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复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文胆 道 肿瘤潜在 标志物及其 分子机制研 究中文 摘 要胆 道 肿 瘤 恶 性 程 度 高 、预 后 差 ，早 期 诊 断 、根 治 性 手 术 切 除是 获 得 长 期 生 存 的唯 一机 会 。寻 找 有 助 于胆 道 恶 性 肿 瘤 早 期 诊 断 、判 断 预后 的肿 瘤 标 志物 ，以及 与 肿 瘤 发 展 相 关 的 蛋 白作 为 药 物 作 用 的靶 分 子 是 目前 胆 道肿 瘤 研 究 的热 点 之 一 。 本 课 题 运 用 双 向 电泳 联 合 质 谱 技 术 筛 选 胆 道 肿 瘤 的潜 在 标 志 物 。在 胆 汁 、 组 织 、 细 胞 等 水 平 共 鉴 定 出 良 恶 性 组 间 差 异 表 达 的 蛋 白5 1个 。 其 中 S tathm in/oncopro te in 18 同时在 胆 道癌 、胆 囊癌 细 胞 系 中高表 达 ，Mrp l4 同 时 在 恶 性 胆 汁 及 组 织 中 高 表 达 。 应 用 RNA 干 扰 技 术 ， 将 con tro l- s iRNA 或S ta thm in- s iRNA 转 染 胆 道 肿 瘤 细 胞 R B E 和 Q BC9 39 中 ，使 S ta thm in 在 m RN A 水 平 和 蛋 白水 平 表 达 均 下 调 ，发 现 RB E 与 Q BC 9 39 细 胞 的 迁 移 也 受 到 显 著 抑 制 ， 并 且 S ta thm in 的 表 达 水 平 与 FA K 磷 酸 化 的 水 平 iH 相 关 。 随 后 运 用 细 胞 免 疫 荧 光 的 方 法 结 合 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 扫 描 ，证 明 了在 胆 道 肿 瘤 细 胞 中 ，S ta thm in 与 FA K 共 定 位 于 细 胞 质 和 细 胞 膜 上 ，共 定位 的 区域 在 细 胞 内不 是 均 匀 分 布 的 ，主 要 位 于 细 胞 伪 足 部 分 。综 上 所 述 ， 我 们 发 现 S ta thm in 在 胆 道 肿 瘤 中于 m RN A 和 蛋 白水 平 表 达 上 调 ， 高表 达 的 Sta thm in 增 强 了其 与 FA K 间相 互 作 用 ，促 进 FAK 磷 酸 化 的作 用 ， 引起 FA K 的活 化 及 其 下游 通 路 促 进 的细 胞迁 移 。因 而 ，在 胆 道 肿 瘤 的 临床 治 疗 中可 以 将 S ta thm in 作 为标 志 物 和 治疗 祀 点之 一进 行 深 入 研 究 ，通 过 抑 制 其 表 达 或 者 下 调 活 性 而 达 到 治 疗 目的 。关键词 ：胆道肿瘤 文Stathm in ；FAK ，肿瘤标志物 ，细胞迁移 ！蛋 白质 组学中 图分类 号 :R61复 旦 大 学 硕 士 学 位 论 文P o t en t ia l B iom ar k er s F or B i l iar y T r a c t N eop la sm A n d It sM o l e c u l a rM e c h a n i s mA b s t r a c tB il ia r y tr a c t n e op la sm s a r e h ig h ly fa ta l d is ea s e s w it h p o or pr o g n o s is . C u r a t iv e t r e a t m e n t c a n o n ly b e e x p e c t e d f r o m s u r g i ca l r e s e c t io n o f e a r ly s t a g e tu m o r s . H o w e v e r , t h e m a jo r it y o f p a t ie n t s i n it ia l l y p r e s e n t w itha d va n ce d d isea s e . T o p r o v id e c l u e s to f in d b iom a r k er s f or ea r ly d ia g n o s is, p r o g n o s i s a nd t h er a p y , a s w e l l a s to u n d e r s ta n d th e m o le c u lar m e c h a n i sm s go v er n in g c an c er pro gr e s s ion, u se tw o- d im en s io na l e lec tr o p hor e s is (2- DE) com b ined w ith m a tr ix -a s s iste d la se r de sor p t io n/ ion iza t ion t im e- of- f l igh t ma s s sp e c tr om e tr y (M A L D I- T OF /MS ) to s cr ee n d if fer e n t ia l pr o te in p r o f il e s o f th e se m a l ig n a n t a n d b e n ig n sp e c im en s . W e id e n t if ie d5 1 d i f fe r e n t ia l ly e x p r e s s e d p r o t e in s a t t h e le v e l o f b i le , t i s su e a n d c e l l . S t a t h m in w a s f o u n d to b e o v er e x p r e s s e d in tu m o r c e l l l in e s R B E a n d G B C , M r p l4 w a s f ou n d to b e o v er e xp r e s s ed in th e tu m o r t iss ue s o f g a l lb la d d er ca n c e r a n d e x t r a - h e p a t ic b i le d u c t c a n c e r , a n d in th e b i le o f p a t ie n t sw it h m a l ig n a n t b i l ia r y tr a c t t um o u r s . C o n tr o l- s iR NA o r S t a t h m in - s i R N A w e r e t r a n s f e c t e d t o b i l ia r y tr a c t c a n c e r c e l l l in e s R B E a n d Q B C 9 3 9 t o m a k e th e s ta th m in ex p r e s s io n a t m RN A an d p r o t e in le ve l low e r ed , a n d t h en fo u nd th a t t h e c e l l m ig r a t io n o f R B E a n d Q B C 9 3 9 w er e s ig n if ic a n t ly in h ib it e d , a n d th e ex pr es s io n o f S ta thm in lev e ls p o s i t ive ly c or r e la t e d w ith the le v e l o f FA K p h o sp ho r y la t io n . T h e r e su lt s o f co n fo ca l la se r s ca n n ing m ic r o sc o p e e x a m i n a t i o n s h o w e d : i n b i l e d u c t c a n c e r c e l l s , S t a t h m i n a n d F A K c o - l o c a t e din t h e c y to p la s m a n d c e l l m e m b r a n e .In su m m a r y , w e f o u n d th e S t a t hm in u p r e g u la t e d a t t h e m R N A a n d p r o t e in le v e ls in th e b i le d u c t c a n ce r . O v er e x p r e s s io n o f S ta thm in e n h a n c e d t h e in t e r a c t i o n o f S t a t h m i n a n d FA K , a n d p r o m o t e d t h e e f f e c t o f F A K p h o s p h or y la t io n , t h u s c o n tr ib u t in g t o b i l iar y t um o r c e l l m ig r a t io n . S o2复 旦 大 学 硕学 位 论 文in the c l in ic a l tr ea tm en t o f b i l ia r y tra c t tu m o rs, b y inh ib it ing th e ex p r e s s io n o r a c t iv it y o f s ta thm in , it co u ld b e on e o f t h e m a r k e r s a n d th e r a p e u t ic ta r g e t s .K ey w or d s ： B il ia r y T r a ct N eop la sm ; Sta thm in ; FAK ; b iom a r k er ; C e l lm ig r a t io n ; p r o t e om ic s3复旦大学硕士学位论文引言胆 道 恶 性 肿 瘤 (胆 囊 癌 和 胆 管 癌 ) ，其 恶 性 程 度 高 ，转 移 复 发 率 、死 亡 率 居 高 不 下 ，且 近 年 来 发 病 率 在 世 界 范 围 内有 明显 的 增 长 趋 势 1，2 。据 上 海 市 肿 瘤 研 究 所 的 资料 ，上 海 市胆 囊 癌 和 胆 管 癌 的发 病 率 以约 5%逐 年递 增 3 。 由于 胆 囊 癌 和 胆 管 癌 无 特 异 性 临床 表 现 而 不 易 被 早 期 诊 断 ， 同 时 其 极 易 向肝 脏 等 邻 近 器 官 、 血 管 浸 润 和 远 处 转 移 ，诊 断 明确 时 往 往 已经 处 于 晚 期 ， 失 去 根 治性 切 除 的 机 会 ， 导 致 总 体 预 后 很 差 ，总 体 5 年 生 存 率 小 于 5% ，平 均 生 存 期 不 足 1 年 4-6 。多 篇 文 献 明确 指 出 7- 10 ：根 治 性 切 除 术 是 改 善 胆 囊 癌 和 胆 管 癌 患 者 预 后 最 重 要 的 因 素 之 一 。对 于 有 手 术 机 会 的病 人 ，手 术 后 总 体 生 存 率 为 4 0% ，预 后 主 要 与 肿 瘤 浸 润 深 度 以及 有 无 淋 巴结 转 移 相 关 。有 报 导对 于 T 1 期 胆 囊 癌 的 患 者 ，单 纯 的胆 囊 切 除 术 后 5 年 存 活 率 为 10 0% ，T 2 、T 3 期 没 有 淋 巴结 转 移 的 患 者 术 后 5 年 存 活 率 大 于 5 0% ，而 淋 巴结 阳 性 和 黄 疸 是 预 后 不 良的 表 现 ，术 后 5 年 的 存 活 机 率 几 乎 为0 1 1- 13 。 因 此 ， 早 期 诊 断 对 改 善 胆 道 恶 性 肿 瘤 患 者 的 预 后 起 着 关 键 性 的 作 用 ， 而 高 敏 感 性 和 特 异 性 的 肿 瘤 标 志 物 对 于 早 期 诊 断 有 着 重 要 意 义 。肿 瘤 标 志 物 ，是 指 在 肿 瘤 发 生 和 增 殖 过 程 中 ，由肿 瘤 细 胞 所 产 生 或 分 泌 并 释 放 到 血 液 、细 胞 、体 液 中 ，反 映肿 瘤 存 在 和 生 长 的 一 类 物 质 ；能 用 化 学 、免 疫 和 分 子 生 物 学 方 法 进 行 定 量 地 检 测 ；包 括 蛋 白质 、激 素 、酶 和 多 胺 等 。现 阶 段 临 床 常 用 于 胆 道 恶 性 肿 瘤 的 肿 瘤 标 志 物 为 C E A 、 CA 19 -9 14 ， 15 ， 二 者 与 胆 道 恶 性 肿 瘤 的 分 期 有 一 定 相 关 性 ，但 由于 二 者 在 其 他 消 化 道 恶 性 肿 瘤 中 也 有 表 达 ，特 异 性 不 高 。所 以 目前 临 床 上 胆 道 恶 性 肿 瘤 仍 缺 乏 有 效 的 、可 以作 为 人 群 蹄 查 的肿 瘤 标 志 物 。综 上 所 述 ，与 胆 道 肿 瘤 预 后 差 相 关 的 因素 主 要 为 早 期 诊 断 困难 、肿 瘤 侵 润 、淋 巴结 转 移 ，所 以 我 们 决 定 从 胆 汁 、组 织 、细 胞 水 平 寻 找 有 助 于 胆 道 恶 性 肿 瘤 早 期 诊 断 、判 断 预 后 和 指 导 治 疗 的 标 志 物 。蛋 白质 组 学 的 发 展 为 临床 寻 求 肿 瘤 标 志 物 提 供 了有 效 的手 段 。双 向 电泳 联 合 质 谱 使 得 高 通 量 鉴 别 蛋 白 、寻 找 新 的肿 瘤 标 志 物 成 为 可 能 16 。本 实 验 的前 期 工 作 即运 用 双 向 电泳 和 质 谱 技 术 ,进 行 差 异 蛋 白质 表 达 谱 比对 、蛋 白质 点 鉴 定 17 。 人 胆 管 癌 胆 汁 与 良性 胆 汁 组 中 ，成 功 鉴 定 出差 异 蛋 白质 9 个 ；人 胆 管 癌 组 织 与 良 性 胆 管 组 织 组 中 ，成 功 鉴 定 出 差 异 蛋 白质 7 个 ；人 胆 囊 癌 组 织 与 良性 胆 囊 组 织 组 中 ，成 功 鉴 定 出差 异 蛋 白质 10 个 ；人 胆 管 癌 细 胞 与 良性 胆 管 上 皮 细 胞 组 中 ， 成 功 鉴 定 出差 异 蛋 白质 12 个 ；人 胆 囊 癌 细 胞 与 良性 胆 囊 上 皮 细 胞 组 中 ， 成 功 鉴 定 出 差 异 蛋 白 质13个以 上 结 果 不 包 含u nnam e d p ro te in )。 其 中4复旦大学硕士学位论文Sta thm in/ on copr o te in 18 同时在 胆 道 癌 、胆 囊 癌 细 胞 系 中 高表 达 ，吸 引 了我们的注 意 ，所 以选 择 S ta th m in 进 行 下 一 步 研 究 。S ta thm in , 也 被 称 为 P 17 、P 18 、P 19 、19K 、m e ta b la st in 、癌 基 因 18 、LA P 18 和 Op l8/S ta thm in ，是 一 种 主 要 的微 管不 稳 定 蛋 白，在 细 胞 周 期 的不 同阶 段 通 过 憐 酸 化 和 去 碟 酸 化 作 用 来 调 节 细 胞 微 管 系 统 的 动 力 学 平 衡 ，控 制 细 胞 周 期 ，并 以 此 改 变 细 胞 的增 殖 、分 化 、活 性 等 生 物 学 行 为 。微 管 总 是 不 断地 在 聚 合 与 解 聚 两 个 状 态 间切 换 ，S ta thm in 可 以通 过 与 a /b- 微 管 蛋 白二 聚 体 结 合 来 封 闭未 聚 合 的 微 管 蛋 白，从 而 减 少 可 用 于 聚 合 成 微 管 的微 管 蛋 白数 量 。S ta thm in 也 可 以与 已 聚 合 的微 管 结 合 ，诱 导 其 构 象 变 化 ，促 进 微 管 解 聚 率 (F ig. 1) 。S ta thm in 调 节 微 管 系 统 的 主 要 机 制 研 究 较 多 ： 其 促 微 管 解 聚 活 性 受 其 自身 磷 酸 化 水 平 的 调 节 18 , 在 间 期 晚 期 ， 非 磷 酸 化 形 式 的 S ta thm in 促 使 微 管 解 聚 ， 以 备 下 一 步 组 装 成 纺 锤 体 所 需 ，当 细 胞 进 入 有 丝 分 裂 ， S ta thm in 经 憐 酸 化 而 失 活 ，其 促 微 管 解 聚 活 性 丧 失 ， 从 而 使 微 管 得 以聚 合 ， 纺 锤 体 形 成 ；在 有 丝 分 裂 晚 期 ， S ta thm in 经 去 憐 酸 化 而 重 新 激 活 ，为 纺 锤 体 解 体 、细 胞 退 出有 丝 分 裂 所 必 需 (F ig.2) 19 。Stath m in in C ell-C ycle P ro gressio n/,、rN C R K A S HS E Q U E ST R A T IO NC A T AST R O P H EO F T liB t lJ Nr a t eF ig . 1 M o d e l f or th e r o l e o f sta thm in in th e r eg u la t ion o f m ic r o t ub u le dy n am ic s . M T c o n t in u o u s ly sw i t ch b e tw e e n p h a s e s o f p o ly m e r i za t io n a n d de p o lym e r iz a t io n . S ta t h m in c a n se q u e s t e r u n p o ly m er iz e d tu b u l in b y- b ind ing tw o a/ b- tubu lin h e terod im er s (r ep re sen ted by l ig h t a nd da r k sh a d e d c ir c l e s) , th u s d im in is h in g th e p o o l o f tu b u l in h e t e r o d im e r sa v a ila b l e f o r p o lym e r iza t io n . S ta t hm in c a n a l so b in d to t h e e n d o f5复旦大学硕士学位论文p o lym e r iz e d m ic r o tu b u le s a n d in c r e a s e th e r a te o f ca ta s tr o p h e b y in d u c in ga c o n fo r m a t io n a l c h a n g e t h a t p r om o t e s m ic r o t u b u le d e p o ly m er iza t io n .j/m(4PbQspktQlatbi; iX phosphoQlalion ?#p34*=%OIca?5aicaciU-wmsiiivc A ctH eIn activepho sphatasesA cfh ?KANAPIiASK ? /(4N)OcptlnicriaiitmrKLO PHASI-：*T O K iV E .S !.SM ITOSIS， KF ig .2 M o d e l f or th e r o le o f sta thm in in th e m ito t ic p h a se o f th e c e l l cyc le. C hr om o som e s (repr e sen ted in gr ey) co nde nse and segr ega te dur ing the four pha ses of m itosis (propha se, m eta pha se, ana pha se，a nd te lopha se) w h i le c y to p la sm ic d iv is io n o c c u r s b y c y to k in e s is . A t th e o n s e t o f m i to s is , in terpha sem icr o tu bu le s(m t)dep o lym er ize(illu s tra tedbyth e interru p te d lin e s) th en r ep o lym er ize to a ssem b le th e m ito t ic sp ind le . T h e in a c t iv a t io no fs ta t hm inb yp h o sp h o r y la t io na l low sm it o t ics p in d le a s se m b lya n de n t r yin tom ito s i sw h i leit sr e a c t iv a t io nb y d e p h o sp h o r y la t io n p r om o te s m ito t ic sp in d le d i sa s s em b ly a n d e x i t f r o mm i t o s i s .已有研 究表 明在 人 类 多个 系统 的癌症 中 ，如 急 性 白血 病 、卵巢 癌 、乳 腺 癌 、 肺 腺 癌 、 胃癌 、肝 癌 、骨 肉瘤 等 ，S ta thm in 明显 高表 达 20- 23 ， S ta thm in 的 高 表 达 已被 证 实 与 肿 瘤 分 化 、 临床 分 期 和 预 后 的关 联 24 -2 7 。 另 外 ， S ta thm in 的表 达 在 肝 癌 中 与 转 移 潜 能相 关 ，是 预 后 的 重 要 因 素 ，并 可 能 成 为 一 个 有 用 的 标 记 用 于 预 测 早 期 肿 瘤 复 发 28 。细 胞 信 号 转 导 研 究 显 示 ：细 胞 内外 有 多 种 细 胞 因 子 、癌 基 因 或 抑 癌 基 因表 达 产 物 直 接 或 间接 与 S ta thm in 作 用 引起 细 胞 生 物 学 改6复旦大学硕士学位论文变 29 - 32 。在 体 外 培 养 细 胞 的研 究 已经 证 明 ，这 种 蛋 白质 在 细 胞 迁 移 中起 着 重 要 的作 用 。 因 此 ，我 们 预 测 ，S tath m in 应 该 在 胆 道 肿 瘤 的转 移 进 展 、 复 发 转 移 中 发 挥 的 作 用 33 - 35 。粘 附斑 激 酶 fo c a l a dh es io n k ina se ,FA K) 是 一 种 胞 质 非 受 体 蛋 白酪氨 酸 激 酶 ，是 粘 附斑 复 合 物 家 族 的 一 员 。FA K 参 与 了 多 条 细 胞 信 号 通 路 ，它 是 胞 内外 信 号转 导 的 中枢 。它 可 以整 合 来 自胞 外 的营 养 、压 力 、细 胞粘 着 等 方 面 的信 号 ， 调 节 下 游 分 子 的 活 性 36- 38 。近 年 的研 究 表 明 FA K 可 以调 控 细 胞 的 生 长 、锚 定 、 迁 移 、恶 变 和 调 亡 等 过 程 ，与 肿 瘤 的发 生 密 切 相 关 。在 细 胞粘 着 连 接 的形 成 过 程 中 ， FAK 直 处 于活 化 状 态 ，因此 它 可 能起 一种 起 始 作用 ，可 能在 细 胞 粘着 连 接 的装 配 和 分 解 过 程 中 都 起 着 重 要 的 作 用 。因 此 ，本 课 题 将 主 要 探 索 S ta thm in 通 过 FM 及 其 下 游 分 子 通 路 调 节 胆 道 肿 瘤 细 胞 迁 移 能 力 增 强 的 分 子 机 制 。我 们 应 用 RN A 干 扰 技 术 ，将 co n tro l- s iRNA 或 S ta thm in- s iRN A 转 染 胆 道 肿 瘤 细 胞 RB E 和 Q BC 9 39 中 ，使 S ta thm in 在 m RNA 水 平 和 蛋 白表 达 均 下 调 ，研 究 细 胞 生 物 学 行 为 的变 化 。如 果 S ta thm in 确 实 影 响 了 细 胞 迁 移 ，那 么 S ta thm in 是 否 参 与 FAK 通 路 ， 是 否 引起 FA K 的 活 化 及 其 下 游 通 路 促 进 的细 胞 迁 移 ， 总 之 ，S ta thm in 促 进 肿 瘤 迁 移 的机 制 需 要 进 一 步 探 讨 和 研 究 。7复旦大学硕士学位论文第 一 部 分双 向 电泳 联 合质 谱 在 蹄选 胆 道肿 瘤 标 志 物 中 的应用肿 瘤 标 志 物 是 反 映 肿 瘤 存 在 的 物 质 。它 们 或 不 存 在 于 正 常 或 良性 组 织 而 仅 见 于 胚 胎 组 织 ，或 在 肿 瘤 组 织 中 的含 量 大 大 超 过 在 正 常 组 织 里 时含 量 ，它 们 的存 在 或 量 变 可 以提 示 肿 瘤 的存 在 及 性 质 。一 般 而 言 ，肿 瘤 标 志 物 在 细 胞 内合 成 ，释 放 到 周 围 组 织 ，再 进 一 步 入 血 液 等 各 种 体 液 中 ，其 浓 度 随 之 一 步 步 减 低 。我 们 预 测 - 反 映 胆 道 疾 病 良恶 性 差 别 的 蛋 白质 ，在 病 变 细 胞 中合 成 ，释 放 到 周 围 组 织 ，接 着 进 入 胆 汁 ，最 然 进 入 循 环 。因 而 在 细 胞 中浓 度 最 高 ，血 液 中最 低 。双 向 电 泳 联 合 质 谱 使 得 高 通 量 鉴 别 蛋 白 、寻 找 新 的 肿 瘤 标 志 物 成 为 可 能 。双 向 电泳 可 以 根 据 蛋 白质 的等 电点 和 分 子 量 的 差 异 将 不 同 的 蛋 白质 区 分 开 来 ，随 后 应 用 M A LD I (基 质 辅 助 激 光 解 吸 电离 与 T OF ( 飞 行 时 间 联 合 鉴 定 蛋 白质 。本 部 分 实 验 将 通 过 收 集 良性 及 恶 性 胆 道 疾 病 患 者 的胆 汁 、组 织 标 本 ，体 外 培 养 良恶 性 胆 道 细 胞 ，提 取 胆 道 良恶 性 组 的 胆 汁 、组 织 、细 胞 的 蛋 白 ，利 用 双 向 电 泳 比拟 良恶 性 组 间 的 差 异 表 达 的 蛋 白 ， 选 取 差 异 明 显 的 点 行 质 谱 鉴 定 ， 以蹄 选 出 可 能 的肿 瘤 标 志 物 。8复旦大学硕士学位论文材 料 和 方 法1主要 实验材料和仪器1. 1 细 胞胆 道 癌 细 胞 系 QB C 9 39 、胆 囊 癌 细 胞 系 G BC 来 自复 旦 大 学 附 属 中 山 医 院普 外 科 实 验 室 ， 胆 道 癌 细 胞 系 RB E 购 自中 国科 学 院 上 海 细 胞 所 ， 良性 肝 内胆 管 上 皮 细 胞 系 H IB Ep iC (H uma n In trah epa tic B iliar y Ep ithe lia l C e lls) 购 自 S c ienC e ll。1.2 标 本本 实 验 已获 中 山医 院伦 理 委 员 会 的 批 准 。随机 选 取 200 6 年 6 月 ? 2 009 年9 月在 上 海 中 山医 院普 外 科 手 术 治 疗 的胆 道 癌 、胆 囊 癌 以及 良性 胆 道 、胆 囊 疾 病 患 者 的 术 中切 除 组 织 标 本 、胆 汁 标 本 ，所 有 患者 术 后 均 有 病 理 结 果 证 实 。所 取 标 本 均 在 离 体 后 30 分 钟 内切 除 ，液 氮 中转 运 ，一 70 C 冰 箱 中 保 存 。本 实 验 以 2 5 例 胆 道 癌 患 者 组 织 标 本 为 恶 性 胆 道 组 ，2 2 例 胆 囊 癌 组 织 标 本 为 恶 性 胆 囊 组 ，2 0 例 良性 胆 道 疾 病 组 织 为 良性 胆 道 组 ，2 0 例 良性 胆 囊 疾 病 组 织 为 良性 胆 囊 组 ， 10 例 胆 道 癌 胆 汁 为 恶性 胆 汁 组 ， 10 例 良性 疾 病 胆 汁 为 良性 胆 汁 组 。1.3 抗 体小 鼠抗 人 C K 19 抗 体 为 上 海 康 成 生 物 技 术 公 司产 品 。1.4 细胞 培 养相 关 试剂及 用 品1.4 . 1 DMEM CDu lbecco s mod ifie d Eag le s m ed ium )培 养 液 、RPM I 1640 ( Ro sw e ll P ar k M emor ia l In s t itu te 16 40 ) 培 养 液 、 0 .2 5% Tryp s in-EDTA 和 IV 型胶 原 酶 为 G IBC O BRL 产 品 ，上 皮 细 胞 培 养 基 Ep iCM (Ep ithe lia l C e ll M ed ium ) 购 于 S c ienCe ll ，以上 试 剂 均 4 。C 保 存 。1.4 .2新 生 牛血 清 ：新 生 牛血 清 为 PAA Lab (Ha idmannw eg, Au str ia )p uC 口广 叫 o1.4 .3IV 型胶 原 酶 ：DMEM 配 成 0.2m g/m L ， - 2(r C 保 存 。1.4 .4D-Hank s 液配 制 ：每 升 含 有 NaC l 8 g ，KC l 0.4 g ，NaHPO i ? 7H 200 . 12 g , K H 2P O 4 0 . 0 6 g , N a H C O s 0 . 3 5 g 。9复旦大学硕士学位论文1.4 .510 X PBS ：过 滤 除 菌 后 ， 室 温 保 存 。使 用 时 以 M ill i-Q 水 稀 释 至1 X PBS ，pH 7.4 ，高压 灭 菌 后 使 用 ，4 C 保 存 。K C 12 gN a 2H P 0 4 ? I2 H 2O15 . 4 gK H 2P O 42 gH 2OU p t o 10 0 0 m l1.4 .6二 甲亚 砜 DM S O ) ：使 用 H P LC 级 DM S O ，将 之 以灭 菌 微 量 离 心 管 分 装 ，保 存 于 - 2 (r c 。1.5 蛋 白质抽 提及 定量 相 关试 剂 ：1.5 . 1细 胞 裂 解 液 ：SOraM Tr is ， pH 7 .5 ,0 . 15 M N aC I,1% N on ide tP4 0 (N P- 4 0 , F luka ) ,Im M PM S F (S igm a , S t. L ou is , M O , U SA ) ,0 . 2 raM L e u p e p t in 。1. 5 . 2蛋 白质 定 量 试 剂 B r a d f or d 法 ：考 马斯 亮 蓝 G250100 mg9 5% 乙 醇5 0 m l8 5% 憐 酸12 0inlH 2OU p t o 10 0 0 m l1.6 蛋 白质 组 学 技术 相 关 材料 及 仪 器1. 6 . 1主 要 材 料 ：1.6 . 1. 1 lOmM 苯 甲基 擴 酰 氟 (PM S F) 储 存 液 ：8.7m g PM SF 溶 于 5niL 异两 醇 ， 分 装 ， 一 2 (r c 保 存 。1.6 . 1.2 IPG 干 胶 条 13cm ， 3 10 N L) 为 Am e rsham P ha rm a c ia 公 司女 口广 叩 01.6 . 1.3 水 化 液 ：8M 尿 素 ， 2% C HA P S , 0. 5% IPG 缓 冲 液 ， 18mM D T T 。D T T 临 用 前 加 入 。1.6 . 1. 4 平 衡 1 液 ：6M 尿 素 ， 50m M T r is , 30% (v/ v) 甘 油 ，2% SD S ， 喚 酌 蓝 少 量 ， 1% DT T 。DTT 临 用 前 加 入 。1 0复旦大学硕士学位论文1 .6 . 1. 5 平 衡 2 液 ： 6M 尿 素 ， 50mM T r is ，30% (v/ v )甘 油 ， 2% S D S ，嗅 酌 蓝 少 量 ，2.5% 碘 乙献 胺 (临用 前 加 入 。碘 乙酞胺 为 F lu ka 公 司 产 品 。 1.6 . 1.6 丙稀 酞 胺 凝 胶 储 液 ：30% 丙稀 献 胺 ，0.8% N ，N 甲叉 双 丙稀駄胺 (S igma 公 司，溶解 过 滤 后 避 光 4 C 保 存 。1.6 . 1. 7 分 离 缓 冲 液 ：PH 8 .8 ， 1.5M Tr is 盐 酸 缓 冲 液 。1.6 . 1.8 SD S 电 泳 缓 冲 液 ：2 5mM T r is , 19 2mM 甘 氨 酸 ，0 . l% (w / v )S D S 。1.6 . 1.9 乙睛 及 测 序 级 胰 蛋 白酶 为 M er ck 公 司 产 品 。1.6 .2相 关 仪 器1.6.2. 1 第 一 向等 电聚焦 系 统 IPG -p hor ， Am er shamB io sc ie n c e s)1.6 .2 . 2 第 二 向 H o e fer S E 60 0 垂 直 电泳 仪 Araer shamB io s c ie n c e s )1.6.2.3 凝胶 扫描 成 像系 统 ImageSCaner? ， Am er shamB io sc i en c e s)1.6 .2 .4 双 向凝 胶 电泳 图像 分 析 软 件Im a geM a ster 2 D P la t inum5 . 0 S o f tw a r e , A m e r s h a m B io s c ie n c e s )1. 6 .2 .5基 质 辅 助 激 光 解 析 离 子 化 飞 行 时 间 质 谱 4 700M A L D I- T O F/T O F P r o t eom ic s A n a ly zer ,A p p lie d S y s tem s) 1. 6 .2 .6 质 谱 点 样 干 燥 机 为 S p e e d- V a c (S P D 1 11 V ；S a va n tI n s t r u m e n t s , H o lb r o o k , N Y , U S A )1.6 .2.7 超 速 低 温 离 心 机 为 B io fug e 公 司产 品1.6 .2 .8T S - 1 型 脱 色 摇 床 ， 江 苏 海 门市 麒 麟 医 用 仪 器 厂1. 6 .2 .9 分 光 光 度 仪 为 72 2S 分 光 光 度 仪1.6 .2 . 10 冷 冻 干 燥 机 ：德 国 S RK LY OVA C G T 2- 9 型1.7 主 要 实 验 仪 器 ：2 0 u l 、 lOOu l 、 lO OO u l 微 量 移 液 器 购 自法 国 G i lso n 公 司 。超 速 低 温 离 心 机 为 B io fug e 公 司 产 品 。C O2细 胞 培 养 箱 为 T h er m o F o rm a ，S er ie s I I w a ter J ac k e t e d C O in c u b a t o r( U S A ) 。超 低 温 冰 箱 - 70 C ) 为 L egac i R e fr ig era t io n (USA ) 。1 1复旦大学硕士学位论文CA -9 2 0- 3 垂 直 层 流 洁 净 工 作 台 购 自上 海 上 净 净 化 设 备 有 限 公 司 。 La b D a n c er 小 舞 灵 祸 旋 振 荡 器 为 IKA 公 司 产 品 。Centr ifuge 5804R 台式 高速 冷 冻 离 心机 为 Eppen dor f 公 司产 品 。DK -8 D 型 三 孔 电热 恒 温 水 槽 购 自上 海 柏 欣 仪 器 设 备 厂 。电泳 设 备 均 为 B io- Ra d 公 司 产 品 。H 2- 9 2 11K 恒 温 振 荡 器 购 自太 仓 华 利 达 实 验 设 备 有 限公 司 。电子 天 平 为 SARTOR IUS 公 司产 品 。2实 验 方 法2. 1 细 胞 原代 培 养手 术 中无 菌 条 件 下 取 出 胆 囊 ，用 DM EM 培 养 液 含 10 0 u n its/ m l 青 霉 素 及 100 m g/m l 链 霉 素 冲 洗 3 ? 4 次 后 冰 上 转 移 入 实 验 室 。其 后 于 胆 囊 内注 入 0.2ng/iiiL IV 型胶 原 酶 ， 37 C 消化 20 分 钟 后 ，剪 幵胆 囊 并 用 刀 片 轻 刮 胆 囊 内膜 ，收 集 细 胞 悬 液 ，DM EM 稀 释 ， 100 目蹄 网过 滤 。 lOO Or/m in 离 心 10 分 钟 ，Ep iCM 悬 浮 细 胞 ，37 C 培 养 ，2h 后 未 贴 壁 的 细 胞 悬 液 移 出 种 于 新 的培 养 瓶 ，37 C ，5 % C02的 条 件 下 培 养 ，24 h 后 全 量 换 液 ，此 后 每 3 天 半 量 换 液 一 次 。2.2 细 胞 传 代 培 养人 胆 道 癌 细 胞 RB E 和 Q BC 9 3 9 在 含 10 % FB S 的 R PM I 16 4 0 培 养 液 添 加 10 0 un its/ral 青 霉 素 及 100 m g/m l 链 霉 素 中 ， 人 胆 囊 癌 细 胞 GB C 在 含 10 % FBS 的 DM EM 培 养 液 添 加 100 un its/m l 青 霉 素 及 100 m g/m l 链 霉 素 中 ， 人 良性 胆 管 上 皮 细 胞 H IBEp ic 在 上 皮 细 胞 培 养 基 Ep iCM 中 于 37 C ，5 % C 02 的 条 件 下 培 养 。细 胞 传 代 使 用 0.2 5 % 胰 蛋 白酶 和 2 mM E DT A 消 化 ， 按 1 :3 的 细 胞 比 例 传 代 。2.3 免 疫 突光2 .3. 1细 胞 以胰 酶 消 化 后 ，吹 打 成 車 细 胞 悬 液 ，接 种 于 无 菌 的 盖 玻 片 上 ，密 度 约 2 X 10、 于 3 7 C 、5% C O2培 养 至 细 胞 生 长 至 完 全 汇 合 。1 2复旦大学硕士学位论文2 .3.2 细 胞 置 冰 上 5 rain , 用 预 冷 的 PB S (pH 7.4 ) 洗 2 次 。加 入 4% 多 聚 甲醒 - PBS ，冰 上 固 定 30 m in 。PB S 洗 漆 后 ，3% BSA- P BS 封 闭 1 hr 以封 闭 非 特 异 性 结 合 位 点 ， PB S 再 次 洗 漆 。2 . 3 . 3加 入 一 抗 稀 释 液 a n t i- C K 19 1 ：100 以封 闭液 稀 释 ，置 湿 盒 内 ，37 C 放 置 3h , PB S 洗 漆 后 加 入 二 抗 稀 释 液 山羊 抗 小 鼠 F ITC 标 记二 抗 1 : 10 0 ) ， 4 C ， 过 夜 。2 .3 .4PBS 洗 漆 2 次 ，加 入 DAP I 稀 释 液 1 :10 0 以封 闭液 稀 释 ，室 温 染 细 胞 核 lOm in 。PB S 洗 漆 2 次 ，将 盖 玻 片 细 胞 面 向下 置 于 滴 有 m ount ing so lu t ion 的载 玻 片 上 ，指 甲油封 片 ，突 光 显 微 镜 L e ika T C S S P 2 ) 观 察 并 拍 照 。2.4 蛋 白质 提 取2 .4 . 1细 胞 蛋 白提 取 ：75 cm 培 养 瓶 培 养 ，当细 胞 约 9 0% 以 上 融 合 时 收 集 。 用 预 冷 的 P BS 洗 细 胞 2 次 ，加 入 少 量 0 .2 5% 胰 酶 (含 0 . 02% ED TA ) 消 化 ，细 胞 充 分 消 化 后 吸 干 胰 酶 ，加 PBS 轻 轻 把 细 胞 吹 打 下 来 ，4 V 3000rpm 离 心 5m in ，弃 上 清 ，重 复 洗 两 次 。吸 干 残 留的 PBS ，重悬 于 2m L 细 胞 裂 解 液 ，在 冰 上 进 行 超 声 波 裂 解 ， 20 0w , 每 次 4 s ,间 隔 8 s , 共 8 次 。在 冰 上 静 置 30iiiin ，4 C , 140 0 0 r pm 离 心 20m in ，小 心 吸 取 上 清 ，B ra d for d 法 检 测 蛋 白浓 度 ， 一 70 (：保 存 。2 . 4 .2组 织 及 胆 汁 蛋 白提 取 ：将 组 织 样 品 自超 低 温 冰 箱 取 出， 同组 各 例 Ig 左 右 混 合 ，用 生 理 盐 水 清 洗 干 净 后 ，剪 成 Imm X Imm X Imm 小 块 ， 于 研 钵 中 液 氮 冷 冻 研 磨 法 研 磨 至 组 织 成 粉 状 ，加 入 细 胞 裂 解 液 ，冰 浴 40 分 钟 ，振 荡 5 分 钟 ，再 冰 浴 4 0 分 钟 后 离 心 15000 r /m in , 1 h ， 收 集 上 清 。使 用 Bradford 法 蛋 白定 量 ，分 装 成 200ug 管 ， 置 1.5m lE P 管 中， 一 7(r C 低 温 保 存 。胆 汁 样 品 同组 各 例 5m l 混 合 ，4 。C 15000g/m in 离 心 15 分 钟 ，0. O lmm o l/L Tr is-ba se 透 析 48 小 时 ， 然 后 15 0 0 0 g/rnin 离 心 4 5 分 钟 ，上 清 与 1 : 1 的 乙 酸 、 丙 酮 混 合 ， 一2(r C 过 夜 ， 15000g/inin 离 心 30 分 钟 ，除 去 上 清 。沉 淀 用 冷 丙 酮 洗 潘 ， 150 00g /m in 离 心 30 分 钟 ， 除 上 清 。 沉 淀 瞭 5 分 钟 ，溶 解 在 细 胞 裂 解 液 中 。使 用 Bra dford 法 蛋 白定量 ，分装 成 2 00ug 管 ， 置 于 1.5m lE P 管 中， 一7(r C 低 温 保 存 。
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