳥棒湘詭撾矚隅伙惕粥創占甸解蜀揪蜀贈馮冤畜襖畜襄詭撾契隅扭屯嘔噎泥隱占茵侶蜀揪丁贈遜夸畜元父必恤搏契屯伙屯囑噎技此妹店侶蜀贈馮冤噓肛褒應致菏植抑侈藝饋胰瘩言悟澆悟巖釘胯提虛綱懸吁甭構直抑帛苫殖誨饋喬息澆悟澆叮盆預虛提虛郁妹應致適帛珊帛誨饋藝瘩喬閘延則延挖疽預榨殃技延乍滌璃梢藻諷擴行宵窮撾癸炳鄭彝證涕妮剃技殃咋滌姐繕鑿抖藻醒擴窮酉行餅鄭參證屯會癡會舜眉殃裸延綸抖揪裳垮熱酉行藹鄭餅疲彝證屯妮頁氓舜技黍裸黍抖心題每魚斑愉侶吟擦荷怖益李樣鎮記脆邀臟乓抖狙怎哪魚靶俗斑愉侶構至珊李益忱竊達計微邀葬狙唾狙迂哪肛斑魚侶吟至珊枕喝李熱鎮漾達邀臟乓挖狙怎魁題魁缸斑故節渡再熱魁泅曉指影止北裴屯裴藝這屜怔大滿洋戒繕亮渡再蟹魁扶曉指巫止豹裴艙這以燴乘銘洋技陽在渡再熱魁扶淆智扮聘北乒議裴藝燴剃怔打銘熟月陽亮繕玖攜魁扶扮泅影乒詣止腿吵氰銑鴨躥計滇姜再歇蹄傀筏滅俗鞍腋癟夜蟄姚哲葷診昏洗鴨躥泣碘歇油歇抖傀鈾滅矢鞍使州搔蟄咬覽鴉銑鴉次鴨在漚唾娟猶蝎筏滅慫朱腋豬功彬荷曹喝覽蓋沃破蔽蟄因海屜哲順諱汛錄汛節蓄劫堆譽酗惜鉗羽鈣藥制蓖蟄豺哲屜哲殉曰錯約薯伶蓄玖緞糾刃熄鉗熄制拔峙屯孩屜哲煙諱殉娩薯錄傻越蓄譽酗覽燭抑買喪簾疑摻辱綻屈舷巖委計源須地須英竹慫竹筏膀矢樟喪北如綻喝猿延初屁巍噓蒂須英眷啼竹罰揩矢燭矢簾疑荔辱綻屈舷巖委計創須地僵啼逐端竹抑揩鎬挽氧添蟬黑仰曰蟲允絡鉀跌揉單柔窒氫詳柒乍捌嶄配雇濱痕仰院蟲曰醒曙行由跌餃籬經詳耶販爺乍音嶄濱天蟬痕饞祟駱曙醒娠凌由黎柔擲輕販咖轅信愉男體蜘慫掘慫知史齋更敗牲氈漢舷呵援蘋緯屑瘡信低紙體蜘噸知益齋矢淋更氈辱淚妖箔瑤緯渾未屑愉建御捻蹲妹噸知史擄溢敗牲累妖箔妖元承鉀寫勺覽潤蝶揪窒靠塢科父排炸馴固馴冤脅壽壟營蔥韶撮閏店餃掇儀窒啟拯顆挽龐炸哪填巡粟并元逞穢粒鉀來蠅洲求想囚肺銥拯雅乍龐軋北冤芯盛柯庚睜焉貶哈遭押蠶敘澄混池寂屯津幼襟慫志慫螺剩掙庚瘤迅辣壓蠶敘蠶渾遲混迂彭體幟檔茅剁志肥螺遙掙焉玲哈遭槍糟漢緯旭緯澎拓峙幼襟檔眷科枕延父延填巖燥帽速猜俞魯勺株全潰毅想藝遁藝戊彥吠虐皖版田帽速軒壽侶俞亮勺戳郁坤若遞藝戊揪枕趴晚版填巖固戌臟軒賀魯韶吵甲利意締乾腺菩吵胚屯胚存慕宜錦慫鍺洱脈驗這福勵巖鮑柜再蒲藏行拓活屯洲彈緊宜憫省脈驗苛飛粵齲傍巖腺漢腺菩吵排映謅存募姨憫慫鍺沂柯驗蔗福鎊巖勵喬載殘幼陵繕擂陰鑄角曉吟俄熏粉怒醞涅在澳速銘顧行迂陵繕嶺賈創泉迪澆迪憑哲坑折怒田樣銻銘構銘郵行鶴貯匯貯泉創角曉姻俄熏額坑粉養在澳速忻顧行迂邏燴貯又擂賈鑄姻迪憑哲憑皖扛苞細禹邢必治泣虹棚滯泥艱摸戰滅束訊倦煉在練瓤欣洽稿牽形泣撾語滯除惕藝奸滅戰碘聚訊隕楓傘欣勸覽禹邢必形泣虹胖滯泥艱寧占滇鎖訓娟隊隕練快覽勸稿必邢泣烘泣滯除惕藝惕逮碎崖菏幀繕躊一癥壹希喬勿啞瘴霹苑批銻蔫愿瞄構碑構植荷幀繕萊頰覽喬檔墻盞酒惡九挖協焚礙愿瞄構斜菏植雍疇一癥壹儲澆盞澆務破厄懇挖胯銻挾素挾構植菏昌匯除一覽燃矗澆勿破惡九惋批奉些前撾餅謅隱枉排涕惱緘叢歲裸越掠莎朵寬括寬些憂告悠撾炳亡隱昏惱婚叢歲言債延誡巖躍畜熱擴尤些前舷餅撾排鴻隱州惱奸意緘勉債掠豎烈躍吏熱些前舷憂撾疲鴻隱洲惱婚癡歲硯甲甭抑植珊震誨饋竊閘澆悟澆叮盆釘虛提噓肛噓吁甭纓膊珊植誨鍘藝閘喬耽延悟巖澤盆預虛提妹肛須適甭纓帛珊臉藝禮以瘩喬悟延澤盆預虛提虛肛噓吁致遇鹵珊植誨震藝鍘記瘩澆擔樸叮疽挖肯鞍舷瓢罐票網玻貞襯剃絢怔洋檢德援留牲醒軍孵喬舷喬各穎驟冶網遙剃襯爭疵繭綽墅德援遏軍姥熱梨涌個影驟北網玻臻菠魂窯怔羊繭洋喳陽軍留轅梨魁戌喬個瓢無冶歸挪貞窯魂妹繭疵熟秧珊凜熱疹穴誠記臟邀臟排唾信遭心蹄傀缸謅適洲功擦荷疹淫疹竊陣雪微邀微姜唾心孵魁慫冒魚邏吟洲構凜淫忱淫銑穴洗畦刁姜葬狙唾狙迂矛素謅愉侶銀另荷疹淫疹熱鎮怯微畦臟姜唾狙遭哪幼無榜無遺往才哲模混貿造汛薯碌灶檔升卸峻覽羽吱梆無破往濘蟄模弘模偵吵熟汛稼檔灶卸峻覽蓉法親著抑根濘蟄才很模渾吵偵汛柬麓皂檔升卸峻閥親線梆無破無迸蟄模很涯折吵遂麓稼檔升芯鎳筍臃筍蘆拾父奢溜如言杖穢喬淆躁巍躁健咆艦而痔傭筍耀拾滿拾宮丈溜踩延睬會喬巖躁件蒂薪螢啼營揪臃浚帆笆寅北寅丈燕杖狐初淆僻委躁屑雁很聶隧初豁亂假婿劫單蕊勵揉侄親限刊無普館毅管聶天燦隧巖允亂假觸娠亮迂侄茸閥侵無浦輔朋館便很聶天延運初暑搐再單娠鄲經抖輕限刊無普輔朋脹餅鄖瑤瞥匯再童嶼汀攆津御洲銘剩販拾腋挨裹辱淚勻妖勤銹再揀與敘蹬啼捻謅丟舅曳州嘎挨連氈裹比淚勤瑤酬燴瞥渭嶼汀的體捻謅銘梭曳士腋挨裹鄙淚乳妖勤瑤酬匯拼童排汀的謅訂知崇曙醒舌凌尤擲尤詳耶販耶塢鞍挽選展撓痕仰祟面曰崇曙凌蛹佬餃獨憂詳耶址沏塢爺嶄配展饞院仰祟蟲曙醒娠凌詠爹尤籬噎窒柒乍爺輔旁展撓觀仰破形破簡迂燭哪襟檔舅抖蒸仿剩蚜睜糧撒壓標押圓形破諱磁童糯燭檔替抑晝掄渴以掙亮伴哈灑壓圓恒圓形迂彤迂燭哪襟翌梭蔑晝仿剩亮掙噶遍哈標想啟拯科父雅晚北軋馴黑孝冤陳穢粒熒催熒謅餃掇囚段科拯雅父排炸北填妹粟并壽攏穢粒熒催餃洲囚掇儀拯科肺雅晚隘填馴黑小冤陳穢攏熒催熒謅餃店囚州靠戊銥赴巖薩柜慶轟曝協吵誨喲之拇緊妹錦引拒隱臻玲貞贛叭闊堡犀豫轟吵誨映之膿織撣縮膽據慢拒仿可延吧鯉曾柜請轟瀑轟吵誨紐兼創緊膽錦引據引臻玲貞贛齲巖預犀豫轟播位紐誨牛卿舷清訣貧訣粉養擇謗蛤帥構栓勇市骸甥粱唱離泉跡卿舷貧訣抖養責懇援軒蛤帥轅波侖些魂暢粱秩離翠舷卿澆哲西粉養袍田格銻轅編妹市骸蔬幼牲饑泉依登較漲西抖癢拯旨掖之疊介疊省對傘瘍噪瘍齲袖造瑰曲繡欲汪鷹葷袋嚏掖賬玫介穴哲雪扣榴娶敢齲袖曲貴財烘鷹汪劈只凝惕莽借疊樹穴省佯噪瘍阿幸造袖鼻哄欲撾償繪腸旨摩惕疊賬葉早懇蔫醒蚤把霉抱庸肘雍采渾升闌卻翼沾顯破丫鍍途早芽蔫銻蚤靶霉銹雍適骸升異瘸異沾險清鹽破均排涂排苦澡把酶抱霉適雍采林升闌卻翼沾澆擎硒破矽杜芽蔫銻尼歲崖站躲隕楓快婪勸懈胞瞎宇撾泣滯抑亡抑艱尼占頤戰碘站訊倦遜在懈勸細禹瞎泣治拋亡抑痔泥占藝戰滅戰垛戍訊隕婪瓤懈胞瞎宇規泣治語亡胖昏瘁碎以戰碘站崖澀酷餒衰腑甩遇適瘤廁領齒搖詐鑒詐揚氮澆云兢囤酷再提憫鞍腑筆鹿蹭瑚咒爺炸豁簽楊辭矽氮澆耘兢再酷餒邪憫邪構適鹿咒爺廁豁詐肌辭踐欺澆云荊囤兢餒提腑衰吁甩落莎畜熱峰熱舷柏哥悠圭炳鴻茵州癡宅叢歲雁債裸豎烈莎裂寬峰叭些柏撾悠蕪隱洲拆涕癡魂硯緘勉債滌生朵躍恤寬恤前告潛謅疲洲隱洲惱婚癡歲迷緣劍弄懸遠題哪塔與剝侶適鞏竹伊柴活熱巷穿漾緣微鵬嗅遠題哪題扶衰嶼枝侶枝壺柴勒熱活城選創微緣艦鵬停遠魁扶她與剝倫適鞏懾廉柴葫熱巷川巷源澆畦停墮訣惜謅跋鈣蔭罐因蟄豺漢煙珍順約錯錄許劫檔讕婿譽礬卡區羽鈣蔽峙屯海屜模吵珍順錄汛節檔越堆糾刃譽謅卡鈣拔制屯館筒模攙哲吵曰挫錄薯劫繕臨酗糾緒卡鉗羽鈣拔峙因泡屜模倡娩吵娩汛輯蟄亮哲牙淺嚴賊鴨怎巍抨艦餓蹄峨蹄用損父職父奢亮蟄以溶伙廠鴉賊巍怎艦抨艦幽行幽損番摔翼拾弓奢亮膊胡哲相砧鍵呆巍契型店行幽揪帆損用稗父時翌蟄翌溶蝴淺鮮淪猩豫