食品微生物检测技术的研究进展

食品微生物检测技术的研究进展摘要：随着食品工业的迅速发展，建立食品微生物快速检测方法，对食品生产、运输、销售过程中质量的监控具有十分重要的意义。本文从生化、免疫学、代谢学、分子生物学等几个方面介绍了几种食品安全检测的方法与技术，并概述这些检测技术对食品安全的重要作用及影响。 关键字：食品微生物 检测技术；研究(关键词改了一下) 酶联免疫；PCR；基因芯片；流式细胞术Detection Technology Research Progress of Food MicrobiologyAbstract: With the rapid development of food industry，the establishment of food microbiology rapid detection method for the quality monitoring during food production, transportation and sales is of great significance. In this paper, several food safety detection methods and technologies were introduced based on biochemistry, immunology, metabolism, molecular biology and instrument of testing methods and techniques, and summarized the importance and impact of these tests on the food safety.Key words: Detection technology; ELISA; PCR; gene chip; flow cytometry随着人们生活水平不断提高，食品安全问题越来越受到重视，微生物对食品食品安全的影响也相应地备受关注。特别是近年来世界各国都相继发生的重大的食品安全事件，从而给食品安全敲响了警钟。因此，灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术和方法，建立和完善食品安全微生物检测技术和体系迫在眉睫1。近几年各国的许多机构和学者都致力于快速检测技术和方法的研究，已改进和开发了一些快速的检测技术和方法，微生物检测技术已由培养水平逐步向分子水平迈进，本文对食品中微生物的快速检测方法进展情况进行综述，以利于对食品进行筛选和检测，最终达到预防肠道传染病和食物中毒的发生的目的。1.生化检测技术生化检测技术包括了生化试剂盒（生化鉴定管法）、鉴别培养基法、快速测试片法和快速生化检测仪器法。生化试剂盒(生化鉴定管)的原理就是将多种常用的细菌生化分析试剂、培养基集成在特定的微型化的装置中，将传统方法中需要多次完成的实验改进为一次完成，其优点是能够在短时间内获得结果，从而节约了样品的分析时间，节约成本，提高了检验速度2。鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助快速鉴别某种微生物的一种培养基。例如对大肠杆菌O157:H7进行检测的SMAC琼脂培养基等，其主要原理是细菌产生特定的代谢产物同培养基中生化物质进行反应，从而根据不同的颜色进行判断3。快速测试片法是指以纸片、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在载体上面，通过微生物在其上的生长、显色来测定食品中微生物的方法。其具有以下优点：可测定少量检品、操作简便、易消毒保存、价格低廉、污染小、能真实反应检品中的细菌数等4。目前已商品化的微生物测试片有：菌落总数测试片、大肠菌群测试片、霉菌和酵母菌测试片、沙门氏菌测试片和金黄色葡萄球菌测试片。微生物的自动化检测具有操作标准化、简便、快捷、准确率高等特点，是微生物检测发展的方向之一。国内外现在已有很多全自动微生物分析系统问世，如Vitek系统、Biolog系统、Midd系统、Sensititre系统、Autosceptor系统、BAX系统和Phoenix细菌鉴定/药敏试验系统等，其中法国生物梅里埃的Vitek-Ams系统已被AOAC列为法定分析法。2 免疫学技术免疫学技术包括免疫荧光技术(IFT)、 免疫扩散技术(IDT)、酶联免疫吸附技术（ELISA）和酶联荧光免疫分析技术(VIDAS)免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。可用来对沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E.ColiO157和单核细胞增生李斯特氏菌等进行快速检测。王军等6建立了养殖大黄鱼病原溶藻弧菌的间接荧光抗体免疫快速检测技术。此技术的主要特点有特异性强、敏感性高、速度快。但还存在不足，如非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。免疫扩散技术(IDT)，在免疫扩散技术中，抗原抗体在凝胶内扩散，特异性的抗原抗体相遇后，在凝胶内的电解质参与下发生沉淀，形成可见的沉淀线。免疫扩散使用的凝胶种类很多，除琼脂外还有明胶、果胶、聚丙烯酰胺等。张莎等7运用琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)来检测珍稀雉类新城疫病毒。酶联免疫吸附技术（ELISA），酶联免疫吸附法是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析方法)其基木原理是将受检样品和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相抗原或抗体起反应形成复合物，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物)即与标木中待检抗体或抗原的量成一定比例，加入酶底物后显色，最后通过定性或定量分析有色产物量确定样品中待测物含量。酶联荧光免疫分析技术将酶系统与荧光免疫分析结合起来，在普通酶免疫分析的基础上用理想的荧光底物代替生色底物，就可提高分析的灵敏度和增宽测量范围，减少试剂的用量。酶放大技术、固相分离及荧光检测三者的联合将成为荧光免疫分析中最灵敏的方法。陈思强等8采用自动酶联荧光免疫分析系统检测冻肉中沙门氏菌。随着生物技术的迅猛发展，在继基因芯片以后又诞生了免疫芯片技术。免疫芯片是指包被在固相载体上的高密度抗原或抗体微点阵，是在载体上已设计好的微阵列方式固定多种抗体或抗原，用标记物标记抗体或抗原，利用配体间特异的相互作用方式进行反应、结合，然后通过特定的扫描装置进行检测，结果由计算机分析处理。高志贤等9已将该技术用于检测葡萄球菌肠毒素。3 代谢学技术代谢学技术包括电阻抗技术、微热量计技术、放射测量技术和接触酶测定技术电阻抗技术是指细菌在培养基内生长繁殖的过程中会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加培养基的导电性，使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况即可判定细菌在培养基中的生长繁殖特性。该法已用于食品中细菌总数、大肠杆菌、沙门氏菌、酵母菌、霉菌和支原体的检测，具有高敏感性、特异性、快反应性和高度重复性等优点。陈广全等已用该法检测食品中沙门氏菌10。3.2 微热量计技术微热量计技术是通过测定细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别。微生物在生长过程中产生热量，用微量热计测量产热量等数据，均存储于计算机中，经过适当信号上的数字模拟界面，在记录器上绘制成以产热量对比时间组成的热曲线图。根据这些实验所得的热曲线图，和已知细菌热曲线图直观比较，即对细菌进行鉴别。刘永军等采用该技术研究细菌的抑制作用11。3.3 放射测量技术放射测量技术是根据微生物在生长繁殖过程中代谢碳水化合物产生CO2的原理，把微量的放射性14C标记引入碳水化合物或盐类等底物分子中进行检测的。在微生物生长时，这些底物被利用并释放出含放射性CO2，然后通过14C自动化放射测定仪Bactec测量CO的含量，从而根据碳14CO2含量的多少来判断微生物的数量。3.4 接触酶测定技术接触酶测定技术是通过计算一个含有接触酶的纸盘，在盛有H2O2的试管中的漂浮时间来估计菌数。接触酶与H2O2之间产生生化反应，放出氧气，使纸盘由试管底部浮到表面。当样品中接触酶含量高时，纸盘上浮的时间短。大多数腐败微生物是嗜冷性细菌。而大多数嗜冷细菌接触酶呈阳性，故可以用接触酶反应来估计食品中的嗜冷性菌群。4 分子生物学技术分子生物学技术包括核酸探针技术、聚合酶链反应 (PCR)和基因芯片4.1核酸探针技术核酸探针技术是将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的。根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分成DNA探针或RNA探针根据选用基因的不同分成两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。核酸探针检测技术的最大优点是：特异性和敏感性。但探针检测技术中也存在一定的问题，如检测一种菌就需要制备一种探针；要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养； 4.2聚合酶链反应 (PCR)聚合酶链反应 (PCR)是体外选择性扩增DNA或RNA的技术。它以待扩增的两条核苷酸链为模板，由人工合成的寡核苷酸介导，通过核酸聚合酶促反应快速扩增核酸序列。它具有快速、灵敏、简单和特异等特点，该技术能在短时间内对特定DNA序列作百万倍扩增。PCR技术在食品卫生微生物检验中的应用很广泛，可直接检测标本中的大肠杆菌，检测痢疾杆菌、金葡菌各种毒素、小肠结肠炎耶尔森氏菌、肉毒梭菌、乳酸杆菌等食品中常见的微生物。利用PCR检测食品中的微生物，多数情况下因样品中存在着不同程度的干扰因子或抑制因子，影响PCR的扩增效率，导致假结果的产生。为克服这一缺陷，可将PCR与其它一些化学或分子生物学技术联合使用，以提高反应的特异性。但不能有排除或代替常规微生物检验方法。4.3基因芯片基因芯片技术是上个世纪末诞生的一项新型生物技术。它是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特异微生物。基因芯片技术理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标，检测的灵敏度、特异性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。此外还有流式细胞术、旋转平板技术和激光菌落扫描仪以及免疫磁性微粒技术。5 仪器法流式细胞术（FCM）是采用流式细胞仪对单个细胞或其他生物微粒进行快速定性、定量分析与分选的一门技术。流式细胞仪主要由细胞流动室(包括样品管、鞘液管)、激光聚焦区、检测系统、数据处理系统等4部分组成，其工作原理是将被检测对象制备成一定浓度的细胞(微粒)悬液，经荧光染色后放入流式细胞仪的样品管中，细胞在气体的压力下进入鞘液管，在鞘液的约束下，细胞(微粒)排列成单列从流动室的喷嘴高速喷出成为细胞(微粒)液粒，经荧光染色后的细胞经过激光聚焦区时受激光激发，产生散射光和荧光信号，通过一些波长选择通透性滤光片，可以将不同波长的散射光和荧光信号区分而将单个细胞(微粒)液滴分离，并由计算机进行图象及数据处理。现在该技术已经能够检测纯化的DNA可达pg级水平，在10min内可以完成数据的收集和分析。Tapp等使用类似方法对苏云金杆菌产生的毒素进行检验和示踪，结果显示FCM比斑点ELISA法更敏感、快速。5.2 旋转平板技术和激光菌落扫描仪自动旋转平板技术是在琼脂培养基表面倒一薄层样品，该仪器可使液体样品以螺旋转动方式分布，液体慢速流出后，随着平板的旋转从中心向边缘分布，样品分布非常均匀。这种方法可广泛用于细菌、酵母、霉菌及乳类样品中。样品倒入平板后，菌落数可以用激光菌落计数器来计数，即将光检测仪放置在仪器的底部，激光仪从上面自动扫描平板，当激光束通过菌落时，可以降低光的强度，从而检测出菌落的存在。这样菌落数可以通过电子计数，从而不是传统的视觉计数。5.3 免疫磁性微球免疫磁性分离方法，是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病微生物发生特异性结合，载有致病微生物的磁性颗粒在外加磁场的作用下向磁极方向聚集，弃去检样混合液，使致病微生物不但得到分离，而且也得到浓集。免疫磁性分离技术与常规检验方法相比具有显著的优点，可以很快地在含有大量杂菌的悬液有选择性地分离出目的微生物，并节省时间。综上所述，微生物快速检测技术都各自表现出很多的优点，但也还存在着不足，需要国内外研究者不断地完善和改进现有的检测技术。同时，建立更灵敏、更有效、更可靠、更简便的微生物检测技术也是保证食品安全的迫切需求和食品微生物快速检测技术的发展趋势。参考文献：1 林蕾，张炜.食品微生物检验技术的研究进展. 现代农业科学J，2008年10月第15卷第10期.2 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