细菌回复突变试验

附件9细菌回复突变试验Bacterial Reverse Mutati on Assay1范围本规范确定了细菌回复突变试验的基本原则、要求和方 法。本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。2定义2.1 回复突变 reverse mutation细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型 (prototroph)。2.2 基因突变 gene mutation在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。2.3 碱基置换突变 base substitution mutation引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌 呤被另一嘌呤所代替。颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替2.4 移码突变 frameshift mutation引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。2.5 纟田菌回复突变试验 bacterial reverse mutation assay利用一组组氨酸或者色氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌 碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型原养型回复突变的试验方法。2.6 S9经多氯联苯（PCB混合物）或苯巴比妥钠和 炉萘黄酮结合诱 导的大鼠制备肝匀浆，在 9000g下离心10min后的肝匀浆上清 液。3原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；大肠杆菌色氨酸营养缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生 长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。4仪器和设备培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热 烤箱、低温冰箱（80 C ）或液氮生物容器、普通冰箱、天平（精密度0.1g和O.OOOIg）、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿、生物安全柜等。5培养基和试剂5.1 0.5mmol/L 组氨酸一0.5mmol/L 色氨酸一0.5mmol/L 生物素溶液成分:L-组氨酸（MW155 ）78mgD-生物素（MW244 ）122mgL-色氨酸（MW204 ）102mg加蒸馏水/去离子水至1000mL配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa 下高压灭菌20min。贮于4 C冰箱。若试验中不使用大肠杆菌，则 不添加色氨酸。5.2顶层琼脂培养基成分：琼脂粉1.2g氯化钠1.0g加蒸馏水/去离子水至200mL配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。实验时，加入 0.5mmol/L组氨酸一0.5mmol/L色氨酸一0.5mmol/L 生物素溶液20mL。若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨 酸。5.3 Vogel-Bonner（V-B）培养基 E100g成分： 枸橼酸26出07出0）磷酸氢二钾（K2HPO4）500g磷酸氢铵钠（NaNHqHPOq 4出0）I75g硫酸镁（MgSO4 7H2O）log加蒸馏水/去离子水至1000mL配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓 缓倒入容量瓶中，加蒸馏水 /去离子水至1000mL。于0.103MPa 下高压灭菌30min。储于4C冰箱。5.4 20%葡萄糖溶液成分： 葡萄糖200g加蒸馏水/去离子水至1000mL配制：加少量蒸馏水/去离子水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水 / 去离子水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4C 冰箱。5.5底层琼脂培养基成分：琼脂粉7.5g蒸馏水/去离子水480mLV-B培养基E10mL20%葡萄糖溶液10mL配制：首先将前两种成分于0.103MPa下咼压火菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL 制备平板，冷凝固化后倒置于37 C培养箱中24h,备用5.6营养肉汤培养基成分：牛肉膏2.5g胰胨5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g加蒸馏水/去离子水至500mL配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压火菌30min。储于4C冰箱。5.7 盐溶液(1.65mol/L KCI+0.4mol/L MgCI2)成分：氯化钾(KCl)61.5g氯化镁(MgCl 2 6H2O)40.7g加蒸馏水/去离子水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下咼压火菌30min。储于4C冰箱。5.8 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)成分：磷酸二氢钠(NaH2PO4 2H2O)2.965g磷酸氢二钠(Na2HPO4 12H2O)29.015g加蒸馏水/去离子水至500mL配制：溶解上述成分后，于0.103MPa 下F咼压火菌30min。储于4C冰箱。5.9 S9混合液成分：每毫升S9混合液肝S9盐溶液100 pl20 pl灭菌蒸馏水/去离子水380 pl0.2mol/L磷酸盐缓冲液500 p辅酶 ll(NADP)4 pmol6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5 pmol配制：将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重， 然后按上述相反的次序加入各种成分，使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。该混合液必须临用现配， 并保存于冰水浴中。实验结 束，剩余S9混合液应该丢弃。5.10菌株鉴定用和特殊用途试剂5.10.1组氨酸-色氨酸-生物素平板成分：琼脂粉15g蒸馏水/去离子水934mL(V-B)培养基 E20mL20%葡萄糖20mL灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL)10mL灭菌盐酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)lOmL灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-B培养基、组氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中(若试验中不使用大肠 杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏水/去离子水改为 944mL )。待溶液稍微冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。5.10.2氨苄青霉素平板和氨苄青霉素 /四环素平板成分：琼脂粉15g蒸馏水/去离子水930mL(V-B)盐溶液20mL20%葡萄糖20mL灭菌盐酸组氨酸溶液(0.5g/100mL )lOmL灭菌盐酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)i0mL灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/L3.15mLNaOH 中)四环素溶液(8mg/mL 于 0.02mol/L HCl0.25mL中)配制：琼脂和水高压灭菌 20min，将无菌的葡萄糖、VB盐 溶液、组氨酸溶液和色氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中，混匀(若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸馏水/去离子水改为加 940mL )。冷却至大约50 C,无菌条件下加入四 环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。5.10.3营养琼脂平板成分：琼脂粉7.5g营养肉汤培养基500mL配制：于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板。6试验菌株及其生物学特性鉴定6.1试验菌株采用以下菌株作为标准组合：鼠伤寒沙门氏菌TA1535;鼠伤寒沙门氏菌TA97或TA97a或TA1537 ;鼠伤寒沙门氏菌TA98 ;鼠伤寒沙门氏菌TA100 ;鼠伤寒沙门氏菌 TA102或大肠杆菌 WP2 uvrA或大肠杆菌WP2uvrA（ pKM101）;6.2生物学特性鉴定新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。菌株鉴定的判断标准，如表1所示表1试验菌株鉴定的判断标准组氨 酸缺 陷色氨 酸缺 陷脂多氨苄自发回变菌落参考数菌株糖屏 障缺 损青霉 素抗 性切除修复 缺损四环素 抗性Ames实验室Zeiger实验室TA97+/+-90180*75200*TA97a+/+-90180*75200*TA98+/+-30502050TA100+/+-10020075200TA102+/+-+240320*100400*TA1535+/+-+-1035520TA1537+/+-+-315520WP2 uvrA/+/-+-/520WP2 uvrA（pKM101）/+/+-/100200注“ +表示需要组氨酸“ +表示需要色氨酸“ +表示具有fa突变“ +表示具有R因子+表示对于 鼠伤寒沙门 氏菌具有uvr B 突变，对于大 肠杆菌，具+表示 具有 pAQ1 质 粒*在体外代谢活化条件下自发回变菌 落数略增。对于各菌的自发回变范围，各个实 验至在参考其他头验至数据的基础 上应建立自己的历史对照数据库， 形成适合本实验室条件的适用范有ZuvrA突变围。同时，实验室背景数据应当与 文献报道相符。6.2.1组氨酸缺陷/色氨酸缺陷原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上， 则不能生长。色氨酸缺陷试验菌株本身不能合成色氨酸，只能在补充色 氨酸的培养基上生长，而在缺乏色氨酸的培养基上，则不能生 长。鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸或者色氨酸 培养基平板和无组氨酸或者色氨酸平板上划线，于37 C下培养24h后观察结果。结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平 板上生长，而在无色氨酸平板上则不能生长。6.2.2脂多糖屏障缺损原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障 缺损，因此一些大分子物质 ，如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从 而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。37 C下培养24h后观察结果。结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌 带，说明该待测菌株具有rfa突变。623氨苄青霉素抗性原理：含 R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与 否。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37C下培养24h后观察结果。结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。6.2.4紫外线敏感性原理：具有uvrB/A突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫 外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则 能照常生长。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm） 8秒钟。置37C下孵育24h后观察结果。结果判断：具有 AuvrB/A突变的菌株对紫外线敏感，经辐 射后细菌不生长，而具有完整地切除修复系统的菌株，则照常 生长。6.2.5四环素抗性原理：具有pAQI的菌株对四环素有抗性。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液O.ImL于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置 37C下孵育24h后观察结果。结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有 pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。626自发回变原理：每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称 为自发回变。这种自发回变是每种试验菌株的一项特性。鉴定方法：将待测菌株增菌液O.ImL加到2mL含组氨酸-色氨酸-生物素的顶层琼脂培养基的试管内（若试验中不使用大肠 杆菌，则不添加色氨酸），混匀后铺到于底层琼脂平板上，待 琼脂固化后，置 37C培养箱中孵育48 72h后记数每皿回变菌 落数。结果判断：每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表1要求。经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下 的略高。6.2.7回变特性-诊断性试验原理：每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及S9混合液的效应不一。鉴定方法：按照平板掺入试验的操作步骤进行。将受试物 换成诊断性诱变剂。结果判断：标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2表2测试菌株的回变性诱变剂剂量（回皿）S9TA97TA98TA100TA102TA1535TA1537 WP2vrAWP2uvrA (pKM101 )柔毛霉素6.0-124312347592/叠氮化钠1.5-7633000188320(0.5 g)i/CR-1911.0-1640631850/链霉黑素以工7八、习、0.25-inhinhinh2230/丝裂霉素C0.5-inhinhinh2772/2,4,7-三硝基-9-芴酮0.20-8377824440016/4-硝基-O-次苯二胺20-216015997980/4-硝基喹啉-N-氧化物0.5-5282924220287/610/甲基磺酸甲酯1.0(卩)1-1742327306586/敌克松50.0-26881198183895/9-氨基吖啶50-/337/2-氨基芴10+174261943026261/苯并（a）茁1.0+337143937255/110(5 g)/2-氨基恩20+/380(5 g)/300/注：inh表示抑菌。7大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备7.1诱导选择健康雄性成年大鼠，体重200g左右。将多氯联苯（PCB混合物）溶于玉米油中，浓度为200mg/mL，按500mg/kg体重一次腹腔注射， 5d后处死动物，处死前禁食12h。也可采用苯巴比妥钠和伕萘黄酮联合诱导的方法进行制备。经口或腹腔注射给予80mg/kg苯巴比妥钠和 80mg/kg炉萘黄酮，连续3天，处死前禁食16h。7.2 S9制备首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L氯化钾溶液3mL。用电动匀浆器制成肝 匀浆，再在低温高速离心机上，在4 C条件下，以 9000g离心10min，取其上清液（S9）分装于塑料管中。每管装2mL 3mL。储存于液氮生物容器中或80C冰箱中备用。上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。8溶剂的选择如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水/去离子水作为溶剂；如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有 机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO ）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按每皿使用剂量用 同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为100 pl。9剂量的设计决定受试物最咼剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。自发回变数的减少，背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒性的标志。对原料而言，一般最高剂量组可为5mg/皿或5 M皿。对产品而言，有杀菌作用的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度，无 杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液。受试物至少应设四个 剂量组。每个剂量均做三个平行平板。10试验操作步骤10.1增菌培养取营养肉汤培养基 5mL ,加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37 C振荡（100次/min ）培养10h。该菌株培养物应每毫升不少于1-2 109活菌数。10.2平板掺入法实验时，将含0.5mmol/L 组氨酸一0.5mmol/L 色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色 氨酸）的顶层琼脂培养基2.0mL分装于试管中，45C水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1mL,受试物溶液0.1mL和磷酸盐缓冲液 0.5mL或者S9混合液0.5mL （需代谢活 化时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之 分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37 C培养箱里孵育48 72h。记数每皿回变菌落数。实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和无菌对照。11数据处理和结果判断记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。如果受试物 TA1535、TA1537、WP2uvrA的回变菌落数是 溶剂对照回变菌落数的三倍或三倍以上，受试物TA97、 TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（ pKM101 ）的回变 菌落数是溶剂对照回变菌落数的二倍或二倍以上，并出现以下 情形之一，则该受试物判定为致突变阳性，（1）呈剂量-反应关系（2）任何一个剂量条件下，出现阳性反应并有可重复性受试物经上述五个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物细 菌回复突变试验为致突变阳性。如果受试物经五个试验菌株检 测后，无论加 S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突 变阴性。