黑曲霉发酵生产α-淀粉酶1.总结

产 - 淀粉酶的黑曲霉上罐发酵技术和发酵动力学研究摘要： 本实验通过对黑曲霉发酵生产 - 淀粉酶上罐发酵技术和发酵动力学研究，每隔6h 取一次发酵液样品检测其pH 值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标，并绘制出变化趋势图，从而得到黑曲霉生产 -淀粉酶过程中各项理化性质的改变，为工业生产提高发酵生产效率有指导意义。关键词： - 淀粉酶；黑曲霉；发酵；发酵动力学THE RESERCH ON FERMENTATION TECHNOLOGY ANDFERMENTATION KINEYICS OF - AMYLASE PRODUCTION ONASPERGILLUS NIGERABSTRACT:In this study, Aspergillus niger Fermentation on - amylase andfermentation tank fermentation kinetics, 6h take a broth sample testing its pH value, enzyme activity, the amount of residual sugar and biomass four physiological indices, and every draw a trend change, resulting in changes Aspergillus niger - amylase production process of the physical and chemical properties, improve the efficiency of fermentation of guiding significance for industrial production.KEY WORDS: - amylase; Aspergillus niger; fermentation; fermentation kinetics - 淀粉酶普遍分布在动物、植物和微生物中，是一种重要的淀粉水解酶，它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚糖或多聚糖分子内的 -1 ，4 葡萄糖糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等， 是工业生产中应用最广泛的酶制剂之一1。耐酸性 - 淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在 4.0 左右。自从日本研究者Yasuji Minoda 2等人用黑曲霉生产耐酸性 - 淀粉酶以来，各国都对耐酸性 - 淀粉酶进行了研究，陆续发现枯草杆菌、河内氏曲菌、青霉菌、酵母等都可以产生耐酸性 - 淀粉酶3-4 。通过黑曲霉发酵生产 - 淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h 取一次发酵液样品检测其pH 值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。1 材料与方法11.1材料材料与试剂原料：黑曲霉药品与试剂：淀粉，蔗糖，柠檬酸氢二铵，KH2PO4 ,CaCl 2，FeSO4 7H2O ，MgSO4 7H2O，I 2，KI ，K2HPO4 ，磷酸缓冲液（ PH=6.0），稀碘液，浓硫酸，0.05%淀粉溶液，消泡剂（植物油）蒸馏水主要仪器和器材：5L 机械搅拌罐，高压蒸汽灭菌器，干热灭菌器，恒温培养箱，冰箱，水浴锅，电磁炉，培养皿，三角瓶，小试管，大试管，移液枪，分光光度计培养基可溶性淀粉75g，蔗糖 75g，柠檬酸氢二铵80g， KH2PO4 15g，CaCl2 0.5g ，FeSO4 7H2O 0.5g ，MgSO4 7H2O 0.5g， PH=5.0 ，消泡剂（植物油）2ml，加水定容至5L。1.2方法发酵罐机械搅拌发酵，每隔 6h 取一次发酵液样品检测其pH 值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。2 实验内容2.1 实验步骤空消先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：1先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。2蒸汽先进空气系统，蒸汽蒸汽过滤器分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。3再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。4罐压升至所需温度（ 121）时开始计时，保温保压30min。保压方式：（ 1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；（2）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。5结束空消：（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。（2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。近罐空气阀的尾阀要一直微开启。种子制备接种黑曲霉于PDA液体培养基中，液体摇瓶培养。培养基配制、实消可溶性淀粉 75g，蔗糖 75g，柠檬酸氢二铵 80g， KH2PO4 15g， CaCl2 0.5g ， FeSO4 7H2O 0.5g ， MgSO4 7H2O 0.5g ， PH=5.0 ，消泡剂（植物油） 2ml，加水定容至 5L。关闭气路入罐阀， 主汽路进汽补料口进汽 （方法同空消） 罐压升至 0.12Mpa（121），保压、2保温 30 分钟实消结束。冷却接种与发酵待培养基冷却至28左右时，在加料口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开进料口，迅速接种。将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。2.2 参数监测每隔 6 h 取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。. pH的测定：标准液校准pH 计后，测定样品pH 值。.生物量的测定：每次取20-30mL 的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 3-5 min)离心，收集上清液，用小离心机（10000rpm， 1min）用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100烘箱中，烘干（2 h 左右），然后测其干重，取平均值。 . 酶活：试剂：（1）碘液：称取 0.5g I2 和 5.0gKI研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，于褐色试剂瓶内保存，避免阳光直射。（2）稀碘液：取原碘液1ml 稀释 100 倍。此溶液现配现用（3） 0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5克，加 5ml 缓冲液，搅拌混和，再徐徐倾入 70 毫升煮沸的缓冲液中。继续煮沸2 分钟，冷却至室温，定容至100mL。此溶液需要当天配制(4) 磷酸缓冲液（ pH 6.0 ）：0.2 mol/L K2HPO4 (12.3mL)+0.2 mol/L KH2PO4(87.7mL)方法：取 5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40水浴中预热 10 min ，然后加入适当稀释(6.0的磷酸盐稀释缓冲液 ) 的酶液 0.5ml ，反应 5min后，用 5ml 0.1mol/L H2SO 终止反应。取40.5 ml 反应液与 5 ml碘液显色，在620 nm 处测光密度。以0.5 ml水代替 0.5 ml 反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照（即取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在 40水浴中预热10 min ，然后加入6.0 的磷酸盐稀释缓冲液0.5ml ，反应 5min 后，用 5ml 0.1mol/L H 2SO4终止反应。取0.5 ml 反应液与 5 ml碘液显色）。酶活力根据下式计算：酶活力（ u/ml ） (R0-R)/R 050D，式中R0， R 分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。调整D 使 (R0-R)/R 0在 0.2-0.7之间。确定在40、 5 min 内水解 1 mg淀粉的酶量为一个活力单位。 . 残糖量的测定：硫酸 - 蒽酮法测残糖含量（1）原理糖类与浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物， 可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质， 反应后溶液呈蓝绿色，于 620 nm 处有最大吸收，显色与多糖含量有线性关系。3（2）试剂蒽酮试剂。溶解0.2 g蒽酮于浓硫酸（A. R. 95.5 %） 100 ml 中，当日配制试用。具体实验过程中，应视样品分数多少来准备蒽酮试剂的配置量。比如实测样品有50 份，为了保证结果的可靠性，安排个份样品试验重复数为3。因为每个试验点实测需要4 ml 蒽酮试剂，所以至少应配置的体积为4350 600 ml 。此时还应考虑预实验和实验差错所消耗蒽酮试剂量。标准糖试剂。葡萄糖溶液（可加数滴甲苯防腐）（3）操作及其注意事项分别取 0.1 g/l的葡萄糖溶液0.05 ， 0.10 ， 0.20 ， 0.30 ，0.40 ， 0.60 ， 0.80 ml ，用蒸馏水补到1.00 ml ，分别加入4.00 ml蒽酮试剂，迅速进入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸开始计时，准确煮沸10 min ，冷却后进行比色。以光密度为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，制作标准曲线。或使用计算器进行一元回归得出计算式，以便于计算使用。（4）样品含量测定取糖浓度为50 g/ml 左右的样品溶液1.00ml ，一式 3 份分别置于不同试管中，对照加入 1.0ml 蒸馏水， 然后给各管加入蒽酮试剂，以标准曲线方法进行比色测定。根据标准曲线和样品浓度计算含量。色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。此外，试管在加入蒽酮试剂过程中，移液管尖端在试管中所停留的高度对于加入蒽酮试剂的速度影响较大，而且对反应产生颜色的深浅都会产生一定的影响。因此，实验操作应该注意。2.3 后续工作罐体清洗，药品整理归类，物品放好。3 数据处理3.1葡萄糖标准曲线43.2发酵液 pH 值的变化发酵时间09142024333844485362（h)pH6.06.05.55.45.55.55.45.55.04.53.53.3生物量的变化发酵时91420243338444853620间（ h)生物量0.0260 0.0410 0.09300.0358 0.0509 0.0765 0.0698 0.0702 0.09070.11600（g）53.4残糖量变化发酵时间09142024333844485362（ h）残糖量2.262.0751.3060.5391.8802.2841.0401.2301.0540.9760.83（ g/l)003.5酶活变化发酵时间09142024333844485362（ h）酶活 368 576804143676413512468227923463469674364 实验结果分析4.1 pH值得变化：发酵液的PH在发酵过程中总体趋势是逐渐下降的，且下降速度逐渐加快。实验中 0-6h 变化幅度不大， 此时菌处于潜伏期内种代谢不旺盛，故 pH 的变化不大。12-18 小时有所波动，可能是取样时出现误差，理论上应该是在0=18 小时变化不大。 18 小时过后，随后随着菌种的活化，菌种新陈代谢的旺盛CO2的释放增加， pH 值逐渐下降，且下降速度逐渐加快。4.2 生物量变化：理论上生物量整体上是呈上升趋势。但是在18 小时时，出现生物量很明显的增大， 显然数据出现误差。可能是烘干时没有干的彻底，杂质掺入，或是统计数据时出现错误。 在这之后， 生物量出现缓慢上升趋势，这是因为在发酵期间培养基的营养成分是够黑曲霉生长所需的 , 它的增殖受到环境的影响不是很大, 故其一直在增殖。 此外生物量曲线出现较大的波动可能是操作的人员不同，实验手法也不一样，导致最终结果有所偏差。4.3 残糖的变化： 理论上应该是越来越小， 但是实验中残糖的波动比较大，归结原因可能如下：（ 1） 操作不规范，稀释倍数不合理，也可能导致数据波动性较大（ 2）由于本实验是分批次进行的， 因此实验操作者也不是唯一一个人，不同的操作者都有不同的操作习惯，步骤也不一定相同，可能也会导致数据波动。4.4 - 淀粉酶的活力：总体上是呈上升趋势，0-36h 内酶活测定数值比较小，因为在发酵初期，有一段时间的延滞期，由于菌种的代谢慢，总量少。36h 后，由于菌种达到对数期和稳定期黑曲霉的产酶能力加强，酶活不断升高， 且上升幅度也大大提高，数量增加以后产生的酶量便不断增加。5 注意事项（ 1）通蒸汽前先关闭所有阀门（ 2）粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。（ 3）活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压。（ 4）罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。7（ 5）空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。（ 6）进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。6 讨论黑曲霉是最早发现能够产生 - 淀粉酶的菌株，在日本、欧洲等过已经有用其进行工业化应用的报道， 是非常适合于工业化生产的菌株。 但是由于课题开展受时间、 人员和实验手段的限制，本实验尚有很多不足之处，仍有许多需要进一步补充和完善的地方。参考文献：1罗志刚，杨景峰，罗发兴 . - 淀粉酶的性质及应用 . 食品研究与开发， 2007，28（ 08）：163-1662王红梅黑曲霉 PZ301 - 淀粉酶的固态发酵条件及酶的分离纯化研究 M 合肥；安徽农业大学，20113张丽苹，许岩，金建忠酸性- 淀粉酶的研究与应用 酿酒， 2002.29（3）：19-224杨培华，李忠海， 刘永乐等 酸性淀粉酶的研究与应用食品与机械， 2006，22（5）：132-136书是我们时代的生命 别林斯基书籍是巨大的力量 列宁书是人类进步的阶梯 高尔基书籍是人类知识的总统 莎士比亚8书籍是人类思想的宝库 乌申斯基书籍 举世之宝 梭罗好的书籍是最贵重的珍宝 别林斯基书是唯一不死的东西丘特书籍使人们成为宇宙的主人 巴甫连柯书中横卧着整个过去的灵魂 卡莱尔人的影响短暂而微弱，书的影响则广泛而深远 普希金人离开了书，如同离开空气一样不能生活 科洛廖夫书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉 库法耶夫书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者 史美尔斯书籍便是这种改造灵魂的工具。人类所需要的，是富有启发性的养料。而阅读，则正是这种养料 雨果