综合化学实验化学生物学实验一四

一、实验目的一、实验目的 在化学生物学研究中，蛋白质及酶是其重要的在化学生物学研究中，蛋白质及酶是其重要的研究目标，特别是设计合成酶的抑制剂或激活研究目标，特别是设计合成酶的抑制剂或激活剂，活性测定一定需要纯的酶制剂。剂，活性测定一定需要纯的酶制剂。 另外在化学遗传学或化学蛋白质组学研究中，另外在化学遗传学或化学蛋白质组学研究中，当发现某一种小分子化合物在细胞生化途径中当发现某一种小分子化合物在细胞生化途径中起作用后，也需要将能够与小分子化合物结合起作用后，也需要将能够与小分子化合物结合的蛋白质分离提取出来，再经过多种方法进行的蛋白质分离提取出来，再经过多种方法进行鉴定。鉴定。 所以，蛋白质和酶的分离纯化及电泳分析等是所以，蛋白质和酶的分离纯化及电泳分析等是化学生物学研究中一个极其重要的技术。化学生物学研究中一个极其重要的技术。 本实验选取马铃薯、番薯、蘑菇、茄子为实验本实验选取马铃薯、番薯、蘑菇、茄子为实验材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀等步骤获得多酚氧化酶的粗酶液，硫酸铵沉淀等步骤获得多酚氧化酶的粗酶液，对粗酶催化邻苯二酚、对粗酶催化邻苯二酚、L-L-多巴的活性以及同工多巴的活性以及同工酶、分子量等进行测试。酶、分子量等进行测试。 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握蛋白质含量测定方离的基本原理和方法，掌握蛋白质含量测定方法、多酚氧化酶活性的测定方法，电泳技术测法、多酚氧化酶活性的测定方法，电泳技术测定同工酶和分子量的方法，掌握相关仪器设备定同工酶和分子量的方法，掌握相关仪器设备的操作使用。的操作使用。 所提取的粗酶样品可作为实验三、实验四、实所提取的粗酶样品可作为实验三、实验四、实验五、实验六的材料。验五、实验六的材料。 （一）多酚氧化酶（一）多酚氧化酶 多酚氧化酶多酚氧化酶(polyphenoloxidase(polyphenoloxidase，PPOPPO，EC.1.10.3.1)EC.1.10.3.1)是是植物体内普遍存在的一类铜结合酶。它早在植物体内普遍存在的一类铜结合酶。它早在18951895年就被年就被发现，直至发现，直至19371937年才被分离得到。随着研究的深入，它年才被分离得到。随着研究的深入，它被分为单酚单氧化酶被分为单酚单氧化酶( (酪氨酸酶，酪氨酸酶，EC.1.14.18.1)EC.1.14.18.1)、双酚、双酚氧化酶氧化酶( (儿茶酚氧化酶，儿茶酚氧化酶，EC.1.10.3.2)EC.1.10.3.2)和漆酶和漆酶(EC.1. (EC.1. 10.3.1)10.3.1)。现在所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和。现在所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。漆酶的统称。 PPOPPO通常是一种由通常是一种由4 4个亚基组成的寡聚蛋白质，如薯蓣皂个亚基组成的寡聚蛋白质，如薯蓣皂小球茎小球茎PPOPPO和莴苣的和莴苣的PPOPPO；但大白菜、香草中；但大白菜、香草中PPOPPO则是由则是由3 3个亚基聚合形成；蘑菇的儿茶酚氧化酶则是一种多聚酶，个亚基聚合形成；蘑菇的儿茶酚氧化酶则是一种多聚酶，分重链分重链(43 kD(43 kD) )和轻链和轻链(13.4 kD(13.4 kD) )。香蕉果肉中的。香蕉果肉中的PPOPPO却是却是单体酶。不同种植物、同一植物体的不同部位及同一部单体酶。不同种植物、同一植物体的不同部位及同一部位的位的PPOPPO多基因家族的不同成员的分子量不同。多基因家族的不同成员的分子量不同。PPOPPO前体前体约约60-71 kD60-71 kD，成熟，成熟PPOPPO约约40-68 kD40-68 kD。 比较已知的十几种植物，有菠菜、梨、桃、蚕豆、胡萝比较已知的十几种植物，有菠菜、梨、桃、蚕豆、胡萝卜、马铃薯、番茄、葡萄和苹果，发现它们的卜、马铃薯、番茄、葡萄和苹果，发现它们的PPOPPO具有具有高度的相似性高度的相似性(45%-95%)(45%-95%)。整个氨基酸序列中，。整个氨基酸序列中，N-N-导肽导肽与与C-C-端保守性较低，而端保守性较低，而CuACuA与与CuBCuB很保守很保守. PPO. PPO由多个基由多个基因编码，表现出多基因家族性，少则因编码，表现出多基因家族性，少则2 2或或3 3个，多则个，多则6 6或或7 7个基因。但有的植物，如葡萄只有个基因。但有的植物，如葡萄只有1 1个个PPOPPO基因。基因。 多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密多酚氧化酶与植物组织培养的酶促褐变以及果蔬品质密切相关。因此，研究多酚氧化酶（酪氨酸酶）的抑制，切相关。因此，研究多酚氧化酶（酪氨酸酶）的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮肤增白，以及对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄褐斑等色素因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄褐斑等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要的治疗意义。由此，沉着性皮肤病等），具有非常重要的治疗意义。由此，人们利用酪氨酸酶在生物和化学的催化特性以及相对应人们利用酪氨酸酶在生物和化学的催化特性以及相对应的酪氨酸酶抑制剂，开发了它在食品、美容、环境、医的酪氨酸酶抑制剂，开发了它在食品、美容、环境、医药和化学上的应用。药和化学上的应用。（二）考马斯亮兰法（二）考马斯亮兰法（BradfordBradford法）法）测定蛋白质含量测定蛋白质含量 双缩脲法（双缩脲法（BiuretBiuret法）和法）和FolinFolin酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）的明法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。测定的方法。 19761976年由年由BradfordBradford建立的考马斯亮兰法（建立的考马斯亮兰法（BradfordBradford法），是法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由料的最大吸收峰的位置，由465nm465nm变为变为595nm595nm，溶液的颜色也，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在在595nm595nm下测定的吸光度值下测定的吸光度值A595A595，与蛋白质浓度成正比。，与蛋白质浓度成正比。BradfordBradford法的突出优点法的突出优点 （1 1）灵敏度高，据估计比）灵敏度高，据估计比LowryLowry法约高四倍，其最低蛋白法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达质检测量可达1mg1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比LowryLowry法要大的多。法要大的多。 （2 2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要的测定，只需要5 5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要程，大约只要2 2分钟即可完成，其颜色可以在分钟即可完成，其颜色可以在1 1小时内保持小时内保持稳定，且在稳定，且在5 5分钟至分钟至2020分钟之间，颜色的稳定性最好。因分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像而完全不用像LowryLowry法那样费时和严格地控制时间。法那样费时和严格地控制时间。 （3 3）干扰物质少。如干扰）干扰物质少。如干扰LowryLowry法的法的K+K+、Na+Na+、Mg2+Mg2+离子、离子、TrisTris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTAEDTA等均不干等均不干扰此测定法。扰此测定法。（三）多酚氧化酶催化活性测试（三）多酚氧化酶催化活性测试 酪氨酸酶的单酚酶活性，一般发生在黑色素合成途径的酪氨酸酶的单酚酶活性，一般发生在黑色素合成途径的第一步，即单酚羟化形成邻二酚。由于在酶催化反应中，第一步，即单酚羟化形成邻二酚。由于在酶催化反应中，产生的邻二酚进一步被氧化成为邻醌，所以许多研究把产生的邻二酚进一步被氧化成为邻醌，所以许多研究把单酚酶活性定义为完全把单酚转化为邻醌。这种活性可单酚酶活性定义为完全把单酚转化为邻醌。这种活性可以区分酪氨酸酶和其它的酚氧化酶，如漆酶和过氧化物以区分酪氨酸酶和其它的酚氧化酶，如漆酶和过氧化物酶。酶。 在自然界的各种生物体内，含有许多种类的酚类化合物，在自然界的各种生物体内，含有许多种类的酚类化合物，然而只有其中的一部分可以作为多酚氧化酶（或酪氨酸然而只有其中的一部分可以作为多酚氧化酶（或酪氨酸酶）的底物。这些酚类化合物在多酚氧化酶催化下发生酶）的底物。这些酚类化合物在多酚氧化酶催化下发生一系列化学反应，最终导致水果、蔬菜产品的变色。其一系列化学反应，最终导致水果、蔬菜产品的变色。其中酪氨酸酶最重要的底物是儿茶素、多巴（中酪氨酸酶最重要的底物是儿茶素、多巴（3,4-3,4-二羟基二羟基苯丙氨酸）、苯丙氨酸）、3,4-3,4-二羟基肉桂酸酯（绿原酸）和酪氨酸。二羟基肉桂酸酯（绿原酸）和酪氨酸。 多多酚酚氧氧化化酶酶的的底底物物 多酚氧化酶也可以催化许多非天然酚类化合物，但是单多酚氧化酶也可以催化许多非天然酚类化合物，但是单酚和二酚分子中取代基的位置是决定酚类化合物能否被酚和二酚分子中取代基的位置是决定酚类化合物能否被多酚氧化酶催化的一个重要因素。实验表明多酚氧化酶多酚氧化酶催化的一个重要因素。实验表明多酚氧化酶只能催化对位上有取代基的单酚羟基化，而邻位取代的只能催化对位上有取代基的单酚羟基化，而邻位取代的单酚和二酚由于空间位阻的原因很难被该酶所氧化。多单酚和二酚由于空间位阻的原因很难被该酶所氧化。多酚氧化酶也可以催化间位取代的单酚羟基化，形成的产酚氧化酶也可以催化间位取代的单酚羟基化，形成的产物同对位取代酚的氧化产物相同，但反应速度低物同对位取代酚的氧化产物相同，但反应速度低4 4倍多。倍多。 OHOHHOOOHOH儿茶素OHOHCH=CHCOOCO OHOHOHOH绿原酸HOHOCH2CHCOOHNH2HOCH2CHCOOHNH2多巴酪氨酸 多酚氧化酶催化各种酚与多酚氧化酶催化各种酚与O O2 2氧化为醌。本实验氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚、是采用邻苯二酚、L-L-多巴为底物，在多巴为底物，在0.2mol/L0.2mol/L磷酸钾缓冲液磷酸钾缓冲液pH6.8pH6.8的反应体系中，的反应体系中，PPOPPO催化邻催化邻苯二酚、苯二酚、L-L-多巴形成褐色的醌，在分光光度计多巴形成褐色的醌，在分光光度计390390或或475nm475nm处使反应体系的处使反应体系的ODOD值产生变化，通值产生变化，通过过ODOD值上升的读数变化确定值上升的读数变化确定PPOPPO的酶活大小。的酶活大小。 比活力的计算：将测得的每毫升酶催化活力比活力的计算：将测得的每毫升酶催化活力（OD/minOD/min）除上每毫升中蛋白质的含量，计算）除上每毫升中蛋白质的含量，计算比活力。比活力。（四）多酚氧化酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳（四）多酚氧化酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳电泳法是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性法是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其检测方法记录其电泳电泳区带图谱或计算其含量区带图谱或计算其含量(%)(%)的方法。的方法。包括纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳包括纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（不连续电泳或圆盘电泳）、梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳、（不连续电泳或圆盘电泳）、梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳、等点聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳、等点聚焦电泳以及毛细管电泳等。电泳以及毛细管电泳等。 其中聚丙烯酰胺凝胶电泳，具有分子筛和电泳的双重作用，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳，具有分子筛和电泳的双重作用，它的分辨力高，以此为电泳载体，通过电泳方法不但可以它的分辨力高，以此为电泳载体，通过电泳方法不但可以测定蛋白质的分子量大小、蛋白质的带电性质，而且可以测定蛋白质的分子量大小、蛋白质的带电性质，而且可以了解不同组织、不同发育细胞某些蛋白质表达的情况，是了解不同组织、不同发育细胞某些蛋白质表达的情况，是目前蛋白质组学研究的重要工具之一。目前蛋白质组学研究的重要工具之一。二、实验过程二、实验过程1 1，多酚氧化酶的粗提，多酚氧化酶的粗提（1 1）粗酶提取、过滤，低）粗酶提取、过滤，低温离心得酶提取液。温离心得酶提取液。（2 2）盐析；使用硫酸铵将）盐析；使用硫酸铵将酶提取液沉淀、低温酶提取液沉淀、低温离心、收集沉淀、溶离心、收集沉淀、溶解在缓冲液中，透析解在缓冲液中，透析再再30-6030-60分钟，离心后分钟，离心后备用。备用。2 2，蛋白质含量测定蛋白质含量测定（1 1）标准曲线制作。以牛血清）标准曲线制作。以牛血清白蛋白作为标准样。浓度为白蛋白作为标准样。浓度为1mg/ml.1mg/ml.（2 2）酶提取液、沉淀后粗酶液）酶提取液、沉淀后粗酶液蛋白含量测定。如果测试得蛋白含量测定。如果测试得到的光吸收值超过到的光吸收值超过0.60.6，需，需要对样品进行稀释。要对样品进行稀释。（3 3）作图，计算样品蛋白含量。）作图，计算样品蛋白含量。3 3，酶催化活性测定酶催化活性测定（1 1）以邻苯二酚为底物测定酶催）以邻苯二酚为底物测定酶催化活性；底物化活性；底物(25mmol/L)(25mmol/L)用用量量5050 L L，酶液用量，酶液用量10-2010-20 L L。（2 2）以）以L-L-多巴为底物测定酶催化多巴为底物测定酶催化活性；底物活性；底物(2mg/mL)(2mg/mL)用量用量8080 L L，酶液用量，酶液用量100-400100-400 L L。（3 3）根据粗酶液蛋白浓度，计算）根据粗酶液蛋白浓度，计算每毫克蛋白的活力每毫克蛋白的活力- -即比活力。即比活力。以以OD390OD390或或OD475nmOD475nm变化变化0.0010.001为一个酶活力单位为一个酶活力单位4 4，粗酶液的电泳分析粗酶液的电泳分析（1 1）电泳凝胶的制备）电泳凝胶的制备（2 2）电泳）电泳（3 3）用邻苯二酚活性染色，）用邻苯二酚活性染色，照相记录实验结果。照相记录实验结果。（4 4）用考马斯亮蓝）用考马斯亮蓝G-250G-250染色，照相记录实验染色，照相记录实验结果。结果。（5 5）分析多酚氧化酶的分）分析多酚氧化酶的分子量和同工酶。子量和同工酶。三、实验安排三、实验安排 1 1，实验分组进行，每组，实验分组进行，每组四人，每人做一种材料。四人，每人做一种材料。 2，实验报告以研究论，实验报告以研究论文形式写作，主要对自文形式写作，主要对自己所做部分进行讨论分己所做部分进行讨论分析。析。 3，参阅其他同学的数，参阅其他同学的数据，进行比较，形成自据，进行比较，形成自己的论文。己的论文。 实验报告模式实验报告模式 1 1，前言，前言 2 2，材料与方法，材料与方法 3 3，实验结果，实验结果 4 4，讨论，讨论 5 5，参考文献，参考文献 6 6，实验体会，实验体会四，思考题四，思考题 1 1，在实验过程中，多酚氧化酶的提取时缓冲，在实验过程中，多酚氧化酶的提取时缓冲液中，加入抗坏血酸的目的是什么？液中，加入抗坏血酸的目的是什么？ 2 2，在蛋白质含量测定和电泳染色时，都使用，在蛋白质含量测定和电泳染色时，都使用了考马斯亮蓝染料，它们与蛋白质相互作用的了考马斯亮蓝染料，它们与蛋白质相互作用的原理是什么？原理是什么？ 3 3，多酚氧化酶催化活性的测定过程中，使用，多酚氧化酶催化活性的测定过程中，使用邻苯二酚或多巴作为底物，请问检测的机制是邻苯二酚或多巴作为底物，请问检测的机制是什么？什么？