第四章发酵工程

第四章 发酵工程【典型案例】 图4-1 番茄红素 图4-2 “人造肉”案例1. 番茄红素番茄红素是由11个共轭双键及2个非共轭碳碳双键构成的高度不饱和直链型烃类化合物，具有预防癌症、防治心血管疾病、缓解骨质疏松症和提高免疫等重要的生理功能。番茄红素的生产方法主要有提取法、化学合成法和微生物发酵法。由于番茄红素含量低，提取法无法满足市场需求；化学合成法存在收率低、产物不稳定以及合成成本高等缺点；发酵法被认为是生产番茄红素最有潜力的方法,发酵法利用特定微生物的代谢将淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉等廉价原料转化为番茄红素，不受原材料、地理环境和气候等因素影响，工艺简单、生产周期短、生产效率高、生产成本低，且产物质量可控，并减少了对环境的污染。案例2. “人造肉”近年来，国内外市场上出现了一种引人注目的新食品，它们的样子很象鸡、鸭、鱼或猪肉，但却不是通过饲养畜禽而获得的制品，也不是耕种收获的五谷杂粮，而是利用现代发酵工程技术制成的，因此，人们将他称为“人造肉”。现代发酵工程，就是利用微生物的许多特殊本领，通过现代的工程技术手段来生产人类有用的物质，或者把微生物直接运用于工业生产的一类技术。它是以培养微生物发酵为主的，因此又叫微生物工程。我们知道，蛋白质是生命活动的基础，一切有生命的地方都有蛋白质，微生物也不例外。不过到目前为止，能够担当生产微生物蛋白的菌种还不多，主要是一些不会引起疾病的细菌、酵母和微型藻菜。这些生物的结构非常简单，一个个体就是一个细胞，用发酵法生产这些单细胞微生物，就可以得到大量的单细胞蛋白质。在生产单细胞白质的工厂里，人们为微生物安排了最适宜的居住环境，这就是一个个大小不等的发酵罐，罐里存放着适合不同类微生物“胃FI”的食料，保证它们在这里能“吃饱喝足”，迅速繁殖。当发酵罐里的微生物繁殖到足够数量时，便可收集起来加工利用了。用发酵工程生产单细胞蛋白质，繁殖速度快。如一头体重500kg的牛，每天只能合成0.5kg蛋白质，而500kg的活菌体，只要条件合适，在24h内能够生产1250kg蛋白质。而且生产单细胞蛋白质的原料十分丰富，如农作物的秸秆，农副产品加工业的大量废水、废渣，以及石油产品、甲醇等，都可用来发酵生产单细胞蛋白。单细胞蛋白具有很高的营养价值。它的蛋白质含量高，可达细胞干重的70，比一般植物高46倍；而且单细胞蛋白质里氨基酸的种类比较齐全，有几种在一般粮食里缺少的氨基酸，在单细胞蛋白里却大量存在。另外，还含有多种维生素，这也是一般食物所不及的。正是由于单细胞蛋白具有这些突出的优点，现在人们用它加上相应的调味品做成鸡、鱼、猪肉的代用品，不仅外形相象，而且味道鲜美，营养也不亚于天然的鱼肉制品；用它掺和在饼干、饮料、奶制品中，则能提高这些传统食品的营养价值。在畜禽的饲料中，只要添加310的单细胞蛋白，便能大大提高饲料的营养价值和利用率。用来喂猪可增加瘦肉率；用来养鸡能多产蛋；用来饲养奶牛还可提高产奶量。在井冈霉素、肌苷、抗菌素等发酵工业生产中，它又可以代替粮食原料。因此，单细胞蛋白用途广泛，前途远大。随着世界人口的不断增长，粮食和饲料不足的情况日益严重。面对这一严峻的现实，开发利用单细胞蛋白已成为增产粮食的新途径。若以蛋白质含量计算，1kg单细胞蛋白相当于1kg一1.5kg的大豆。建立一座5个100t发酵罐的工厂，可以年产5000t单细胞蛋白，相当于3330hm耕地上种植大豆的产量。单细胞蛋白的生产向人们展示美好的前景，在现代科学技术的培育下，也许要不了多久，用单细胞蛋白制成的饭菜，就会出现在你家的餐桌上。 上面的案例是发酵工程在食品加工领域的应用。通过本章的学习，可以了解更多的关于发酵工程技术在多个领域的应用情况。学习指南本章主要发酵工程的发展概况，熟悉生物反应器、发酵系统和发酵工艺，掌握相关概念与知识点。第一节 发酵工程概况一、发酵工程的定义与特征1.发酵工程的定义最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。工业上的发酵是指利用微生物制造工业原料或工业产品的过程，包括厌氧培养和通气培养。厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸的生产等；通气培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂的生产等。发酵工程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术，根据各种微生物的特性，在有氧或无氧条件下利用生物催化(酶)的作用，将多种低值原料转化成不同的产品的过程。而广义上的发酵工程由三部分组成：分别是上游工程，发酵工程和下游工程。其中上游工程包括优良菌株的选育，最适发酵条件（营养组成、pH、温度等）的确定，营养物的准备等；下游工程指从发酵液中分离和纯化产品的技术。2.发酵工业必须具备的条件：（1）某种适宜的微生物；（2）要保证或控制微生物进行代谢的各种条件，即培养基的组成、温度、溶氧浓度、pH值等；（3）微生物发酵需要的设备； （4）提取菌体或代谢产物或精制产品的方法和设备。3.发酵工程的特点微生物发酵生产的研究大体上有两种方式：一种是小规模发酵的研究形式，如在实验室里进行大量摇瓶培养，观察限制反应速率的各种因素，确立最适的培养方法；另一种是大规模的研究形式，利用小型和中型反应器进行培养试验，并进一步在工业规模上研究发酵生产产物的分离和精制方法，以确定在细胞水平上的综合的最适培养条件。由于微生物种类繁多，繁殖速度快，代谢能力强，催化的反应类型多，容易通过人工诱变获得有益的突变菌株，同时由于微生物能够利用有机物、无机物等各种营养源，不受气候、季节等自然条件的限制，可以用简易的设备来生产多种多样的产品。所以，在酒、酱、醋等酿造技术基础上发展起来的发酵技术非常迅速，具有下述特点：发酵过程在生物体的自动调节下进行，数十个反应过程能够象单一反应一样，有条不紊在发酵设备中一次完成；反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单；原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源，微生物本身能有选择地摄取所需物质；容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原或者官能团引入等反应；发酵过程中需要防止杂菌污染，设备需要进行严格的冲洗、灭菌；空气需要过滤等。二、发酵工程发展史1.天然发酵阶段几千年前我们的祖先就知道如何利用黄豆发酵制造酱油，中国医师们就知道使用生长在豆腐上的霉菌治疗皮肤病等等。到19世纪，就利用自然发酵现象制成各种饮料酒和其他食品。直到中世纪，人类不断地积极努力改进酒类、面包、啤酒、干酪等的风味及品质，但对这种“发酵”本质的了解直到19世纪末仍属一知半解，因此当时完全是靠经验而进行的家庭作坊式生产，时常被杂菌污染所困扰。此时代称为天然发酵工业时代。2.纯培养技术的建立1680年，荷兰博物学家安东尼冯列文虎克发明显微镜，人类历史上第一次看到大量活的微生物；1862年，“发酵之父”巴斯德以著名的巴斯德实验，证明发酵原理，指出发酵现象是微小生命体进行的化学反应；随后著名的细菌学家柯赫提出著名的柯赫法则，完成了微生物基本操作技术：在固体培养基上分离纯化微生物的技术；配制培养基的技术。从19世纪末到20世纪30年代出现的发酵产品有乳酸、酒精、面包酵母、丙酮、丁醇等厌氧产品和柠檬酸、淀粉酶、蛋白酶等好氧产品，均为表面培养。这些产品的生产过程较为简单，对生产设备的要求不高，规模不大。 3.通气搅拌发酵技术的建立1929年英国弗莱明发现了青霉素，青霉素发酵生产的成功，给人类医疗保健事业做出了巨大贡献，同时在发酵工业发展史上写下了崭新的一页，给发酵技术带来了以下两大功绩：开拓了以青霉素为先锋的抗生素发酵工业；建立了深层培养法，把通气搅拌技术引入发酵工业，使需氧菌的发酵生产走上大规模工业化生产途径。通气搅拌液体深层发酵技术是现代发酵工业的最主要的生产方式。这是发酵技术进步的第二个转折期。4.代谢控制发酵技术二十世纪中期，随着基础生物科学即生物化学、酶学、微生物遗传学等的飞速发展，再加上新型分析方法和分离方法的发展，发酵工业也有两个显著进步：采用了微生物进行甾体化合物的转化技术，同时促进今天的酶制剂工业的发展；以谷氨酸和赖氨酸发酵生产成功的代谢控制发酵技术的出现，此技术已在一系列氨基酸以及核苷酸物质的发酵生产中得到广泛应用，而且在抗生素等次级代谢产物的发酵中也得到广泛应用。代谢控制发酵技术为发酵技术发展的第三个转折期。5.开拓发酵原料时期二十世纪六、七十年代，这段时期是代谢控制发酵技术广泛应用的顶盛期，几乎所有的氨基酸和核苷酸物质都可以采用发酵法生产。多种多样的发酵原料不仅能发酵生产蛋白，而且还能发酵生产其他各种各样的产品。可以说在发酵原料方面，发酵技术又有了新的飞跃。6.基因工程阶段 20世纪70年代后，随着DNA重组技术细胞大规模培养技术、动植物转基因技术、聚合酶链式反应技术（PCR）、生物芯片技术等技术的出现，使得具有悠久历史的生物技术发生了革命性的变化。同时基因重组、细胞和组织培养、酶的固定化、动植物细胞的大规模培养、现代化生物反应器和计算机的应用以及产品分离、纯化等技术的迅速发展，发酵工程与基因工程技术的结合而进入了新的发展阶段。三、发酵工程的内容发酵工程主要包括菌种的培养和选育，发酵条件的优化，发酵反应器的设计和自动控制，产品的分离纯化和精制等。除食品工业外，化工、医药、冶金、能源开发、污水处理、防腐、防霉等开发，给发酵工程带来新的发展前景。目前已知具有生产价值的发酵类型有以下五种：1.微生物菌体发酵微生物菌体发酵是以获得菌体为目的的发酵方式。传统的菌体发酵工业有 面包制作的酵母发酵及食品的微生物菌体蛋白发酵两种类型；现代的菌体发酵工业常用来生产一些药用真菌：如香菇类、天麻共生的密环菌以及获得名贵中药获苔的获苔菌和获得灵芝多糖的灵芝等药用真菌。通过发酵生产的手段可以生产出与天然药用真菌具有同等疗效的药用产物。2.微生物酶发酵酶普遍存在于动物、植物和微生物中。最初，人们都是从动、植物组织中提取酶，但目前工业应用的酶大多来自微生物发酵，因为微生物具有种类多、产酶面广、生产容易和成本低等特点。微生物酶制剂有广泛的用途，多用于食品和轻工业中，如微生物生产的淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖，氨基酰化酶用于拆分DL-氨基酸等。酶也用于医药生产和医疗检测中，如青霉素酰化酶用来生产半合成青霉素所用的中间体6-氨基青霉烷酸，胆固醇氧化酶用于检查血清中胆固醇的含量，葡萄糖氧化酶用于检查血中葡萄糖的含量等等。3.微生物代谢产物发酵微生物代谢产物的种类很多，已知的有37个大类，其中16类属于药物。在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的。这些产物叫做初级代谢产物，许多初级代谢产物在经济上具有相当的重要性，分别形成了各种不同的发酵工业。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。次级代谢产物多为低分子量化合物，但其化学结构类型多种多样，据不完全统计多达47类。由于抗生素不仅具有广泛的抗菌作用，而且还有抗病毒、抗癌和其他生理活性，因而得到了大力发展，已成为发酵工业的重要支柱。4.微生物的转化发酵微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、脱羧反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等。最古老的生物转化，就是利用菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵。生物转化还可用于把异丙醇转化成丙醇甘油继而转化成二羟基丙酮；将葡萄糖转化成葡萄糖酸，进而转化成2-酮基葡萄糖酸或5-酮基葡萄糖酸；以及将山梨醇转变成L-山梨糖等。此外，微生物转化发酵还包括甾类转化和抗生素的生物转化等等。5.生物工程细胞的发酵这是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的工程菌，细胞融合所得的杂交细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素、青霉素、酚化酶等，用杂交瘤细胞生产用于治疗和诊断的各种单克隆抗体等。四、发酵工程的应用及前景1.发酵工程的应用领域微生物发酵工程的特征体现了发酵工程应用于工业化生产的种种优势。在目前能源资源紧张，人口、粮食及污染问题日益严重的情况下，发酵工程作为现代生物技术的重要组成部分之一，得到越来越广泛的应用。（1）在医药工业上，广泛应用于抗生素、维生素等常用药物和人胰岛素、乙肝疫苗、干扰素、透明质酸等新药的生产。（2）在食品工业上，用于微生物蛋白、氨基酸、新糖原、饮料、酒类和一些食品添加剂（柠檬酸、乳酸、天然色素等）的生产。（3）在能源工业上，通过微生物发酵，可将绿色植物的秸杆、木屑，工农业生产中的纤维素、半纤维素、木质素等废弃物转化为液体或气体燃料（酒精或沼气）。还可利用微生物采油、产氢、产石油以及制成微生物电池。（4）在化学工业上，用于生产可降解的生物塑料、化工原料（乙醇、丙酮/丁醇、癸二酸等）和一些生物表面活性剂及生物凝集剂。（5）在冶金工业上，微生物可用于黄金开采和铜、钢等金属的浸提。（6）在农、牧业上，应用于生物固氮、生物杀虫剂和微生物饲料的生产，为农业和畜牧业的增产发挥了巨大作用。（7）在环境保护方面，可用微生物来净化有毒的高分子化合物，降解海上浮油，清除有毒气体和恶臭物质以及处理有机废水、废渣等等。2.发酵技术的前景随着科学技术的进步，发酵技术也有了很大的发展，并且已经进入能够人为控制和改造、为人类生产所需产品的现代发酵工业阶段。现代发酵工程作为现代生物技术的一个重要组成部分，具有广阔的应用前景。例如，利用DNA重组技术有目的地改造原有的菌种提高生产效率；利用微生物发酵生产所需药品，如人胰岛素、干扰素和生长素等。发酵工业产品的增长，不仅丰富了人民的生活，而且使我国的发酵工业在国际上具有了举足轻重的地位。全世界年消费味精120多万吨，50%以上是我国生产的。全世界消费柠檬酸80万吨，我国生产20万吨，占25%。发酵工业发展趋势主要表现在：（1）随着发酵工业的日益扩大，同时面临自然资源缺乏，因而经济合理的选用原料，鼓励采用非粮食原料，以节约粮食，降低生产成本。积极采用精料或清液发酵工艺，以提高总收得率。（2）调整产品结构，加强综合利用和实行清洁生产。在调整结构时，必须以市场为导向，还要注重产品的综合利用，作到物尽其用，实行清洁生产，以提高企业的综合经济效益和社会效益。（3）发酵工业逐渐向大型发酵和连续化、自动化方向发展。产物由生产简单的化合物转化入复杂物质的生物合成；近代发酵工业与人工诱变菌种和代谢控制的广泛应用，新产品层出不尽。从上述的发酵工业发展趋向可以清楚说明发酵工业有着广阔的前景，是一门富有生命力、生机勃勃的既古老而又年轻的工业。本节课外阅读链接发酵形成新兴产业一、甜高粱茎秆液态发酵在当今世界矿质能源日益短缺的情况下，生物质能的研究开发显得日益紧迫，燃料乙醇作为一种新型可再生清洁能源越来越受到各国政府的重视，巴西已成功的用甘蔗研发出乙醇燃料替代车用汽油，美国是最大的以谷物（玉米）为原料生产燃料乙醇的国家，2005年其燃料乙醇的产量已突破14000万t。中国于2000年开始启动燃料乙醇项目，并取得了初步成果，但是目前中国燃料乙醇主要是以玉米为原料，存在着与人争粮的问题，生产成本较高，应用前景不容乐观，因此考虑到中国的实际情况，寻求新的生产原料刻不容缓。甜高粱作为能源作物是在世界能源紧缺，石油资源面临枯竭的严峻形势下提出的，已经引起国际组织和一些国家政府的关注。甜高粱属高效C4作物，茎秆含糖率高达18%24%（汁液垂度），用甜高粱茎秆生产燃料乙醇，在国内外得到了广泛认可，中国“十一五”规划明确的把甜高粱生产燃料乙醇作为首选，甜高粱作为能源作物显示出诱人的前景。甜高粱虽有能源作物之称，但在中国尚没有大型甜高粱乙醇厂，利用甜高粱生产燃料乙醇是多国科学家攻关的焦点。国内外现有的研究主要集中在甜高粱茎秆汁液液态发酵工艺。在液态发酵过程中，由于甜高粱汁液中氮源、无机盐含量不能满足酵母菌的需求，大多数研究者通过在汁液中添加氮源和无机盐来研究最佳的发酵工艺条件。从节省水资源、降低劳动强度和减少费用的角度考虑，液态发酵中高密度发酵更具竞争力。当可溶性固形物含量从16g/100g升高到31g/lOOg时，可节约585的用水，同时减少环境污染，提高设备利用率，而且高密度发酵可以增加发酵速率和酒精得率。Bvochora等研究了在甜高梁汁液和磨碎的甜高粱籽粒混合液中加入蔗糖(浓度34g/lOOml混合液)进行高密度液态发酵，酒精的最大得率能达到16.8(v/v)。高密度液态发酵有利于提高从甜高梁茎秆汁液中获取燃料乙醇的收益。甜高梁茎秆汁液高密度发酵工业化生产往往采用固定化酵母发酵工艺，固定化技术应用于酒精发酵的机理是利用活细胞或酶的高度密集，从而比普通游离状态的细胞成倍地增长，加快反应速度、缩短反应周期和提高工作效率。载体内部的酵母受外界影响较少，并不断增殖向外扩散，载体内部一直保持原有品质，而且拥有较好的抗污染能力。从固定化人手来高发酵强度是一种切实可行的方法。刘荣厚等研究了在摇床和流化床反应器上进行固定化酵母汁液酒精发酵，取得了很好的效果，为燃料乙醇的发展提供了科学依据。二、红薯饮料红薯又名甘薯、白薯、地瓜、番薯等，不仅营养价值高，而且还是养生珍品。据本草纲目记载“红薯能补中、和血、暖胃、肥五脏”；陆川本草中认为“红薯能生津止咳，主治热病烦渴”；现代医学也证明红薯具有多种保健功能。红薯被蒸熟鲜食，常见的加工制品有片、条及罐头，也被用于制造淀粉和粉条，或用作酿酒业的原料。利用乳酸发酵的方法除了可以延长食品保鲜期外，尚具有促进消化酶的分泌和肠道的蠕动、促进食物的消化吸收并防止便秘以及提高人体免疫功能。红薯主要为碳水化合物，其中的可发酵糖能被乳酸菌利用而转成乳酸。以红薯为原料、植物乳酸杆菌为发酵剂制成的乳酸菌发酵饮料不仅具有普通饮料的清凉和生津止渴的作用，还较好的保存了其营养素，可调节人体生理功能。用红薯与鲜奶配合发酵制成的红薯酸奶，有红薯的特有香味，还增加了酸奶纤维素、维生素和多种微量元素，减少脂肪含量，既可达到动植物营养互补，又能降低生产成本，是一种风味独特的滋补饮料。三、膨化玉米粉酸奶玉米是一种含多种营养成分的高产经济作物，含有大量的氨基酸、脂肪和粗纤维。玉米胚中蛋白质占1518，可与新鲜鸡蛋相媲美。胚芽中不饱和脂肪酸占50以上。玉米中还含有谷胱甘肽和大量的硒、镁，对抑制癌细胞的形成和发展具有积极作用，堪称抗癌佳品。中医学及传统中草药学认为：玉米还具有消渴、利尿、解毒之功效，经常食用，对人体十分有益。经挤压、膨化、粉碎后的玉米粉除具以上特点外，由于采取了高温高压短时(HTST)的加工方法，营养成分几乎未被破坏，原料经糊化处理后，更易消化吸收，挤压后的淀粉和蛋白质均易受酶作用而发生水解，产品口感细腻，风味好。以膨化后的玉米粉为原料，配以脱脂乳，用乳酸菌进行发酵制成膨化玉米粉乳酸发酵制品，含大量对人体有益的活性乳酸菌，乳酸菌在肠胃消化系统及抑制有害菌群繁殖等方面有很好效用。其工艺流程为： 玉米挑选去杂去皮粗磨细磨拌粉调配挤压膨化粉碎膨化玉米粉加水调配(稳定剂、糖、牛奶)杀菌均质冷却接种发酵成品四、中华猕猴桃果醋猕猴桃果实肉肥多汁，营养价值极高，香气浓郁，维生素C含量高，每百克果肉含维生素C 78410mg，含糖量8%16%，总酸1.2%2.1%，可溶性固形物2%10%，还含有人体所需的氨基酸以及钙、酶、磷、铁、钾等营养元素，被誉为水果之王，具有很高的开发价值。中国大部分地区盛产猕猴桃，资源丰富，但由于猕猴桃的贮藏保鲜技术尚不完善，销售方式主要以鲜果为主，造成大量鲜果积压与腐烂。为解决广大果农卖果难题，现全国正盛行开发猕猴桃果醋及果醋饮料。中华猕猴桃果醋生产工艺流程：猕猴桃洗净粉碎蒸煮加麸曲榨汁果汁加酒母酒精发酵加醋酸菌液醋酸发酵过滤高温杀菌装瓶成品。第二节 生物反应器及发酵系统一、生物反应器概述生物反应器是为细胞培养、细胞发酵或酶反应等生物催化反应提供良好的反应环境的设备，通常称为发酵罐或酶反应器。也有人将用于污水生物处理的曝气池或厌气消化罐归为生物反应器。生物反应器是生物反应过程中的关键设备，它的结构、操作方式和操作条件与生物技术产品的质量、转化率和能耗有着密切关系。发酵工业的生物反应器又称为发酵设备。发酵设备包括种子制备设备、主发酵设备、辅助设备（无菌空气和培养基制备）、发酵液预处理设备、产品提取与精制设备、废物回收处理设备等。由图4-1可见，生物反应器在生物产品生产过程中，居核心地位，是实现产品产业化生产的关键环节，是连接原料和产物的桥梁。在反应器中，通过微生物发酵，合成了人们所需要的产物，廉价原料变成了高附加值的产品。可以看出，生物反应器的设计和操作，是发酵工程中一个极其重要的环节，对产品成本和质量有很大影响，直接关系生产效益。图4-1 生物反应器作用示意图1.发酵罐发展历史二十世纪以前，开始使用发酵罐，它带有简单热交换仪器；二十世纪中叶，出现了钢制发酵罐，在面包酵母发酵罐中开始使用空气分布器，小型的发酵罐中开始使用机械搅拌，随之而来，机械搅拌、通风、无菌操作和纯种培养等一系列技术不断完善，此时在工艺技术上开始尝试发酵过程的参数检测和控制，设备上已经使用耐高温（蒸汽灭菌）的pH电极和溶氧电极，实现了在线连续测定，计算机开始运用于发酵过程的质量控制，发酵产品的分离和纯化设备也有了快速的发展；到二十世纪八十年代，出现了大容量的发酵罐，机械搅拌通风发酵罐的容积增大到80-150m3，由于大规模生产单细胞蛋白的需要，设计了压力循环和压力喷射型的发酵罐，计算机在发酵工业上也得到广泛应用。目前，生物工程和技术的迅猛发展给发酵工业提出了新的课题，能够满足大规模细胞培养及多种功能的发酵罐新产品不断出现，通过细胞发酵生产出来的胰岛素、干扰素等基因工程的高科技产品已经走上商品化。 2.发酵罐的特点 （1） 发酵罐的特点发酵罐是一个为操作特定生物化学反应而提供良好环境的容器。对于某些工艺来说，发酵罐是个密闭容器，同时附带精密控制系统；而对于另一些简单的工艺来说，发酵罐只是个开口容器，有时甚至简单到只要有一个开口的孔。一个优良的生物反应器要适合工艺要求以取得最大的生产效率，应具备的条件是：为细胞代谢提供一个适宜的物理及化学环境，使细胞能更快更好地生长；具有严密的结构；良好的液体混合性能；高的传质和传热速率；灵敏的检测和控制仪表，如图4-2。（2） 发酵罐的设计要求发酵罐设计的主要目标：使产品的质量高、成本低。生物反应器处于发酵过程的中心，是影响整个发酵过程经济效益的重要因素，其中生物反应器的节能是发酵罐设计的一个重要指标。发酵罐设计需要考虑的因素有：改善生物催化剂；操作与控制方便；无菌条件好等。与化学反应器不同，发酵罐设计应遵循以下原则：在培养系统的已灭菌部分与未灭菌部分之间不能直接连通；尽量减少法兰连接，因为设备震动和热膨胀，会引起法兰连接移位，从而导致污染；在制作工艺上，应采用全部焊接结构，所有焊接点必须磨光，消除耐灭菌的蓄积场所；防止死角、裂缝等情况；某些部分应能单独灭菌；易于维修；反应器可保持小的正压。图4-2 大型发酵罐示意图3.发酵罐的类型发酵主要设备有种子罐和发酵罐，它们各自都附有培养基调制、蒸煮、灭菌和冷却设备、通气调节和除菌设备以及搅拌器等。种子罐主要是确保发酵罐培养所必需的菌体量；发酵罐承担发酵产物的生产任务，因而必须能够提供微生物生命活动和代谢所要求的条件，并便于操作和控制，保证工艺条件的实现，从而获得较高产率的产物。（1）按微生物生长代谢需要来分类，可以分为好气发酵罐与厌气发酵罐。好气发酵罐主要用于抗生素、酶制剂、酵母、氨基酸、维生素等产品的发酵，发酵过程需要强烈的通风搅拌，为微生物的生长提供氧气；厌气发酵罐主要用于丙酮、丁醇、酒精、啤酒、乳酸等产品的发酵，发酵过程不需要通气。（2）按照发酵罐设备特点分类，可以分为机械搅拌通风发酵罐和非机械搅拌通风发酵罐。机械搅拌通风发酵罐包括循环式（如伍式发酵罐，文氏管发酵罐）以及非循环式的通风式发酵罐和自吸式发酵罐等；非机械搅拌通风发酵罐 包括循环式的气提式、液提式发酵罐，以及非循环式的排管式和喷射式发酵罐。这两类发酵罐是采用不同的手段使发酵罐内的气、固、液三相充分混合，从而满足微生物生长和产物形成对氧的需求。（3）按容积分类，一般认为500升以下的是实验室发酵罐；500-5000升是中试发酵罐；5000升以上是生产规模的发酵罐。二、好氧生物反应器好氧生物反应器又称通气搅拌罐，是最常用的需氧微生物反应器，反应器主体用不锈钢制造，反应器内部有搅拌桨叶。实验室规模的反应器中，一般采用一挡搅拌器，而工业规模反应器则装配两挡以上的搅拌器。安装搅拌轴的轴承必须无菌密封。罐内装配46块挡板。无菌空气从分布器吹进；罐温用夹套或蛇管调节。操作时，为要使气体和气泡能停留在反应器的液面上部空间，液体装量只能装到占反应器总容积的7080。如培养液直接在罐内用蒸汽灭菌，则蛇管需有相应的传热面积，以配合灭菌后冷却需要。反应过程中所产生的热量来自微生物反应热和克服搅拌粘性应力所消耗的能量。对间歇操作，则以前者为主，可以微生物反应热的最大值作为设计基准。通气搅拌罐有下列优点：pH值和温度容易控制；尺寸放大的方法大致已确定；适用于CSTR等。反之，也有下列缺点：搅拌功率消耗大；因罐内结构复杂，不易清洗干净，易被杂菌污染，此外，虽装有无菌密封装置，但在轴承处还会发生杂菌污染；培养丝状菌时，常用搅拌桨叶的剪切力致使菌丝易被切断，细胞易受损伤。1.机械搅拌发酵罐机械搅拌式发酵罐是发酵工厂常用类型之一。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促进氧的溶解，以保证供给微生物生长繁殖和代谢所需的溶解氧。比较典型的是通用式发酵罐和自吸式发酵罐。搅拌的作用：液体通风后进入的气泡在搅拌中随着液体旋转使之所走路程延长，使发酵液中保持的空气数量增加，实际上是增加了传氧质量；通过搅拌，大气泡被搅拌器打碎，增加比表面积；搅拌速度越快，增加了传氧速率。（1）通用式发酵罐 通用式发酵罐是指既具有机械搅拌又有压缩空气分布装置的发酵罐。由于这种型式的罐是目前大多数发酵工厂最常用的，所以称为“通用式”，如图4-3所示，其容积可自20L200m3，有的甚至可达500 m3。通用式发酵罐的基本条件。发酵罐应具有适宜的高径比。一般高度与直径之比为1.74倍左右，罐身越高，氧的利用率较高；发酵罐能承受一定的压力：因为罐在消毒及正常工作时，罐内有一定的压力（气压和液压）和温度，所以罐体各部分能承受一定的压力；发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧；发酵罐应具有足够的冷却面积。这是因为微生物生长代谢过程放出大量的热量必须通过冷却来调节不同发酵阶段所需的温度；发酵罐应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底；搅拌器轴封应严密，尽量减少泄漏。发酵罐罐体的尺寸比例。罐体各部分的尺寸有一定的比例，罐的高度与直径之比一般为1.74倍左右，新型的高位罐的高：直径大于10，其优点是大大提高了空气的利用率，但压缩空气的压力需要较高，料液不易混合均匀。发酵罐通常装有两组搅拌器，两组的间距约为搅拌器直径的三倍。大型发酵罐，可安装三组以上的搅拌器。发酵罐的部分部件搅拌器和挡板 搅拌器分平叶式、弯叶式、箭叶式三种，国外多用平叶，我国多用弯叶。其作用是打碎气泡，使空气与溶液均匀接触，使氧溶解于醪液中。挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。竖立的蛇管、列管、排管等，也可起挡板作用，故一般具有冷却列管式的罐内不另设挡板，但对于盘管，仍应设挡板。挡板的长度从液面起至罐底为止。消泡器 消泡器的作用是将泡沫打破。最常用的形式有锯齿式、梳状式及孔板式。空气分布装置 空气分布装置的作用是吹入无菌空气，并使空气均匀分布。分布装置的形式有单管及环形管等。常用的是单管式。轴封 轴封的作用是使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄漏和污染杂菌。常用的轴封有填料轴封和机械轴封两种。目前多采用机械轴封。（3） 自吸式发酵罐这种发酵罐（见图4-4）起源于六十年代，最初用于醋酸的发酵。这种设备的耗电量小，能保证发酵所需的空气，并能使气泡分离细小，均匀地接触，吸入的空气中7080的氧被利用。自吸式发酵罐罐体的结构大致上与通用式发酵罐相同，主要区别在大搅拌器的形状和结构不同。自吸式发酵罐是一种不需要空气压缩机，使用的是带中央吸气口的搅拌器，搅拌器由从罐底向上伸入的主轴带动，叶轮旋转时叶片不断排开图4-3 通用式发酵罐 (a)夹套传热 (b)蛇罐传热周围的液体使其背侧形成真空，于是将罐外空气通过搅拌器中心的吸气管而吸入罐内，吸入的空气与发酵液充分混合后在叶轮末端排出，并立即通过导轮向罐壁分散，经挡板折流涌向液面，均匀分布。空气吸入管通常用一端面轴封与叶轮连接，确保不漏气。在我国，自吸式发酵罐已用于医药工业、酵母工业，生产葡萄糖酸钙、力复霉素、维生素C、酵母、蛋白酶等，取得了良好的成绩。通过实践，证明自吸式发酵罐有这些优点：节约空气净化系统中的空气压缩机、冷却器、油水分离器、空气贮罐、总过滤器设备，减少厂房占地面积；减少工厂发酵设备投资约30左右，例如应用自吸式发酵罐生产酵母，每升容积酵母的产量可高达3050g；设备便于自动化、连续化，降低老化强度，减少劳动力；酵母发酵周期短，发酵液中酵母浓度高，分离酵母后的废液量少；设备结构简单，溶氧效率高，操作方便。缺点主要是由于罐压较低，对某些产品生产容易造成染菌。 图4-4 自吸式发酵罐及其发酵系统2.通风搅拌式发酵罐在通风搅拌式发酵罐中，通风的目的不仅是供给微生物所需要的氧，同时还利用通入发酵罐的空气，代替搅拌器使发酵液均匀混合。常用的有循环式通风发酵罐和高位塔式发酵罐。（1） 带升式发酵罐带升式发酵罐（如图4-5）采用循环式通风发酵罐系利用空气的动力使液体在循环管中上升，并沿着一定路线进行循环，所以称为空气带升式发酵罐或简称带升式发酵罐。带升式发酵罐有内循环和外循环两种，循环管有单根的也有多根的。与通用式发酵罐相比，它具有以下优点：发酵罐内没有搅拌装置，结构简单，冷却面积小，节约动力，节约钢材；由于取消了搅拌器的电机，而通风量与通用式发酵罐大致相等，所以动力消耗有很大降低，不需加消泡剂，料液可充满达较多。它的缺点有：不能代替好气量较小的发酵罐，对于粘度大的发酵液溶氧系数较低。（2） 高位塔式发酵罐高位塔式发酵罐是一种类似塔式反应器的发酵罐，又叫空气搅拌高位发酵罐，其高径比约为6左右，罐内装有若干块筛板。压缩空气由罐底导入，经过筛板逐渐上升，气泡在上升过程中带动发酵液同时上升，上升后的发酵液又通过筛板上带有液封作用的降液管下降而形成循环。这种发酵罐的特点是省去了机械搅拌装置，如果培养基浓度适宜，而且操作得当的话，在不增加空气流量的情况下，基本上可达到通用式发酵罐的发酵水平。由于液位高，空气利用率高，节省空气约50%，节省动力约30%，不用搅拌器，设备简单，但底部有沉淀物；温度高时降温较难。塔式罐适用于多级连续发酵，有的多级连续发酵具有十多层筛板。我国有用于医药抗生素产品的生产。（3） 伍式发酵罐伍式发酵罐（如图4-6）的主要部件是套筒、搅拌器。搅拌时液体沿着套筒外向上升至液面，然后由套筒内返回罐底，搅拌器是用六根弯曲的空气管子焊于圆盘上，兼作空气分配器。空气由空心轴导入，经过搅拌器的空心管吹出，与被搅拌器甩出的液体相混合，发酵液在套筒外侧上升，由套筒内部下降，形成循环。这种发酵罐多应用纸浆废液发酵生产酵母。设备的缺点是结构复杂，清洗套筒较困难，消耗功率较高。（4） 文氏管发酵罐文氏管发酵罐（如图4-7）用泵将发酵液压入文氏管中，由于文氏管的收缩段中液体的流速增加，形成真空将空气吸入，并使气泡分散与液体混合，增加发酵液中的溶解氧。这种设备的优点是：吸氧的效率高，气、液、固三相均匀混合，设备简单，无须空气压缩机及搅拌器，动力消耗省。此设备已适用于宇宙飞船的密封舱中，利用藻类的光合作用将气体中的CO2还原成氧。如果氮气中含有4%CO2，利用文氏管装置只要一个循环就可使其中的CO2降低到2%。此外，在污水处理和石油发酵中也正在研究使用。 图4-5 循环带升式发酵罐 图4-6伍式发酵罐 图4-7 文氏发酵罐三、厌氧发酵设备厌氧发酵也称静止培养，因其不需供氧，所以设备和工艺都较好氧发酵简单。严格的厌氧液体深层发酵的主要特色是排除发酵罐中的氧。罐内的发酵液应尽量装满，以便减少上层气相的影响，有时还需充入非氧气体。发酵罐的排气口要安装水封装置，培养基应预先加入。此外，厌氧发酵需采用大剂量接种（一般接种量为总操作体积的10%20%），使菌体迅速生长，减少其对外部氧渗入的敏感性。酒精、丙酮、丁醇、乳酸和啤酒等都是采用液体厌氧发酵工艺生产的。具有代表性的厌氧发酵设备如酒精发酵罐（见图4-8）和用于啤酒生产的锥底立式发酵罐（见图4-9）。图4-8 酒精发酵罐 图4-9 锥底立式发酵罐四、生物反应器工程及其前景1.生物反应器工程简介近年来，在生物技术领域中出现了生物反应器工程这一名词。它包括生物反应器的结构、操作条件与混合、传质、传热之间的关系，生物反应器的设计、放大等都属于生物反应器工程研究的范围；同时也包括在生物反应器中进行微生物发酵、动植物细胞培养和酶反应的反应器类型、生物催化剂和培养液的特性、生物反应器的优化操作、过程检测与控制等研究内容。也就是说，生物反应器的特征与所研究的目标产物的反应特征应联系起来，这对生物技术的实验室成果加速开发和对提高现有生产过程的生产能力都是十分必要的。2.生物反应器开发的趋势和未来方向（1）开发活性高、选择性好及寿命长的生物催化剂。开发主要途径是利用基因工程技术，实现生物细胞的定向改造，以及改进酶和细胞的固定化技术。（2）改进生物反应器的传质、传热的方法。（3）生物反应器向大型化和自动化方向发展。反应器的放大降低了操作成本，自动化检测和控制系统控制使反应器在最佳条件下操作成为可能。（4）特殊要求的新型生物反应器的研制开发。如基因产品生产、细胞固定化及动植物细胞培养的工业反应器，固体发酵反应器，发酵与分离连接的反应器等的开发研制已获得广泛重视。（5）降低设备投资方面，对连续生物反应器研究更加重视。连续生物反应器的主要问题是产物浓度低。随着生物催化剂比活力的提高，这个问题将得到弥补。为了克服发酵中的这个限制，固定化细胞系统提供了一种达到高生产能力、高产品浓度的方法。第三节 发酵工程工艺一、发酵工业生产中的菌种1.发酵工业化的菌种菌种资源非常丰富，广布于土壤、水和空气中，尤以土壤中为最多。有的微生物从自然界中分离出来就能够被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。当前发酵工业所用菌种的总趋势是从野生菌转为变异菌，从自然选育转向代谢控制育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，其他微生物有担子菌、 藻类。由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步地变为工业生产用的微生物。微生物资源不仅丰富，而且潜力还很大，需要更多的人去发掘，使之为人类造福。在进行发酵生产之前，必须从自然界分离得到能产生所需产物的菌种，并经过分离、纯化及选育后或是经基因工程改造后的“工程菌”才能供给发酵使用。为了能保持和获得稳定的高产菌株，还需要定期进行菌种纯化和育种，为工业生产保证高产量和高质量的优良菌株。2.发酵工业所用菌种必备的条件为了保证发酵的效益，必须要求高质量的工业用菌种，一般要具备的条件是：菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长；生理性状稳定；菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染（不带杂菌）；生产能力稳定。二、培养基1.培养基的种类培养基是人们提供微生物生长繁殖、生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。培养基的成分和各组分的比例，对微生物的生长、发育、代谢以及产物积累，甚至对发酵工业的生产工艺都有很大的影响。培养基的种类很多，根据营养物质的来源可分为：自然培养基、半合成培养基、合成培养基等。依据其在生产中的用途，可将培养基分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基等。孢子培养基是供制备孢子培养用的；种子培养基是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的；发酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。2.发酵培养基的组成发酵培养基的组成和配比由于菌种不同、设备和工艺不同以及原料来源和质量不同而有所差别。因此，需要根据不同要求考虑所用培养基的成分与配比。 但是综合所用培养基的营养成分，都是由碳源、氮源、无机盐类（包括微量元素）、生长因子、水等几类构成。三、发酵工艺发酵工艺一向被认为是一门艺术，需要多年的经验才能掌握。发酵生产受到很多因素和工艺条件的影响，即使是同一种生产菌种和培养基配方，不同厂家的生产水平也不尽相同。生物发酵工艺多种多样，但是基本上由种子的质量、发酵原料、灭菌条件、发酵条件和过程控制等因素影响。1.种子制备工艺菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管或冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子或菌种。种子制备过程可分为两大阶段，如图4-10所示：（1）实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等）或液体摇瓶培养（步序16）；（2）生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养（步序79）。图4-10 种子扩大培养流程图1砂土孢子；2冷冻干燥孢子；3斜面孢子；4摇瓶液体培养（菌丝体）；5茄子瓶斜面培养；6固体培养基培养；7、8种子罐培养；9发酵罐发酵产物的产量与成品的质量与菌种性能以及孢子和种子的制备情况密切相关。先将贮存的菌种进行生长繁殖，以获得良好的孢子，再用所得的孢子制备足够量的菌丝体，供发酵罐发酵使用。种子制备有不同的方式，有的从摇瓶培养开始，将所得摇瓶种接入到种子罐进行逐级扩大培养，称为菌丝进罐培养；有的将孢子接入种子罐进行扩大培养，称为孢子进罐培养。采用哪种方式和多少培养级数，取决于菌种的性质。生产规模的大小和生产工艺的特点，种子制备一般使用种子罐，扩大培养级数通常为二级。对于不产孢子的菌种，经试管培养直接得到菌体，再经摇瓶培养后即可作为种子罐种子。2.灭菌在生物化学反应中，特别是对各种微生物的培养过程中，要求在没有任何杂菌污染的情况下进行，而生物反应系统中又常常有比较丰富的营养物质，极易滋生杂菌，从而使生物反应受到破坏，产生的不良后果一般为：基质或产物因杂菌的消耗而损失；产物的提取更加困难；甚至发生噬菌体污染，生产菌被裂解而导致生产失败。因此，大多数培养过程要求必须在严格无菌的条件下培养，必须对生产设备及参与反应的所有介质（生产菌除外）进行灭菌处理。（1）灭菌方法灭菌，是指用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有生命物质的过程。常用方法如下：化学药剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌。湿热灭菌为最基本的灭菌方法，湿热灭菌一般是在120维持2030 min。过滤除菌是利用过滤方法阻拦微生物达到除菌的目的。工业上利用此方法制备无菌空气。在产品的提取中，也可用如超滤得到无菌产品。（2）培养基灭菌 培养基的灭菌大多采用湿热方法灭菌，灭菌方式有分批法和连续法两种。分批灭菌也称为实罐灭菌，是将配制好的培养基放入发酵罐或者其它容器中，通入蒸汽，使培养基和所有设备一起灭菌，实验室或者中小型发酵罐常采用这种方法。连续灭菌是在配制好的培养基向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，完成整个灭菌过程，也称之为连消。（3）空气除菌微生物在繁殖和好氧性发酵过程中都需要氧，一般是以空气作为氧源，被通入发酵系统，空气必须经过除菌后才能通入发酵液。根据国家药品生产质量管理规定规范（GMP）的要求，生物制品、药品的生产场地也需要符合空气洁净度的要求并有相应的管理手段。其中发酵用空气比较典型，空气除菌过程是一项十分重要的环节，除菌的方法很多，其中过滤除菌是空气除菌的主要手段。空气过滤除菌流程为：空压机冷却分油水总过滤器分过滤器。3.发酵发酵是微生物合成大量产物的过程，是整个发酵工程的中心环节。它是在无菌状态下进行纯种培养的过程，所用的培养基和培养设备，通入的空气或中途的补料都是无菌的，转移种子也要采用无菌接种技术。发酵罐内部的代谢变化（菌体浓度、主要营养成分的含量、pH值，溶氧浓度和产物浓度等）是比较复杂的，特别是次级代谢产物发酵就更为复杂，它受许多因素控制。因而在发酵过程中要进行工艺过程控制，在后面将详述。四、发酵操作方式1.发酵的操作方式根据操作方式的不同，发酵过程主要有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型。（1）分批发酵所谓分批发酵是指在一封闭培养系统内具有初始限制量基质的一种发酵方式，每批发酵所需时间的总和为一个发酵周期。营养物和菌种一次加入进行培养，与外部没有物料交换。它除了控制温度和pH及通气以外，不进行任何其他控制，操作简单。分批培养系统，只能在一段有限的时间内维持微生物的增殖，微生物处在限制性条件下的生长，表现出典型的生长周期。图4-11显示了典型的细菌生长曲线。接种后的一段时间内，菌体浓度几乎不增长，这一时期为延滞期。生产上要求尽可能缩短适应期，办法是通过使用适当的种子和接种量，即采用生长旺盛期（对数期）的种子和加大接种量。下一个时期是对数生长期，再经过一段时间后，养分已基本消耗，产物不断分泌产生，生长逐渐减速直至中止生长。随着细胞的大量繁殖，培养基中的营养物质迅速消耗，加上有害代谢物的积累，细胞的生长速率逐渐下降，进入减速期。因营养物质耗尽或有害物质的大量积累，使细胞浓度不再增大，这一阶段为静止期或稳定期。此时，细胞的浓度达到最大值。迄今为止，分批培养是常用的培养方法，广泛用于多种发酵过程。 图4-11 细菌的典型生长曲线（2）连续发酵所谓连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，维持发酵液的体积不变。在这种稳定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物浓度、产物浓度、pH值等都能保持恒定，微生物细胞的浓度及其比生长速率也可维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速度。连续发酵使用的反应器可以是搅拌罐式反应器，也可以是管式反应器。根据所用罐数，罐式连续发酵系统又可分单罐连续发酵和多罐连续发酵。如果在反应器中进行充分的搅拌，则培养液中各处的组成相同，且与流出液的组成一样，成为一个连续流动搅拌罐式反应器（CSTR）。连续发酵的控制方式有两种：一种为恒化法，维持一定的体积，而是通过恒定输入的养料中某一种生长限制因子的浓度来控制菌体浓度；另一种为恒浊法，即利用浊度来检测细胞的浓度，通过自控仪表调节输入料液的流量，以控制培养液中的菌体浓度达到恒定值。与分批发酵相比，连续发酵具有以下优点： 在稳定的条件下，产物产率和产品质量也相应保持稳定；容易实现机械化和自动化，降低劳动强度；缩短生产时间，提高设备利用率；过程易优化，有效地提高发酵产率。但是容易染菌、菌种变异、设备要求较高、适应面不广。由于上述情况，连续发酵目前主要用于研究工作中，如发酵动力学参数的测定，过程条件的优化试验等等，而在工业生产中的应用还不多。连续培养方法可用于面包酵母和饲料酵母的生产，广泛地应用于污水处理系统。另外，酒精连续发酵生产技术在前苏联也已获得成功的应用。而最近发展的一种培养方法则是把固定化细胞技术和连续培养方法结合起来，用于生产丙酮、丁醇、正丁醇、异丙醇等重要工业溶剂。（3） 补料分批发酵补料分批发酵也叫半连续发酵或者半连续培养，它是以分批培养为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发酵方法。是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。在20世纪初人们就知道在酵母培养基中，假如麦芽汁太多，会使生长过旺，造成供氧不足，供氧不足会产生厌氧发酵生成乙醇，减少菌体的产量。因此，采用降低麦汁初始浓度，让微生物生长在营养不太丰富的培养基中，在发酵过程中再补加营养，用这一方法可大大提高酵母的产量，阻止乙醇的产生。如今，补料发酵的应用范围已相当广泛，包括单细胞蛋白、氨基酸、生长激素、抗生素、维生素、酶制剂、有机酸等生产，几乎遍及整个发酵行业。随着发酵过程自动控制中的应用的研究，补料分批发酵技术将日益发挥出其巨大的优势。补料分批发酵与分批发酵相比，特点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。优点：可以维持适当的菌体浓度；避免在培养基中积累有毒代谢物。补料分批发酵可以分为两种类型：单一补料分批发酵和反复补料分批发酵。在开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程的适当时期，开始连续补加碳源或（和）氮源或（和）其他必需基质，直到发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。这种操作方式称为单一补料分批发酵。反复补料分批发酵是在单一补料分批发酵的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，使发酵液体积始终不超过发酵罐的最大操作容积，从而在理论上可以延长发酵周期，直至发酵产率明显下降，才最终将发酵液全部放出。五、发酵工艺控制发酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进行定期取样测定或进行连续测量并加以控制调节，因为这些参数对发酵过程影响较大，如温度、pH、溶解氧等。发酵过程中各参数的控制很重要，目前发酵工艺控制的方向是转向自动化控制，因而希望能开发出更多更有效的传感器用于过程参数的检测。此外，对于发酵终点的判断也同样重要。生产不能只单纯追求高生产力，而不顾及产品的成本，必须把二者结合起来。合理的放罐时间需经过实验来确定的，就是根据不同的发酵时间所得的产物产量计算出发酵罐的生产力和产品成本，采用生产力高而成本又低的时间，作为放罐时间。确定放罐的指标有：产物的产量、过滤速度、氨基氮的含量、菌丝形态、pH值、发酵液的外观和粘度等。发酵终点的确定，需要综合考虑这些因素。1.温度温度对发酵过程的影响是多方面的，它会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制。除这些直接影响外，温度还对发酵液的理化性质产生影响，间接影响发酵产物的生物合成。所谓的最适温度就是最适于菌体生长和产物合成的温度。不同的菌体、不同的培养条件、不同的酶反应、不同的生长阶段的最适温度应是不同的，而且菌体生长的最适温度不一定等于产物合成的最适温度。如青霉素生产菌的最适生长温度