hTERT基因启动子调控HSV

hTER虐因启动子调控HSV作者：卞卡，张惠中，任继鸿，赵辉，成诗银【关键词】端粒，末端转移酶；启动区(遗传学)；宫颈月中瘤；tk基因AbstractAIM:ToobservethekillingeffectofHSVtk/GCVsystemoncervicalcarcinomacellsunderthecontrolofhTERT(humantelomerasereversetranscriptase)corepromoter.METHODSXneukaryoticexpressionvectorcontainingHSVtkgeneunderthecontrolofhTERTcorepromoterwasconstructedandwastransfectedintocervicalcarcinomacells(HeLa)andvesselendothelialcells(ECV304)byliposomemethod.TransfectedcellswerethenselectedwithG418andRTPCRwasusedtodetectthetkgeneexpressioninHeLacellsandECV304cells.AfterGCVvasadded,flowcytometrymethodwereappliedtoinvestigateitscellkillingeffect.RESULTS:pCIneo/hTERTtk/GCVsystemunderthecontrolofhTERTinducedtheapoptosisinmorethan%ofcervicalcarcinomacells,butnotinnormalvesselendothelialcells.CONCLUSIONTERTgenecorepromoteristumorspecificandmaybeusefulintkgenetherapyofcervicalcarcinomaandinreducingthesideeffectsofthetherapy.Keywordstelomerase;promoterregions(genetics);cervixneoplasms;tkgene【摘要】目的：研究人端粒酶逆转录酶(hTERT基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸昔激酶基因/史昔洛韦(HSVtk/GCV系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法：构建hTERT因启动子调控的tk基因真核表达载体pCIneo/hTERTtk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304,新霉素(G418筛选阳性克隆扩增.用RTPC就比较两种细胞tk基因的表达情况；给予前药更昔洛韦(GCV,用流式细胞术检测hTERTM控的HSVtk/GCVS统对两种细月 fi 的杀伤作用.结果：hTERT启动子调控下的HSVtk/GCVS统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用，使%勺细胞凋亡；而对正常细胞ECV304乍用则不明显.结论：hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法，有望解决月中瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.【关键词】端粒，末端转移酶；启动区(遗传学)；宫颈月中瘤；tk基因0引言宫颈癌是死亡率较高的恶性月中瘤，传统治疗方法以手术、化疗、放疗为主，但晚期不宜手术者及对放化疗不敏感者5a生存率仍不理想.随着分子生物学及相关技术的迅速发展，自杀基因疗法在月中瘤治疗中取得了一定疗效，其利用人单纯疱疹病毒胸音激酶基因/史昔洛韦(humansimplexvirusthymidinekinase/ganciclovir,HSVtk/GCV)将更昔洛韦(ganciclovir,GCV)等前药磷酸化为细胞毒产物，从而阻止细胞DN*成，杀伤月中瘤细胞1-2.有研究发现，由于缺乏特异性，tk基因修饰的正常组织细胞经前药治疗后会与月中瘤细胞一起被杀死，造成对正常组织的杀伤.hTERT基因在90%勺人类月中瘤组织中呈过表达3,具有明显的月中瘤特异性.我们采用克隆hTERT因启动子，利用其在月中瘤细胞中特有的启动活性来控制HSVtk的月中瘤特异性表达的方法，旨在实现其在月中瘤细胞中的特异性杀伤作用.1材料和方法材料TaqDNA聚合酶、 限制性内切酶以及电泳中所用markerDL20XX和DGL20XX匀购自TaKaR宓司；T4DNA连接酶购自日本Promega公司；质粒提取、纯化试剂盒购自北京天为时代公司；转染试剂盒LipofectamineTM20XX购自美国Introvigen公司；含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因与tk基因的pGL3Basic质粒由第四军医大学唐都医院耳鼻喉科韩明鲸馈赠；pCIneo质粒由第四军医大学唐都医院肾内科杨洁馈赠；GCV勾自广东丽珠集团；大肠杆菌菌株JM109宫颈癌细胞HeLa和脐静脉内皮细胞ECV304匀由第四军医大学唐都医院临床实验科提供；流式细胞仪美国Coulter公司.方法基因启动子引物的设计和合成设计hTERT1因启动子引物的酶切位点为BglII和Hind田，由上海基康生物工程公司合成.上游引物：5gggagatctagtggattcgcgggcagaga3；下游弓I物：5gggaagcttagggcttcccacgtgcgcag3.以含有hTERT动子的质粒为模板进行PCRT增， 循环参数为：94C2min;94C30s,67C30s,72C40s,30个循环；72c1min.PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收得到hTERT动子片断.质粒的构建将获得的hTERTt断以BglII和Hindm双酶切，得到两端为BglII和HindlH位点的hTERT动子片断，将其连接入pGL3tk质粒相应的酶切位点之间，得到含有hTERTtk基因的质粒pGL3.将以上质粒用BglII和Xbal双酶切，得到hTERTtk基因片断，将其连入pCIneo质粒相应的酶切位点之间，得到hTERTO动子调控的tk基因真核表达载体pCIneo/hTERTtk,并以酶切方法进行鉴定.质粒的转染复苏HeLa细胞与ECV30翎胞，培养在含100mL/L新生牛血清的达尔伯克氏必需基本培养基（DMEM中.转染前1d,胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在2mL含血清，不含抗生素的正常生长的培养液中（每孔3X105细胞），使其在转染日能达到80%勺覆盖率.每种细胞接种2个孔， 分别转染pCIneo/hTERTtk和pCIneo两种质粒，分别命名为HeLa/hTERTtk,HeLa/0,ECV304/hTERTtlk及ECV304/0.对于每孔细胞，每10uL月旨质体中力口入4gDNA以无血清DME册养液?M匀，37C,50mL/LCO2+孵育5h,更换含血清培养液继续孵育24h,改用含G418的培养基培养，G418浓度为500仙g/mL,持续筛选12d后挑出单克隆，扩大培养.期间每3d换液1次，得到稳定转染了两种质粒的细胞.分别提取转染的HeLa和ECV304M胞基因组总RNA常规方法反转录cDNA并以此为模板进行tk基因核心序列的PCFT增.上游引物：5gcatggcttcgtacccctgccatc3；下游弓I物：5gcgttagcctcccccatctcccgg3.循环参数为：94c3min;94c40s,60C40s,72C70s,30个循环；72c8min.PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳h,紫外灯下摄片.流式细胞仪检测不同载体转染的不同细胞命名为：HeLa/hTERTtk,HeLa/0,ECV304/hTERTtk和ECV304/Q分另按2X105的数量接种于25cm2培养瓶中，37c,50mL/LCO2孵箱孵育24h后换GCV （1mg/mL洛养液， 继续孵育72h后收集1X106个细胞，先用PBSgfc涤2次，再用无水乙醇固定，送流式细胞仪进行分析，每种细胞送5份.检测前离心去乙醇，碘化丙皖染色15min.汞激光激发波长为488nm,结果用软件Hite和DNAMultictycle分析.统计学处理：数据以xs表示，用软件进行统计分析，多个样本均数比较用方差分析； 两两均数之间比较用SNK谕验.P,表1）.表1四种细胞凋亡率及细胞周期的比较3讨论近年来研究表明，人端粒酶由三部分组成：RNA亚单位（humantelomeraseRNA,hTR），蛋白质亚单位（humantelomeraseassociatedprotein1,hTEP1）4和hTERT.其中hTER做认为是决定端粒酶活性的重要部分5-6.在以上三个亚单位中，hTR和hTEP1在月中瘤和正常组织中均广泛表达，而hTERT的表达却大多分布在恶性月中瘤组织中，在正常组织中少见.Koga等7和Gu等8构建了由hTERT启动子调控的、携带有胱天蛋白酶和Bax等凋亡诱导基因的靶向基因治疗载体，可诱导端粒酶表达阳性的月中瘤细胞发生凋亡9,凋亡率可达到40%84%;而对正常人体细胞几乎没有影响；Liu等10也发现利用hTERTO动子诱导CD基因可特异性杀伤大肠癌细胞，并增强其前体药物5Fu对大肠癌细胞的敏感性.因此， 利用端粒酶逆转录酶启动子构建癌细胞特异性表达载体用于基因治疗是一种较理想的选择.在实验中我们观察到，宫颈癌细胞中tk基因的表达可以将前药GCV专换为细胞毒性产物而对细胞产生杀伤效应.细胞周期分析表明，经GCVt理后的宫颈癌细胞，细胞碎片比例明显增加，S期细胞所占比例明显减少，而S期为细胞的DNA成期，期间主要为细胞DNA勺合成与复制.由此我们推断，hTERT动子调控的HSVtk/GC择统可能是通过抑止癌细胞DNA勺合成和复制导致细胞凋亡.我们还发现，RTPC*细胞周期分析结果都显示，只有在端粒酶表达阳性的月中瘤细胞中，hTER箱动子才能发挥作用使tk基因得到表达；同样只有在月中瘤细胞中，得到表达的tk基因产生的tk酶才可将GCV专化为细胞毒性物质，抑止DNA勺合成导致细胞凋亡.而在正常细胞中，无论是转染前还是转染后，均无法引起明显的细胞的凋亡.这表明hTERTS动子调控的HSVtk/GCV(统仅特异作用于月中瘤细胞，成功的实现了月中瘤基因治疗的特异性.【参考文献】1YazawaK,FisherWE,BrunicardiFC.CurrentprogressinsuicidegenetherapyforcancerJ.WorldJSurg,20XX,26(7):783-789.2FillatC,CarrioM,CascanteA,etal.SuicidegenetherapymediatedbytheHerpesSimplexvirusthymidinekinasegene/Ganciclovirsystem:FifteenyearsofapplicationJ.CurrGeneTher,20XX,3(1):13-26.3ShayJW,BacchettiS.AsurveyoftelomeraseactivityinhumancancerJ.EurJCancer,1997,33(5):787-791.4HarringtonL,McPhailT,MarV,etal.AmammaliantelomeraseassociatedproteinJ.Science,1997,275(5302):973-977.5NakamuraTM,MorinGB,ChapmanKB,etal.TelomerasecatalyticsubunithomologsfromfissionyeastandhumanJ.Science,1997,277(5328):955-959.6梁光萍，罗向东，陈渝，等.hTERT因荧光真核表达载体的构建及表达J.第四军医大学学报，20XX,24(13):1221-1223.7KogaS,HirohataS,KondoY,etal.Anoveltelomerasespecificgenetherapy:Genetransferofcaspase8utilizingthehumantelomerasecatalyticsubunitgenepromoterJ.HumGeneTher,20XX,11(10):17-1406.8GuJ,KagawaS,TakakuraM,etal.TumorspecifictransgeneexpressionfromthehumantelomerasereversetranscriptasepromoterenablestargetingofthetherapeuticeffectsoftheBaxgenetocancersJ.CancerRes,20XX,60(19):5359-5364.9KeithWN,BilslandA,EvansTR,etal.TelomerasedirectedmoleculartherapeuticsJ.ExpertRevMolMed,20XX,20XX:1-25.10LiuJ,ZouWG,LangMF.CancerspecifickillingbytheCDsuicidegeneusingthehumantelomerasereversetranscriptasepromoterJ.IntJOncol,20XX,21(3):661-666