荧光显微镜原理

各位老师、同学：按照上次组会的安排，今天下午我将结合荧光分析仪向大家简单 的介绍一下荧光的原理和具体的实际操作过程， 时间安排在下午 3:30 （京时），地点在 510（荧光室，我会提前约好拿到钥匙） ，相关内容 大概如下：1. 荧光的基本原理2. 实际的操作过程3. 几个常见的问题：a. 如何选择合适的激发波长？b. 狭缝宽度是如何确定的？c. 荧光量子产率测试的一般流程 请有兴趣的师生按时参加。荧光显微镜原理及应用（一）荧光显微镜的原理和结构特点 ：荧光显微镜是利用一个高发光 效率的点光源， 经过滤色系统发出一定波长的光 （如紫外光 3650入或 紫蓝光 4200入）作为激发光、 激发标本内的荧光物质发射出各种不同 颜色的荧光后， 再通过物镜和目镜的放大进行观察。 这样在强烈的对 衬背景下， 即使荧光很微弱也易辨认， 敏感性高，主要用于细胞结构 和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的基本构造是由普通光学 显微镜加上一些附件 （如荧光光源 、激发滤片、 双色束分离器和阻断 滤片等 ）的基础上组成的。荧光光源般采用超高压汞灯（50 一200W） ，它可发出各种波长的光， 但每种荧光物质都有一个产生最强 荧光的激发光波长 ，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝 色和绿色激发滤片） ，仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而 将其他光都吸收掉。 每种物质被激发光照射后， 在极短时间内发射出 较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱， 为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断 （或压制 ）滤光片。它的 作用有二： 一是吸收和阻挡激发光进入目镜、 以免于扰荧光和损伤眼 睛，二是选择并让特异的荧光透过， 表现出专一的荧光色彩。 两种滤 光片必须选择配合使用。荧光显微镜就其光路来分有两种：1透射式荧光显微镜 : 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发 荧光的。 常用暗视野集光器， 也可用普通集光器， 调节反光镜使激发 光转射和旁射到标本上 这是比较旧式的荧光显微镜。 其优点是低倍 镜时荧光强， 而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱 所以对观察较大 的标本材料较好。2落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不 同处是激发光从物镜向下落射到标本表面， 即用同一物镜作为照明聚 光器和收集荧光的物镜。 光路中需加上一个双色束分离器， 它与光铀 呈 45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生 的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物 镜，反回到双色束分离器， 使激发光和荧光分开， 残余激发光再被阻 断滤片吸收。如换用不同的激发滤片双色束分离器阻断滤片的组合插块， 可满足不同荧光反应产物的需要。 此种荧光显微镜的优点是 视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。（二）荧光显微镜使用方法1打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。 2透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片， 在物镜的后面装上相应的阻断滤片。 落射式荧光显微镜需在光路的插 槽中插入所要求的激发滤片双色束分离器阻断滤片的插块。 3用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源 中心，使其位于整个照明光斑的中央。4放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤光片不要 用眼直接观察， 以免引起眼的损伤； 用油镜观察标本时， 必须用无荧 光的特殊油镜； 高压汞灯关闭后不能立即重新打开， 需经 5 分钟后才 能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。（三 ）观察 在示教台上的荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，可见经o. 01%的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生 两种不同颜色的荧光 （暗绿色和橙红色 ）。