肠道菌群与高脂血症相关性研究

肠道菌群与高脂血症相关性研究研究目的收集2015年1月-10月中央民族大学校医院慢性病体检人员的临 床生化检测信息和粪便生物样本，采用二代测序技术检测粪便样本中肠道菌群 ASV( arnplicon sequence variant )的丰度,通过倾向性评分匹配法控制性别、 年龄、高血压、糖尿病等混杂因素的影响，筛选出高脂血症与非高脂血症人群的 差异ASV,再利用WGCNA概率图模型(贝叶斯网络)模拟差异 ASV与高脂血症 的因果作用关系，为核心菌群预防与治疗高脂血症提供科学依据。研究方法菌群 测序与结构分析提取各粪便样本肠道菌群总 DNA根据细菌V3-V4区设计引物(上 游引物为 5 -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-W引物为 5 -GGACTACHVGGGTWTCTAAT拉增 16S rRNA基因，在 illumina Hiseq2500 平台 上进行高通量测序，生成FASTQ&式的下机数据。运用R软件DADA应过滤，去重复，嵌合体识别和合并双端读取，完成物种注 释；用R软件vegan包分析a多样性、B多样性,初步探索两组样品间的菌群结构 差异。差异筛选与富集分析为了控制混杂因素对实验结果的影响，运用R软件 MatchIT包按1:1的比例将高脂血症组与非高脂血症组进行倾向性评分匹配。再利J用R软件DESeR筛选倾向性评分匹配后的高脂血症组与非高脂血症组 的差异ASV按照界、门、纲、目、科、属、种的分类结构绘制差异ASV勺分类树，并对每个分类进行富集分析。功能聚类与因果模拟运行R语言WGCNfe进行差异ASV的共表达分析，寻找差异ASV*能聚类模块与高脂血症及其生化指标 (CHO TG HDL-C LDL-C)的关系；对与高脂血症临床指标有显著性关联的功能 模块中差异ASVS行贝叶斯网络分析，推测高脂血症与ASV勺相互作用关系，确定 高脂血症核心菌群研究结果本研究共收集133例体检人员的临床生化信息和粪便生物样本。 其中，高脂血症样本87例，非高脂血症样本46例。菌群测序与结构分析通过dada2包对数据前处理,生成20295个ASV 87份 非高脂血症粪便样品，在门水平上共23个，含量最高的四个细菌门依次是 Bacteroidetes(46.7%)、Firmicute(44.2%)、Actinobacteria(8.0%)和Proteobacteria (0.3%);在属水平上,共有368个属，有18个相对丰度大于1.0% 细菌属。相对丰度 >5%属，依次为 Bacteroides (33.32%)、Prevotella9 (7.68%)、Bifidobacterium(6.74%)、Faecalibacteriu(5.77%)。在相对丰度大于1.0%的细菌属中，属于拟杆菌门有 Bacteroides、Prevotella9; 属于放线菌门为 Bifidobacterium;属于厚壁菌门有 Lachnospira (3.64%)、Agathobacter (3.46%)、Lachnoclostridium(3.39%)、Blautia (1.93%)等。46份非高脂血症粪便样品，在门水平上共19个，含量最高的四个细菌门依次 是 Firmicute (50.67%)、Bacteroidetes(42.88%)、Actinobacteria (5.84%)和Verrucomicrobia (0.26%)。在属水平上共有297个属，有18个相对丰度大于 1.0%细菌属。相对丰度 >5%属，依次为 Bacteroides (33.75%)、Faecalibacteriu (9.40%)、Prevotella 9 (5.23%)。在相对丰度大于1.0%的细菌属中，属于拟杆 菌门的有 Bacterokides (33.75%)、Prevotell9 (5.23%)、Alistipes(1.51%)、Parabacteroide (1.17%);属于放线菌门为 Bifidobacterium(4.77%);属于厚壁菌门的有 Lachnospira (3.54%)、Agathobacter (3.77%)、Lachnoclostridium(2.78%)、Blautia (1.665)、Lachnoclostridium (9.40%)等。高脂血症组与非高脂血症组 Alpha多样性(Chaol p=0.64,Observed speciesp=0.75,Simpsonp=0.6,Shannon p=0.71 )、Beta 多样性(Bray-Curtis distance(R2=0.007,p=0.52 ) ,jaccard distance (R2=0.07,p=0.48 )均没有显著性差异(p>0.05 )。差异筛选与富集分析采用 PSMfe (匹容差为0.2)将高脂血症 组与非高脂血症组按1:1的比例配对，共匹配出44对。匹配后的人群基本特征除了暴露因素(CHO TG HDL LDD有显著性差异， 混杂因素(年龄、性别、其他疾病等)均无显著性差异。随后利用R软件的DESeq 包，筛选倾向性评分匹配后的高脂血症组与非高脂血症组的差异ASV共筛选出 359 个差异 ASV(|logFC|>2 且 adj.P.Val<0.01 )。与 ASV物种注释表比对，差异ASV4门水平上被分为拟杆菌门(Bacteroidetes )、厚壁 菌门(Firmicutes )、变形菌门 (Proteobacteria )、梭杆菌门 (Fusobacteria )、 放线菌门(Actinobacteria )、疣微菌门(Verrucomicrobia )，共 6 个菌门。在属水平上被分为拟杆菌属(Bacteroides )、RuminococcaceaeUCG-014 Paraprevotella 、Asteroleplasma、 Prevotella9 等，共42个属,其中有35个ASV只能注释到科水平。分 类学上，高脂血症与非高脂血症的关键菌群为拟杆菌属、Prevotella9 、Parabacteroid9、Paraprevotella, 同时 这些群落都隶属于拟杆菌科至拟杆菌门的脉络上。功能聚类与因果模拟通过对88个样本的高脂血症检测指标及该疾病与各个 模块进行关联分析，筛选出与临床信息显著相关的目的模块。根据加权基因共表 达网络与高脂血症临床信息关联结果显示：CHO并没有与之相关的模块，与TG显 著正相关的模块为 blue 模块(cor=0.22,p=0.44 )、red 模块(cor=0.26,p=0.01其中模块所包含的ASV隶属于厚壁菌门和拟杆菌门，主要菌属有拟杆菌属、毛螺菌科、Erysipelatoclostridium等；与HDL-C显著负相关的模块为cyan模块(cor=-0.25,p=0.02 )，模块内ASV隶属于拟杆菌门且皆为拟杆菌属；与LDL-C显著负相关的模块为magenta模块(cor=-0.23,p=0.03 ) ,ASV隶属于厚壁菌门 和放线菌门，共有3个属,分别为双歧杆菌、Ruminococcus2、 Rothia;salmon 模块(cor=-0.22,p=0.04 )、pink 模块(cor=0.23,p=0.03 )、green 模块(cor=0.26,p=0.02 )与高脂血症(HL)显著相关，但是salmon模块与HL 是显著负相关,pink模块、green模块HL是显著正相关。其中与HL显著负相关salmon模块的ASV的Prevotella9 隶属 于拟杆菌门。HL显著正相关pink、green模块的ASVt属于拟杆菌门、厚壁菌 门，以拟杆菌属和毛螺菌科为主。在差异功能模块中，根据贝叶斯网络分析，ASV151直接影响HDL-C,该菌为拟 杆菌门的拟杆菌属(Bacteroides )。ASV1756ft接影响LDL-C,该菌为双歧杆菌(Bifidobaoterium )。ASV360ft接影响高脂血症，且高脂血症呈负相关，该菌为拟杆菌门的 Prevotella9 。ASV428 ASV658ft接影响高脂血症，且与高脂血症呈 正相关，该菌为拟杆菌属(Bacteroides )。研究结论从分类学角度，ASV151、ASV360 ASV428 ASV658H于拟杆菌 门,ASV1756属于放线菌门；ASV151、ASV428 ASV658H于拟杆菌属(Bacteroides ) ,ASV360 是 Prevotella9,ASV1756 双歧杆菌属(Bifidobacterium )。从功能学角度，拟杆菌属(ASV151与HDL-C水平呈正相 关;双歧杆菌(ASV1756与LDL-C水平呈负相关；拟杆菌属(ASV428 ASV658 与高脂血症呈正相关，Prevotell9 (ASV360与高脂血症呈负相关。