论文：小檗碱、黄连生物总碱对AChE抑制作用特征研究

小檗碱、黄连生物总碱对AChE抑制作用特征研究李渊 李昊坤 宋一骁 刘强 丁兵兵丁虹* 通讯作者：丁虹，女，1964，博士，教授，博导。主要研究方向：药理毒理学。Email:dinghong2000（武汉大学药学院 武汉 430072）摘要：目的：AchE抑制剂的筛选与探究；方法：通过薄层分析法展开样品，利用显色反应判断各样品对AchE的抑制作用；通过紫外法测定AchE酶解产物在单位时间的生成量判断各样品对AchE抑制作用的强弱；结果：小檗碱高剂量及黄连生物碱对AchE的抑制率很高，且黄连生物碱的抑制率接近100%；结论：小檗碱高剂量及黄连生物碱对AchE有较强的抑制作用。关键词：AchE抑制剂 小檗碱 黄连生物碱 薄层分析法 紫外法 抑制率Research into Berberine,and berberine alkaloids on the characteristics of AChE inhibition Li Yuan Songyi Xiao Liu Qiang Ding Bingbing Li Haokun DING Hong * (College of Pharmacy, Wuhan University, Wuhan 430072) Abstract: Objective: AchE inhibitor screening and exploration; Methods: Expand thin layer chromatography samples, using the samples to determine the color reaction of AchE inhibition; by AchE enzyme determination in the generation of the product in unit time the samples to determine the amount of the strength of AchE inhibition; results: high-dose berberine and berberine alkaloids on the high rate of AchE inhibition, and inhibition of berberine alkaloids close to 100%; Conclusion: The high-dose berberine and berberine alkaloids have a strong inhibitory effect on AchE. Keywords: AchE inhibitor, thin layer chromatography of berberine alkaloids berberine inhibition by UV method 据统计：美国AD患者为200-400万，全球1700-2500万，我国有关调查尚缺乏大系列、据最新城市普查结果，AD患病率高于血管性痴呆。在西方国家AD是继心脏病、肿瘤和中风之后，排在第四位的导致死亡的疾病。与AD相关的递质改变有乙酰胆碱系统、单胺系统、氨基酸类和神经肽递质，其中胆碱乙酰转移酶和乙酰胆碱类递质的减少是AD的重要原因。临床上主要适用胆碱酯酶抑制药治疗AD.黄连是一味具有广泛药效作用的中药,在国内外用于多种疾病的治疗,且新的药效又不断被发现。而黄连的有效成分为小檗碱，有文献报道小檗碱既有直接拮抗胆碱受体的作用,同时也可能通过抑制胆碱酯酶活性发挥其拟胆碱样作用。因此小檗碱有可能成为治疗AD的有效药物。利用通过紫外法测定AchE酶解产物在单位时间的生成量判断小檗碱对AchE抑制作用的强弱，结果发现小檗碱高剂量及黄连生物碱对AchE的抑制率很高，且黄连生物碱的抑制率接近100%；所以小檗碱高剂量及黄连生物碱对AchE有较强的抑制作用，有可能成为新的治疗AD的药物。1 材料与方法紫外法观察受试样品对AChE抑制作用1.1 材料1.1.1仪器与设备：移液器（200、1000l）EP（1、10ml）、量筒（10ml）。储液瓶、玻璃棒、50ml、100ml容量瓶、棕色储液缸（容量约100ml）、10mL、1.5mLEP管若干、微量石英比色皿、紫外分光光度计、恒温水浴锅、洗瓶、擦镜纸若干、500ml量筒、pH试纸、玻璃棒、废液缸、分析天平、称量纸若干、药匙1.1.2原料与试剂：缓冲溶液A：pH8.0的Tris-HCl（50mM）、缓冲溶液B：150mL含BSA0.1%的溶液、缓冲溶液C、ATCI底物溶液、DTNB溶液、加兰他敏（用DMSO稀释成0.01mg/ml的溶液）、小檗碱（40g/ml 、20g/ml、10g/ml、5g/ml）、黄连生物总碱 （20g/ml、40g/ml）酶（将纯酶用缓冲溶液B配制成浓度3IU/ml 10ml，临用时配制）1.2方法 1.2.1在1.5ml EP管中依次加： 样品BufferBDNTBACTI（混匀）AChE酶（具体加入试剂顺序和用量见如表1）。1.2.2所有试剂除酶外（防止酶在较高温度下变质）都放于37恒温水浴锅中恒温。1.2.3混匀，30s后倒入比色皿中开始测调零管加相同量Buffer B代替酶入顺序和用量 表1加入顺序（l）空白调零空白对照石杉碱甲调零管石杉碱甲小檗碱小檗碱醇提取总碱调零管醇提取调零管总碱甲醇0100000000石杉碱甲001001000000小檗碱000010010000醇提取000000100100碱提取00000000BufferB200100100100100100100100DTNB200200200200200200200200ACTI100100100100100100100100AChE0100010001000100BufferB1000100010001000总体积600600600600600600600600薄层法观察受试样品对AChE抑制作用2.1材料2.1.1仪器与设备：硅胶板（10cm20cm）一块、研钵、展开槽一只、三角喷瓶、普通点样用毛细管、烘箱2.1.2原料与试剂：流动相（氯仿、甲醇、氨水体积比12:7:1）、缓冲溶液A（pH8.0的Tris-HCl）、底物ATCI（2mmol/L）和显色剂DTNB（2mmol/L）混合液、酶液的制备（AChE酶用BufferB稀释至3U/ml）、小檗碱（40g/ml 、20g/ml、10g/ml、5g/ml）2.2方法2.2.1在薄层板底边（预先活化）约2cm处，用毛细管轻轻画线，从左到右一次点样加兰他敏（1mg/ml）、不同浓度受试样品。点样量约为20l，若一次不能点完，待干后再点；2.2.2展开：层析缸中加入展开剂2030ml，将薄层板放入层析缸，盖上盖子，使溶剂沿薄层板扩散，至展开前沿到薄层板上23cm取出，晾干；2.2.3酶显色：将底物和显色剂混合液装入喷瓶，将液体吹到倾斜的薄层板上。注意吹气均匀，最好从上到下吹两次，从左到右吹两次，而且要保证薄层板上无液体流下。待薄层板后，喷含酶缓冲溶液，观察结果；2.2.4酶显色结果评价：通过观察受试样是否出现白斑，可判断有无AChE抑制活性。白斑一般15min左右消失；2.2.5生物碱显色：待酶显色后的薄层板晾干后，进行生物碱显色。先喷少量5%盐酸，再喷碘化铋钾，观察斑点是否出现黄褐色，如果出现黄褐色，表明受试成分为生物碱。2结果紫外法观察受试样品对AChE抑制作用 小檗碱高剂量及黄连生物碱对AchE的抑制率很高，且黄连生物碱的抑制率接近100%，说明小檗碱高剂量及黄连生物碱对AchE有较强的抑制作用。表1溶剂空白对照(0g/ml)OD抑制率%加兰他敏(0.01mg/ml)0.011750.0077679.840.21小檗碱(5g/ml)0.050630.0195111.570.01小檗碱(10g/ml)0.036750.0105035.818.88小檗碱(20g/ml)0.035380.0301038.2129.28表2抑制率%组别60-3090-6090-30小檗碱(20g/ml)1.0014110.999661.003863小檗碱(40g/ml)0.9845220.9880.972606黄连生物碱(20g/ml)0.9801930.996710.976609黄连生物碱(40g/ml)0.9751320.993350.968258薄层法观察受试样品对AChE抑制作用根据记录图片分析此实验失败。3结论小檗碱高剂量及黄连生物碱对AchE有较强的抑制作用，有可能成为新的治疗AD的药物。参考文献1谭正怀,张媛,程蕾,梁媛媛.小檗碱、巴马亭及黄连总生物碱对胆碱能神经的作用. 中药药理与临床2006; 22 (6)2 余园媛.黄连的药理研究进展. 重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室. 重庆大学学报(自然科学版). (2006) 02 - 0107 - 053丁虹主编.实验药理学M.北京：科学技术出版社.2008