PRRSV经典株与Nsp2变异株RT-PCR鉴别诊断方法的标准操作规程

PRRSV经典株与Nsp2变异株RT-PCR鉴别诊断方法的标准操作规程（检验SOP）1 适用范围本标准规定了猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）经典毒株与Nsp2基因缺失株的特异性逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）区分技术。本标准适用于疑似感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的猪的组织、血液及其他病料样品。2 . 试剂2.1 天根公司 TIANamp Virus RNA Kit 病毒 RNA 提取试剂盒，目录号：DP315-R2.2 赛百盛公司 goldview2.3 天根公司 Quant One Step RT-PCR Kit 目录号：KR1132.4 琼脂糖2.5 分析纯酒精（99.7%）2.6 6 DNA 电泳 Loading Buffer3 实验室条件3.1 仪器：PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳梢、冰箱、紫外仪、微量移液器、水浴箱等。3.2 从事PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出DNA提取区、基因扩增区、电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。4 . 试剂的准备4.1 扩增 PRRSV 的引物： PRRSV P1、 PRRSV P2、 PRRSV LOW。4.2 1.5%琼脂糖凝胶加入0.1% goldview4.3 1 TAE缓冲液4.4 goldview4.5 灭菌超纯水4.6 DNA 分子量标准( Marker DL1000)5 . 操作步骤5.1 样品处理处理材料：a.材料为发病猪只血液、血清或淋巴液可直接吸取140b.材料为细胞上清液，可直接使用140区新鲜上清混匀。c. 材料为贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液，反复冻融三次，然后3000r/min离心5min,取上清液140区bd.材料为病猪肺脏、淋巴结、扁桃体等病料样品时，需要先用生理 盐水或PBS进行研磨，收集研磨物后反复冻融3次，12 000r/min离心10min, 取上清140wLo5.2 用移液器将560"L Carrier RNAT作液(为裂解液RL与Carrier RNA溶 液的混合液，配制方法如附录配液表配制)加入一个干净的1.5mL离心管 中。注意：如果样本体积大于 1401,可等比例增加工作溶液和无水乙醇的用量。5.3 向离心管中加入140区检测样品（样品需平衡至室温），涡旋振荡 15秒混匀。注意：为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA 工作液需要彻底混匀。5.4 在室温（15-25）孵育10分钟。5.5 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。5.6 加入560区疣水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15秒。注意：如果周围环境高于25 , 乙醇需要在冰上预冷后再加入。5.7 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。5.8 仔细将离心管中的630W腋体转移至RNase-fre破WttiCR2（吸附柱放 在2mL收集管中），盖上管盖，6000>g （8000rpm）离心1分钟，弃废液, 将吸附柱放回收集管。注意：如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中，请加大转速，延长离心时间至液体完全转移到收集管中，如为组织苗，在过柱前请离心后将上清液过柱。5.9 重复此步骤7。5.10 小心打开吸附柱盖子，加入500小蟒液GD （使用前请先检查是否已 加入无水乙醇），盖上管盖，6000>g （8000rpm）离心1分钟，弃废液， 将吸附柱放回收集管。5.11 小心打开吸附柱盖子，加入500区喀液RW （使用前请先检查是否已 加入无水乙醇），盖上管盖，6000>g （8000rpm）离心1分钟，弃废液， 将吸附柱放回收集管。5.12 将吸附柱放回收集管中，13,400 g （12,000rpm）离心3分钟，使吸 附膜完全变干，弃废液。注意：乙醇的残留可能会对后续实验造成影响。5.13 可选步骤：将吸附柱放回2mL收集管中，打开吸附柱盖子，室温放 置3分钟，使吸附膜完全变干。5.14 将吸附柱放入一个RNase-free超净离心管(1.5mL)中，小心打开 吸附柱的盖子，向膜中央加入60区L RNase-free ddO,盖上盖子，室温 放置5分钟。6000>g (8000rpm)离心1分钟。5.15 可选步骤：将 上一步骤的洗脱 液再次 加入膜中 央，并6000为 (8000rpm)离心1分钟，以增强RNA洗脱效果。注意： 确保洗脱液( RNase-free ddH2O ) 在室温平衡后再使用。 如果加入洗脱液的体积很小(小于50科1),为了将膜上的RNA充分洗脱下来，应注意将洗脱液加到膜的中央位置。洗脱体积可以根据后续的实验要求灵活处理， 洗脱液 ( RNase-free ddH2O ) 加到吸附柱后， 离心前在室温放置5分钟，有助于提高RNA 的产量。5.16 将提取的RNA样品按照下条件进行RT-PCR,剩余部分请及时放入-80保存(所有配置工作均在冰上进行) 。检测设阴、阳性对照。配置如下体系：(25林L体系)Rnase-free ddHO8.75L10XRT-PCR buffer2.5dNTP Mixture1.05 XRT-PCR enhancer5.0Hotmaster Taq polymerase1.25LQuant Rtase0.25LRnase0.25L扩增引物(P1P2LOW)各1.0MRNA模板3.0区LPRRSV检测反应条件:反转录反应30min50 cPCR预变性4min94 c变性40s94 c 退火40s55 c 3 35 Cycles延伸40s65 c,(6)延伸10min65 c保温16C5.17 电泳5.17.1 制备1.5%琼脂糖凝胶板。5.17.2 取5山PCR产物与1人的上样缓冲液(10Moading buffer)混匀后加 入琼脂糖凝胶板的加样孔中。5.17.3 加入分子量标准。5.17.4 盖好电泳仪，插好电极，90V电压电泳，1h。5.17.5 在紫外仪观测下用数码相机照相并进行照片存档。5.17.6 用分子量标准比较判断PCR片段大小。6 .结果判定每次样品应当设置标准阳性对照(经典毒株与Nsp2缺失毒株)及空白对照，若待检样品扩增出与经典毒株标准阳性对照大小相同的特异性 条带且空白对照无条带，即可判为经典毒株感染；若检测样品扩增出Nsp2 基因缺失株标准阳性对照大小相同的特异性条带且空白对照无条带，即 可判断为Nsp2基因缺失毒株感染；未扩增出与标准阳性对照大小相近的特异性条带，则判为阴性；若空白对照扩增出与标准阳性对照相似的条带，则该次实验判为失败，应当重新进行一次RT-PCR检测图1 PRRSV的检测结果M: Marker DL1000 ; +1为CH-1a株阳性对照，+2为经典株阳性对照、+3为变异株阳性对照；1、2、3、4为样品编号。注：蓝耳变异株扩增目的片段为180bp，蓝耳经典株扩增目的片段为250bp。附录：TAE电泳缓冲液（50 X）1 0.5mol/L乙二俊四乙酸二钠（EDTA）溶液二水乙二俊四乙酸二钠灭菌双蒸水氢氧化钠灭菌双蒸水2 TAE电泳缓冲液（50 X配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris）冰乙酸0.5mol/L乙二俊四乙酸二钠溶液灭菌双蒸水3 1%琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖TAE电泳缓冲液（1 X）(pH8.0)18.61g80mL调pH至8.0力口至100mL242g57.1mL(pH8.0)100mL力口至 1 000mL1.5g100mL微波炉中完全融化，加goldview5也混匀。样品个数RV（mL） Carrier RNA水溶液（卜）样品个数RV（mL） Carrier RNA水溶液0.565.6137.2872.84 . Carrier RNA工作液的配制21.1211.2147.8478.431.6816.8158.4084.042.2422.4168.9689.652.828.0179.5295.263.3633.61810.08100.873.9239.21910.64106.484.4844.82011.20112.095.0450.42111.76117.6