国家基金标书rAAV-hIL-10的构建及诱导可耐受肝方法的实验研究

国家自然科学基金申请书申请代码：C03030204受理部门： 收件日期：受理编号：第 11 页 版本1.003.796国家自然科学基金申 请 书您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了资助类别：国家杰出青年科学基金亚类说明：国家杰出青年科学基金附注说明： 项目名称：rAAV-hIL-10 的构建及诱导可耐受供肝方法的实验研究申 请 者：孙均重 电话： 13625418797 依托单位：山东中医药大学 通讯地址：山东中医药大学5号楼401室 邮政编码： 单位电话：0531-2622196 电子邮件：sunjunzhong166. 申报日期： 2006年5月9日国家自然科学基金委员会基本信息1YThcng7申 请 者 信 息姓名性别男出生年月1975年11月民族汉族学位博士职称博士生主要研究领域 电话13625418797 电子邮件sunjunzhong166. 传真 个人网页 工作单位山东中医药大学 /针推学院在研项目批准号 依托单位信息名称代 码25001405 联系人齐冬梅 电子邮件qidm 电话0531-2622196 网站地址http：/ 合作单位信息单 位 名 称代 码25000101 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别国家杰出青年科学基金 亚类说明国家杰出青年科学基金 附注说明 申请代码C03030204:消化系统内科学 基地类别 预计研究年限2006年5月 2008年12月研究属性应用基础研究 申请经费22.0000万元摘 要(限400字)：本课题拟克隆人白细胞介素-10 基因片段，构建携带人白细胞介素-10 基因的重组腺相关病毒载体，采用夹闭灌洗和循环灌洗两种转染方法，在移植前不同时间靶向性定位整合于肝移植供体器官，以期通过人白细胞介素-10 的分泌和不成熟树突状细胞迁徙来降低排斥反应，延长移植物的存活期并诱导免疫耐受。通过混合淋巴细胞培养、大鼠存活期、肝脏功能、血清细胞因子、hIL-10 蛋白及基因表达水平的监测、嵌合细胞的检测等，确定基因转染修饰供体器官的最佳时间和有效方法，观察其诱导免疫耐受的有效性和安全性，探讨其诱导嵌合性的机制，为转基因诱导免疫耐受在大动物及临床移植应用奠定实验基础。关 键 词(用分号分开，最多5个)人白细胞介素-10；肝移植；免疫耐受 项目组主要成员（注: 项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）11956-7-15 男教授学士山东中医药大学 053188131713 wangdqq 项目负责人 10 21972-6-12 男副教授博士山东中医药大学 053182116005 wangyong156 动物模型建立 10 31964-10-8 男副教授学士山东中医药大学 053182156736 ch1964 免疫耐受及安全性检测 10 41970-4-26 男副研究员学士山东省医学科学院 053182156486 fansh 病毒载体的包装鉴定 10 51981-9-20 女助教硕士山东中医药大学 053182116547 liuxiaojuan 协助实验 10 6789总人数高级中级初级博士后博士生硕士生6132说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费18.500018.51.科研业务费3.50003.5（1）测试/计算/分析费1.5000软件、统计学分析及相关实验室分析费用（2）能源/动力费0.5000 液态氮及运输费等（3）会议费/差旅费1.0000学术交流及国内国外会务费（4）出版物/文献/信息传播费0.5000审稿费及版面费等，查新检索费（5）其它2.实验材料费12.000012（1）原材料/试剂/药品购置费9.0000载体、各种试剂盒、TRIZOL、柱式胶回收、脂质体转染、单抗、ELISA、UW（2）其它3.0000耗材、实验动物及实验动物饲养费3.仪器设备费2.00002.0（1）购置0.5000微量加样器等（2）试制1.5000细胞培养液、进口胎牛血清等4.实验室改装费1.0000改善实验条件5.协作费二.国际合作与交流费1.50001.51.项目组成员出国合作交流1.50002.境外专家来华合作交流三.劳务费1.0000人员劳务费四.管理费1.0 学校科研管理费，项目组织实施费合 计22.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000报告正文（一）立项依据与研究内容 1、项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。肝移植目前已成为治疗终末期肝脏疾病的有效手段，然而仍需长期应用免疫抑制剂来预防和治疗排斥反应，这些药物不仅具有一些严重的副作用，而且可能会抑制免疫耐受的产生，使患者必终生应用免疫抑制剂。移植物排斥反应的本质是免疫应答，探索控制移植后的排斥反应，提高移植物的存活率，一直是移植免疫学家致力攻克的堡垒。近年来器官移植已经取得重要进展，移植前的组织配型、供体的预处理以及移植部位的选择等手段明显减轻了移植免疫排斥反应，各种免疫制剂的长期应用进一步控制了排斥反应。但由于无关人群中，HLA 相同的个体十分罕见，而免疫抑制目前的方法有许多明显的副作用，慢性移植排斥也没有有效控制的方法，因此临床器官移植中抗移植排斥的问题仍没有彻底解决。目前认为解决这些问题的关键是在于诱导受者对供体组织器官的免疫耐受。90 年代以来，随着基因转移技术的迅速发展及基因治疗理论和实践的不断完善，使基因治疗成为在分子水平研究移植免疫耐受的重要手段，移植中应用基因治疗有许多优越性，活体内基因转导不仅可以产生持续的生物调控基因产物的表达，而且能在低温下进行而不影响肝脏的功能（1）。免疫耐受是指免疫系统接触抗原后产生的特异性无应答或低应答性。Medawar （1953 年）（2）首先报道了给新生鼠注射同种淋巴细胞诱导获得性移植免疫耐受性，这极大地推动了移植免疫耐受研究的进展。近年的研究表明通过基因治疗阻断协同共刺激信号以及建立受体体内微嵌合体在诱导移植免疫耐受方面发挥重要作用（3，4），然而目的基因转染载体的选择及移植供体基因修饰的最佳时间和有效方法仍存在很大争议。在器官移植中，细胞因子构成了一个非常复杂的网络结构并发挥着相互作用。1989 年Fiorentio 等发现TH2 细胞株D10.G4.1 能分泌一种抑制TH1 细胞功能的因子白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）。有研究表明rhIL-10 可抑制Kupffer 细胞产生中性粒细胞特异性的化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractant ，CINC）而减少中性粒细胞的浸润和缺血再灌注损伤的程度，延长大鼠肝移植后生存时间，夏家红发现IL-10 参与调节移植排斥反应，其表达水平与移植物存活时间成正相关。Deng 等应用IL-10 和TGF-基因，在异种胰岛移植模型中延长了胰岛移植物的存活时间。最近Shinozaki（7）等研究也表明IL-10 能抑制大鼠肝移植后排斥反应并提高移植物存活期。IL-10 是由多种细胞产生的具有多样性生物学活性的细胞因子，可降低抗原递呈细胞MHCII 类抗原表达，IL-10 还可抑制IL-2、IFN-r、TNF 等细胞因子的合成，并且可以降低ICAM-1 等黏附因子的表达和维持树突状细胞的幼稚状态，从而在降低移植物排斥反应和诱导受体体内的GM 。许多研究表明DC 表型在嵌合水平方面发挥重要作用，以往多在供体器官灌洗过程中导入目的基因，近来研究发现病毒载体介导的目的基因表达一般2-3 周后达到高峰，而器官移植排斥反应多发生在移植术后的一周，所以治疗性目的基因的表达与排斥反应的发生往往不同步，因此选择有效的目的基因转染方法和最佳的基因导入时间至关重要。DC 几乎存在于哺乳动物的所有器官中，未成熟DC 可长期存在于非淋巴器官中，具有很强的抗原识别、捕捉和处理能力，成熟DC 的T 细胞刺激能力大大增强，从而启动T 细胞抗原特异性增殖并激活免疫应答。在器官移植中，异体移植物发生的免疫应答反应十分复杂，在致敏和识别反应过程中起关键作用的是抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC）。其中树突状细胞（dentritic cell, DC）以其强大的专职性抗原递呈能力而备受注目8。人们对不同组织来源的DC 表型分析表明，刚从非淋巴组织分离出来的DC 为不成熟的DC，无法激活同种异型的T 细胞。不成熟的DC 与成熟的DC 相比其表达的MHC 分子很少，另外表达的两种共刺分子B7 1 和B7 2 也很少，这样不成熟的DC 无法激发同种异型的T 细胞免疫反应。有文献报道从小鼠骨髓分离，在体外经粒细胞巨噬细胞集落刺激因子型转化生长因子CSFTGF）培养、扩增的DC 前体细胞在体外不能激发异体T 细胞的混合淋巴细胞反应（MLR）。这种细胞改变了供者与受者之间的免疫反应过程，在宿主体内形成了一个较高的“微嵌合性”（microchimerism）水平10 能的形成与诱导微环境关系密切，最近的研究更加集中在通过各种方式改变DC 分子表达而获得耐受性，使DC 能最大限度地应用于移植排斥反应的治疗。目前非病毒基因转染的方法简单易行、安全，但转染效率不甚理想且基因表达为瞬时的。大多数野生型病毒对机体都具有致病性，因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面 ,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20 年来，只有少数几种重组DNA 病毒如腺病毒、腺相关病毒和重组RNA 病毒如逆转录病毒、短病毒（Lentiviral）等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用，其优点是转染效率高，但缺乏确切的组织特异性和靶向性。逆转录病毒将治疗基因转入靶细胞并将外源基因整合入基因组，实现目的基因持久稳定的表达，但只能感染分裂相的细胞，容量有限，更难以克服的是随机整合，在理论上有使靶细胞发生插入突变和激活原癌基因或使抑癌基因失活的可能。Donahuc RE 等用缺陷型逆转录病毒感染8 只猴的脊髓细胞再移植回体内，有3 例出现恶性T 淋巴瘤，说明逆转录病毒作为载体存在潜在的危险。短病毒可同时感染分裂或非分裂相细胞，可应用于不同细胞类型的基因转移。目前应用的载体都有着不同的缺陷，理想的载体应为安全、高效、稳定、特异、可控及简便易行的载体腺体相关病毒（adeno-associated virus，AAV）独特的生物学特性使其成为许多基因治疗的理想载体，目前，在rAAV 载体的制备、基因治疗中基因型的选择以及扩大其包装容量方面都有了很大进展（11，12，13，）。rAAV 是微小病毒科家族的成员之一，是一种单链线状DNA 病毒。约80%的成年人感染过rAAV，但尚未发现该病毒与人的任何疾病相关。rAAV 是目前已知的唯一对人无致病性的病毒，可感染非分裂细胞，并且对分裂期细胞和静止期细胞具有同样的感染能力，宿主范围广，可整合于靶细胞基因组，或以附加体的形式存在，有利于目的基因的长期、稳定的表达，由于其细胞介导的免疫性低，机体产生的目的基因抗体的可能性小，具有低免疫原、免疫毒的特点。目前，本课题组已完成hIL-10 基因的克隆、鉴定和逆转录病毒载体的构建（14），并且在肝移植前转染供体肝脏，大大降低了大鼠肝移植后排斥反应的发生和程度（15，16）。虽然hIL-10 应用器官移植的基因治疗，在降低移植物排斥反应和提高存活期方面均取得令人鼓舞的成绩，但成功诱导免疫耐受尚未成熟，我们分析免疫耐受可能是多种因素共同作用的结果，并且与目的基因载体的选择和基因转染的效率密切相关，基因治疗研究中，重组逆转录病毒和重组腺病毒在基因转移载体中一直占主导地位。但近年来这一情况有所改变，用AAV 作基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。AAV 具有以下特点：（1）安全性好。迄今从未发现野生型AAV 对人体致病; 重组AAV 去除了野生型AAV 基因组的96%，进一步保证了安全性；（2） 宿主范围广。不仅可转导分裂细胞，而且可转导静止期细胞；（3） 野生型AAV 可整合到人基因组19 号染色体q 臂的特定位置,利用这一特点,有可能研制出具有特异性整合功能的AAV 载体;（4） AAV-2 的基因组仅4681 个核苷酸, 便于用常规的重组DNA 技术进行操作；（5） 物理性质稳定。在60C 不被灭活, 能抵抗多种有机溶剂和离子去污剂的作用; （6） 重组AAV（rAAV）病毒可长期稳定地表达外源基因, 构建hIL-10 重组腺相关病毒载体可能发挥更有效的治疗作用（17 ）。基因转染的效率主要取决与转染方法、病毒滴度和灌注时间，本研究我们尝试应用一种全新的夹闭灌注转染技术，它弥补了注射或循环灌洗后病毒载体很快被循环血液所稀释及补体清除的不足，而且采用门静脉和肝动脉双重灌洗，增加了病毒载体的浓度及与供肝的有效作用时间，进一步提高了供肝转染的效率，另外，移植前的预处理可以减少病毒感染其他细胞或肝外组织，不易激发机体对病毒的免疫反应，有助于延长目的基因的有效表达时间。腺相关病毒载体包装、纯化技术的日益更新、成熟为我们的实验提供了有利的支持。本研究意在构建新型的携带hIL-10 基因的rAAV 载体，并且采用夹闭灌洗和循环灌洗两种转染技术，在移植前的不同时间特异性地转染整和作用于移植供体肝脏，肝脏中含有大量的树突状细胞，hIL-10 基因修饰供体器官的同时也转染DC，而hIL-10 基因可维持树突状细胞的幼稚状态，有助于移植后在受体内诱导嵌合状态，同时发挥hIL-10 和树突状细胞的双重作用，以期降低排斥反应、延长移植物存活并诱导免疫耐受，探讨基因转染供体器官的最佳时间及有效方法，确定其诱导免疫耐受的有效性和安全性，这一技术的成熟和完善将有助于对降低器官移植排斥反应、诱导免疫耐受方法和机制的深入研究18，也为将来在大动物实验和临床应用的开展奠定实验基础。参考文献: 1、Chang GJ，Liu T，Feng S，et al.Targeted gene therapy with CD40Ig to induce long-term acceptance of liver allografts. Surgery，2002，132：149-156. 2、Thomson AW et al. Microchimerism, dentritic cell progenitors cells in transplantation Tolerance. Stem Cells, 1995,13:622-639. 3、Adam S. Bartlett, John L. McCall, Rohan Ameratunga, et al. Costimulatory Blockade Prevents Early Rejection, Promotes Lymphocyte Apoptosis, and Inhibits the Upregulation of Intragraft Interleukin-6 in an Orthotopic Liver Transplant Model in the Rat . Liver Transplantation, Vol8, No5(May),2002, pp 458-468. 4、Chang A，Blum M，Blair K et al. Prolonged anti-CD40 ligand therapy improves primate allograft cardiac survival(abstr) . Transplant Proc , 1999,31:95. 5、邹小明，杨维良，袁友萍等. 重组人白介素10 抑制肝移植后再灌注损伤和排斥反应的探讨.中华外科杂志，2000,38（11）：876. 6、Deng S，Ketchum RJ，Yang ZD，et al. IL-10 和TGF-gene transfer to rodent islets: effect on xenogenetic islet graft survival in naive and B-cell deficient mice. Transplant Proc,1997,29:2207-2208. 7、Shinozaki K，Yahata H，Tanji H，et al. Allograft transduction of IL-10 prolongs survival following orthotopic liver transplantation. Gene Therapy,1999,6:816-822. 8、Ichim TE，Zhong R，Min WP. Prevention of allograft rejection by in vitro generated tolerogenic dendritic cells. Transpl Immunol. 2003,11(3-4):295-306. 9、LuL et al. Propagation of dentritic cell progenitors from normal mouse liver using GM-CSF and their maturational development in the presence of type-1 collagen. J Exp Med .1994;179:1823. 10、Starzl TE et al. Cell migration, chimerism, and graft acceptance. Lancet. 1992; 339:1579-1582. 11 、Xiao X, Li J, Samulski J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 1998. 72:2224-2232. 12、Zhou XH and Nicholas Muzyzca. In vitro packaging of adeno-associated virus DNA. J Virol. 1998.72:3241-3247. 13、伍志坚，吴小兵，侯云德.具有AAV 载体包装功能的重组HSV 的产生. 科学通报. 1999.44（5）：506-509. 14、邰升、张新宇、胡占良等.人白细胞介素-10 基因的克隆与逆转录病毒载体(MSCV-hIL-10)的构建.生命科学研究:2003 年中国博士后生命科学学术研讨会暨院士论坛.2003.11:176-179. 15、邰升,陈大志,迟强等. 人IL-10 逆转录病毒载体的构建及对大鼠混合淋巴细胞培养的影响. 中华新医学,2002,3(6):492-494. 16、邰升,陈大志,迟强等. 人IL-10 逆转录病毒载体的构建及对大鼠原位肝移植存活的影响. 中华肝胆外科杂志,2003,9(2):91-94. 17、Zhen-Fan Yang， Xiao-Bing Wu， Tung-Yu Tsui et al. Recombinant Adeno-Associated Virus Vector: Is it Ideal for Gene Deliuery in Liver Transplantation? Liver Transplantation ,2003,9(4): 411-420. 18、 Fandrich F, Ruhnke M, Dresske B, et al. Tolerance-inducing strategies in transplantation surgery-current status and perspectives. Langenbecks Arch Surg. 2003 ，Sep； 18 Epub ahead of print.2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。A、 研究主要内容1. 大鼠原位肝移植模型建立（改进的缝合法）我们在Kamada 法建立大鼠原位肝移植模型的基础上加以改进，重新设计血管套接（cuff） 的结构，同时改进了经典方法的游离顺序及吻合方式，缩短无肝期并大大提高了模型的成功率，建立稳定的大鼠原位肝移植模型。2. 构建hIL-10 cDNA 质粒载体（pSNAV-hIL-10）以人外周血单核细胞RNA 为模板，经RT-PCR 扩增获得hIL-10 基因片段，将hIL-10 目的基因正向插入pSNAV 多克隆位点，连接转化后，制备pSNAV-hIL-10 重组质粒，采用酶切和测序两种方法鉴定pSNAV-hIL-10 重组质粒。3. 构建携带hIL-10 基因的重组腺相关病毒载体（rAAV- hIL-10 ）并获得高滴度产毒细胞系将获得具有完整表达盒的rAAV 载体质粒转染BHK-21 细胞，经G418 选择培养后得到了rAAV-hIL-10 的载体细胞株，细胞培养后生产rAAV ，浓缩、纯化后获得高滴度的产毒细胞系。4. 诱导可耐受供肝方法的研究大鼠原位肝移植前选择不同时间分组采用夹闭灌洗或循环灌洗的方法转染rAAV- hIL-10 和rAAV-LacZ 至供体肝脏，进而确定最佳的目的基因转染时间和有效的转染方法。5. rAAV- hIL-10 诱导免疫耐受的研究通过大鼠存活时间、血清细胞因子检测、肝脏组织学和免疫组化检测、以及肝脏功能的改变，探讨rAAV- hIL-10 诱导免疫耐受的有效性和安全性。通过嵌合细胞的检测初步探讨rAAV-hIL-10 诱导免疫耐受的可能机制。B、研究目标构建携带hIL-10 基因的重组腺相关病毒载体，并获得高滴度产毒细胞系，移植前不同时间不同方法成功转染供体肝脏后，以期获得有效的细胞因子表达，确定基因转染的最佳时间及方法，同时探索其诱导免疫耐受的有效性和安全性。C、拟解决的关键问题：（1） hIL-10 基因腺相关病毒载体的构建（2） 高滴度产毒细胞系建立及滴度测定（3） 最佳的基因转染时间（4） 有效的供肝转染技术3、采取的研究方案及可行性分析。、研究方法：1、分子生物学技术：基因克隆、基因转染、细胞培养、RT-PCR 2、显微外科技术：动物模型建立3、形态学研究方法：光镜与电镜、免疫组化4、生化分析：肝功能测定、ELISA 检测 B、技术路线和实验方案1、大鼠原位肝移植模型的建立采用改进的缝合法，将静脉套管口改为略成角度的楔形，套管口径根据相应血管外径而定，采用腹主动脉灌洗，8-0 丝线只缝合肝上下腔静脉的静脉壁，单人操作，建立Wistar-SD 大鼠的稳定原位肝移植模型。2、人IL-10 克隆与鉴定采用人外周血单核细胞提取总RNA，依Gene Bank 检索人IL-10 序列设计合成引物，克隆人IL-10 基因片断并测序鉴定。3、构建pSNAV-hIL-10 重组质粒 IL-10 基因片断经双酶切后定向插入pSNAV ，制备感受态细菌，连接产物转化后，碱裂解法小量提取重组质粒，经酶切和测序鉴定正确后，纯化并回收质粒。4、 rAAV- hIL-10 病毒扩增与滴度测定将获得具有完整表达盒的rAAV 载体质粒转染BHK-21 细胞，经G418 选择培养后得到了rAAV-hIL-10 的载体细胞株， BHK-21 细胞的倍增时间短，细胞易于培养，我们用表达AAV2 Rep 和Cap 的重组HSV-1 感染携带AAV 载体成分的细胞株，可实现rAAV 的大规模生产。采用这样的生产系统，每个细胞可产生4001000 TU 的rAAV 。利用AAV 能抵抗氯仿的特性，采用“氯仿处理PEG/NaCl 沉淀氯仿抽提”的三步浓缩、纯化方法，获得高滴度的产毒细胞系。5、采用夹闭法和循环法分别在不同时间rAAV- hIL-10 转染供肝分别于移植术前周，周，天，天，供体获取时灌洗转染供肝：组1 液（空白组）组2 rAAV-LacZ 组（对照组）组3 rAAV- hIL-10 组（耐受组）6、 rAAV- hIL-10 的致耐受性与安全性a、排斥反应程度：病理学评分法b、大鼠免疫指标的观察：i. 大鼠存活期：观测大鼠营养及体重变化ii. hIL-10 蛋白表达水平检测：ELISA，Western-blot iii. 血清细胞因子检测：IL-2 、IFN-r、IL-10、TGF-、Granzyme B 等 肝脏组织学及免疫组化检测：CD4、CD8、CD80、CD86 等v. hIL-10 基因表达水平检测：RT-PCR 法c、移植肝脏功能改变：AST ALT LDH 7、嵌合性检测 a、免疫组化和流式细胞仪检测供、受体源性细胞C、可行性分析：1、本课题组在大鼠原位肝移植模型方面作了大量工作，可采用改进的三套袖法及缝合法成功构建大鼠原位肝移植模型。2、课题负责人博士期间成功克隆hIL-10 基因片断并构建逆转录病毒载体（MSCV-hIL-10），hIL-10 生化本质及基因表达研究十分清楚，重组腺相关病毒的生物学特性已被深入了解，其转染的长期稳定性与安全性为本研究提供了理论基础，。3、本实验室拥有良好的技术设备和优良的实验环境。4、本课题负责人参与国家自然科学基金钙调磷酸酶对环孢素A 肾毒性的影响(30170897) 和留学归国人员基金hIL-10 基因转染延长大鼠原位肝移植后存活的研究(LC02C16)，具有良好的实验基础。4、本项目的特色与创新之处。（1）采用移植前rAAV-hIL-10 基因靶向性转染肝脏，可望获得高效的细胞因子表达作用（2）首次采用夹闭灌洗转染技术观察移植实验（3）通过rAAV-hIL-10 基因移植前供肝转染技术的量化研究，确定最佳的基因转染时间和方法，是器官移植基因治疗的效果由质到量的转变（4）基因治疗诱导免疫耐受为特异性免疫耐受诱导开辟新领域5、年度研究计划及预期研究结果。年度研究计划及预测进展2006年5月-2006 年11月1、人IL-10 的基因克隆与鉴定2、构建hIL-10 cDNA 质粒载体（pSNAV-hIL-10） 2006 年12月-2007年5月1、 hIL-10 腺相关病毒病毒载体的构建（rAAV- hIL-10） 2、 hIL-10 腺相关病毒载体高滴度产毒细胞系建立3、病毒滴度的测定4、辅助病毒检测2007 年6月-2008 年5 月1、建立分组肝移植模型2、移植前不同时间两种方法转染供肝3、指标检测2008 年6月-2008 年12 月1、综合整理，分析实验结果，撰写论文2、课题总结，申报成果预期研究成果（1）确定最佳的rAAV-hIL-10 基因导入时机和最有效导入方法及技术（2）确定基因治疗诱导免疫耐受的有效性及安全性（3）发表有影响期刊论文2-5 篇（二）研究基础与工作条件1、工作基础1) 2000 年开展人胚甲状旁腺细胞移植的动物实验及临床研究，成功完成人胚甲状旁腺细胞的培养和临床移植，为培养克隆IL-10 和CTLA-4Ig 基因所需外周血单核细胞奠定了细胞培养的基础王道全等人胎甲状旁腺细跑培养形态与功能的研究. 山东中医药大学学报,2000,34(6);409-411 Chun Song,Yimin Song,Benjiang Ma,Sheng Tai,Chunfang Song. The Six Basic Sciences Symposium of The Transplantation Society.August 25-29,1999 2) 2001 年参与开展系列人胚细胞库的建立及临床应用的研究,获卫生部及省科委重大项目课题基金资助3)2001 年攻读博士期间采用改进的缝合法和袖套法成功建立大鼠原位肝移植模型，完成大鼠原位肝移植模型200 余例，可为移植排斥反应及移植免疫耐受的实验研究提供稳定的动物模型4)2002 年完成博士课题MSCV-hIL-10 的构建及延长大鼠原位肝移植存活的研究，成功克隆hIL-10 基因片断并构建逆转录病毒载体（MSCV-hIL-10），MSCV-hIL-10 转染供体肝脏后，大鼠存活期明显延长，急性排斥反应轻微，证实IL-10 在抑制排斥反应和诱导免疫耐受方面发挥重要作用，为移植免疫耐受的基因诱导提供了新思路5）发表论文 孙均重,陈大志,迟强等.人IL-10 逆转录病毒载体的构建及对大鼠混合淋巴细胞培养的影响. 中华新医学,2002,3(6);492-494 王勇,孙均重,迟强等.人IL-10 逆转录病毒载体的构建及对大鼠原位肝移植存活的影响. 中华肝胆外科杂志,2003，9（2）：91-94 邰升，张新宇，孙均重等.人白细胞介素-10 基因的克隆与逆转录病毒载体的构建.2003 年中国博士后生命科学学术研讨会暨院士论坛2、工作条件1) 拥有细胞培养实验室，配备细胞培养和分子生物学实验的整套设备2) 拥有动物实验中心及动物手术室3) 拥有先进的生化检验实验室4) 拥有分子生物学实验中心（遗传学实验室）3、申请人简历孙均重：1975年11 月29日生于河南省邓州市，1995 年7 月毕业于河南中医学院中西结合临床专业，1995 年7 月考取哈尔滨医科大学第一临床医学院普外科攻读硕士研究生，2000 年9 月考取哈尔滨医科大学第二临床医学院普外科攻读博士研究生，2002 年7 月留在山东中医药大学第一附属医院工作。近期发表论文: 1.孙均重,宋民,刘晓娟等.人胎甲状旁腺细跑培养形态与功能的研究. 哈尔滨医科大学学报,2002,34(6);409-411 2.孙均重,陈大志,孙文英等. HBV-DNA 阳性患者肝移植后HBV 再感染的预防及治疗体会 (附2 例). 中国现代医学杂志, 2003,11(7);71-72 3.王道全,孙均重,单世光.活体部分肝移植的技术进展. 肝胆胰外科杂志,2003,13(3); 167-169 4.孙均重,邬晶,迟强等.重症胰腺炎并发消化道大出血5 例临床分析. 中华新医学,2004,3(3);221 5.程勇,孙均重,孙世波等.HBV-DNA 阳性患者肝移植的治疗体会(附1 例). 中华新医学,2005,3(4);317-318 6.孙均重,陈大志,刘晓娟等.人IL-10 逆转录病毒载体的构建及对大鼠混合淋巴细胞培养的影响. 中华新医学,2006,3(6);492-494 7.孙均重刘晓娟,范圣华等.人IL-10 逆转录病毒载体的构建及对大鼠原位肝移植存活的影响. 中华肝胆外科杂志,2003，9（2）：91-94。签字和盖章页(此页自动生成,打印后签字盖章) 申 请 者：孙均重 依托单位：山东中医药大学 项目名称：rAAV-hIL-10 的构建及诱导可耐受供肝方法的实验研究 资助类别：国家杰出青年科学基金 亚类说明：国家杰出青年科学基金 附注说明： 申请者承诺： 我保证申请书内容的真实性。如果获得基金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 项目组主要成员承诺： 我保证有关申报内容的真实性。如果获得基金资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。编号姓 名工作单位名称项目分工每年工作时间(月)签 字1王道全 山东中医药大学 项目负责人 10 2王勇 山东中医药大学 动物模型建立 10 3程勇 山东中医药大学 免疫耐受及安全性检测 10 4范圣华 山东省医学科学院 病毒载体的包装鉴定 10 5刘晓娟 山东中医药大学 协助实验 10 6789依托单位及合作单位承诺： 已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守国家自然科学基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组成员以及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规定及时报送有关材料。依托单位公章 合作单位公章1 合作单位公章2 日期： 日期： 日期：