0403细胞的基本培养技术

Chapter 4 Animal Cell Culture Biology of cells in culture Fluid for cell culture Standard cell culture techniques Establishing a cell line or cell strain Cell freezing and recoveryAnimal Cell EngineeringSection 3：细胞的基本培养技术细胞的基本培养技术培养操作的基本要领和要求培养操作的基本要领和要求 原代培养操作原代培养操作 传代培养操作传代培养操作 细胞计数细胞计数 细胞培养应注意的问题细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法细胞活力的测定方法培养操作基本要领和要求（培养操作基本要领和要求（1）无菌操作无菌操作 防治污染；成功或失败的首要条件防治污染；成功或失败的首要条件培养前准备培养前准备 操作卡片操作卡片 用品置于场地，然后消毒用品置于场地，然后消毒 操作野消毒操作野消毒 洗手和着装洗手和着装 火焰消毒火焰消毒培养操作基本要领和要求（培养操作基本要领和要求（2） 动作准确敏捷动作准确敏捷 不用手触及已消毒物品不用手触及已消毒物品 操作面布局合理操作面布局合理 操作保持一定顺序操作保持一定顺序 培养用瓶和吸管的放置培养用瓶和吸管的放置 防止各种用液的交叉污染防止各种用液的交叉污染 不向操作野讲话或咳嗽不向操作野讲话或咳嗽模拟实验（模拟实验（1）某生物技术公司招聘操作面试：某生物技术公司招聘操作面试：小鼠肝细胞（组织块）和脾细胞原代培养小鼠肝细胞（组织块）和脾细胞原代培养操作前（准备工作）：操作前（准备工作）：操作中（分离、培养的具体方法）操作中（分离、培养的具体方法）操作后（清洁）操作后（清洁） 1）培养前准备培养前准备：制定实验计划和操作程序。 2）超净台超净台要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。 3）个人个人进入无菌培养室原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁而灭消毒手和前臂。 4）实验中实验中需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。 5）分别使用分别使用不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用 6）不要用手不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。 7）注意操作时勿大声讲话或咳嗽勿大声讲话或咳嗽。Section 3：细胞的基本培养技术细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求培养操作的基本要领和要求原代培养操作原代培养操作 传代培养操作传代培养操作 细胞计数细胞计数 细胞培养应注意的问题细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法细胞活力的测定方法动物细胞培养过程图解动物细胞培养过程图解原代培养原代培养 Primary culture概念概念 从体内取出组织细胞从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行开始培养到第一次进行传代之前传代之前的时期，一个特征性的必然的生长阶的时期，一个特征性的必然的生长阶段。段。 完成了完成了从体内从体内环境环境到体外到体外环境的环境的过渡过渡和和适适应应过程，过程，恢复恢复了了分裂增殖分裂增殖与与生长发育生长发育 的能力的能力取材取材分离细胞分离细胞接种接种含义含义:包含包含原代培养实质是原代培养实质是初次培养初次培养，即培养物接种到培养器皿即培养物接种到培养器皿 中就中就不再分割不再分割，任其生长繁殖任其生长繁殖原代培养中的原代培养中的“代代” 并并不是指细胞繁殖的不是指细胞繁殖的“代代”数数原代培养过程中不分割培养物原代培养过程中不分割培养物 不等于不更换培养液不等于不更换培养液建立方法建立方法:组织块法组织块法；分散分散( (细胞悬液）法细胞悬液）法时间时间: 一般一般14周周 1、取 材 理论上讲，各种动物和人体内的所有组织都可理论上讲，各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养。以用于培养。 幼体较成体、分化程度低的较分化程度高的、幼体较成体、分化程度低的较分化程度高的、肿瘤组织较正常组织容易培养肿瘤组织较正常组织容易培养 组织取材应先切成组织取材应先切成1cm1cm3 3的小块，可置于培养液的小块，可置于培养液中中4 4度保存，不易超过度保存，不易超过2424小时。小时。 取材时避免污染及化学物质的损伤。取材时避免污染及化学物质的损伤。血细胞取材 静脉取血 指尖或耳垂取血 用肝素抗凝剂20u/ml 抽血严格无菌取鼠胚 用引颈法杀死动物 浸入75酒精中5分钟消毒 开腹取材取鸡胚 选新鲜受精鸡蛋，选新鲜受精鸡蛋，3737度孵育度孵育9 91212天，每天翻动天，每天翻动鸡蛋一次。鸡蛋一次。 无菌条件下，将鸡卵置于一个小烧杯中，令气无菌条件下，将鸡卵置于一个小烧杯中，令气室端向上，用碘酒消毒卵壳，再用酒精消毒。室端向上，用碘酒消毒卵壳，再用酒精消毒。 用弯剪刀环行剪除气室端卵壳，切开卵膜，暴用弯剪刀环行剪除气室端卵壳，切开卵膜，暴露出鸡胚。露出鸡胚。 用弯头钝玻璃棒伸入鸡胚头体之间下方，取出用弯头钝玻璃棒伸入鸡胚头体之间下方，取出鸡胚。鸡胚。问题：问题： 原代培养时，如何实现细胞的分原代培养时，如何实现细胞的分离和接种？离和接种？（1 1）细胞悬液的分离方法）细胞悬液的分离方法 材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可以采用离心法分离细胞。 一般多用5001000rmp，510分钟。2、分 离（2）组织的解离方法）组织的解离方法 解离组织：解离组织：在无菌情况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中，然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理。解离时应注意解离时应注意: :1) 尽可能将脂肪和坏死组织去除干净；2) 剪碎组织时，避免损伤组织块；3) 解离组织用的各种酶系，需要先进行低速离心。（3）解离细胞）解离细胞常用机械法机械法和消化法消化法进行当实验室需要制备具有均匀细胞层的培养物；当实验室需要制备具有均匀细胞层的培养物；从单个细胞出发获得细胞群体；从单个细胞出发获得细胞群体；从一定量的组织中获得最多的细胞量时。从一定量的组织中获得最多的细胞量时。A. 机械法解离细胞机械法解离细胞1 1）离心分离法离心分离法：适用于血液、腹水等细胞悬液的分离。2 2）切割分离法切割分离法：将组织块剪切成1mm3左右的小块。3 3）机械分散法机械分散法：纤维成分很少的某些软组织（脾、胸腺、脑等）。组织块分离 切割分离组织法 用剪刀剪至1mm3左右的大小的块。机械解离分离法 某些软组织如脑、胚胎和一些肿瘤等B. 消化法解离细胞消化法解离细胞1 1）胰蛋白酶解离细胞法）胰蛋白酶解离细胞法：所需时间较短，主要缺点是破损细胞。2 2）胶原酶解离细胞法）胶原酶解离细胞法：这种方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。胶原酶最终浓度200u/ml，36.5温育，一般温育4-48h。胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织。3 3）螯合剂解离细胞法）螯合剂解离细胞法：分离效果差（通常用（通常用1 1：1 1的的EDTAEDTA和和胰蛋白酶胰蛋白酶混合液）混合液）消化分解法 胰蛋白酶法 适用消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等 钙离子、镁离子、血清等都对其有抑制作用。胶原酶解细胞法 结缔组织复合胶原，用胶原酶解，使胶原酶最终浓度为200u/ml，36.5，静置448小时，上面悬液经离心获得或纤维细胞沉淀，沉淀重置于生理盐水，去掉未解向组织块后沉淀得到上皮样细胞。EDTA法 乙二胺四乙酸二钠，非酶性消化物 用于消化分离传代细胞，能螯合钙离子，镁离子， EDTA工作液用不含钙离子和镁离子的BSS配制成0.02%的浓度 通常和0.25的胰蛋白酶1：1合用Section 3：细胞的基本培养技术细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求培养操作的基本要领和要求 原代培养操作原代培养操作传代培养操作传代培养操作 细胞计数细胞计数 细胞培养应注意的问题细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法细胞活力的测定方法能能维持的代数维持的代数一般一般是是有限细胞系有限细胞系种族种族(主要主要):成纤维细胞成纤维细胞 人人,50; 猴猴,40; 鸡鸡,37;鼠鼠,8 部位部位:人人: 胚肺胚肺 5010; 肾肾819 猴猴: 肺肺 5; 肾肾 20; 耳耳 40条件条件:如表皮细胞如表皮细胞 +EGF 从从50代代 增加至增加至150年龄年龄模拟实验（模拟实验（2）小鼠肝细胞和脾细胞原代培养两周后，进小鼠肝细胞和脾细胞原代培养两周后，进行传代培养行传代培养肝细胞：肝细胞：脾细胞：脾细胞：细胞传代方法细胞传代方法根据细胞生长的特点，传代方法有根据细胞生长的特点，传代方法有3种：种：1 1、悬浮生长细胞传代、悬浮生长细胞传代 离心法传代离心法传代：离心（离心（1000转转/分分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/2一一2/3，然后用，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 2、半悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。从瓶壁脱落下来，进行传代。3 3、贴壁生长细胞传代、贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液（含的胰蛋白酶液（含0.02% EDTA）。）。贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法1、吸尽（或倒掉）培养瓶中的培养液、吸尽（或倒掉）培养瓶中的培养液2、加入、加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测显微镜下动态监测）。）。3、吸去胰蛋白酶液，加入培养液（、吸去胰蛋白酶液，加入培养液（可终止胰酶的作用可终止胰酶的作用）。）。4、用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞、用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。悬液。5、吸取、吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7、将后者放入培养箱中培养。、将后者放入培养箱中培养。动物细胞的传代培养动物细胞的传代培养常用细胞培养技术常用细胞培养技术 悬滴培养悬滴培养 培养瓶培养培养瓶培养 旋转管培养旋转管培养 细胞同步化培养细胞同步化培养 克隆培养（克隆培养（见后见后）Cell culture常用培养技术常用培养技术1 1、悬滴培养、悬滴培养l也称组织块悬滴培养，是最早建立的体外培养技术，是组织和器官培养的经典方法。l将培养液滴于盖玻片上并铺展开，将待培养的组织或器官植块放于铺展开的培养液中央部位，然后将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封后进行培养。Cell culture2 2、培养瓶培养、培养瓶培养l将拟培养对象直接接种于培养瓶内再放入培养箱进行培养的方法。3 3、旋转管培养、旋转管培养l将所培养的组织细胞接种在一管状培养皿（称旋转管），再将旋转管置于一可旋转的装置上，边旋边进行培养的一种方法。Cell culture4 4、 克隆培养法克隆培养法l又称单细胞分离培养法，就是将从细胞悬浮液中获得的单个细胞用于培养，使之重新衍生成一个新细胞群体的培养技术。l克隆培养法强调培养产物的单一性而排除异质性，所获得的培养产物遗传产物几乎完全相同，即培养得到的后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞，称细胞株。Section 3：细胞的基本培养技术细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求培养操作的基本要领和要求 原代培养操作原代培养操作 传代培养操作传代培养操作细胞计数细胞计数 细胞培养应注意的问题细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法细胞活力的测定方法细胞计数细胞计数 血细胞计数板：手工计数细胞细胞数细胞数/毫升细胞悬液毫升细胞悬液4大格细胞总数大格细胞总数/410000稀释倍数稀释倍数1毫米毫米计数原则：计数原则：不数死细胞（染不数死细胞（染蓝）、压线细胞数蓝）、压线细胞数上不数下，数左不上不数下，数左不数右，一团细胞按数右，一团细胞按一个计数！一个计数！Section 3：细胞的基本培养技术细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求培养操作的基本要领和要求 原代培养操作原代培养操作 传代培养操作传代培养操作 细胞计数细胞计数细胞培养应注意的问题细胞培养应注意的问题 细胞活力的测定方法细胞活力的测定方法细胞培养中应注意的几个问题细胞培养中应注意的几个问题 1 1）培养液和培养物的比例）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。的细胞浓度。2 2）pHpH：初培养初培养pHpH应为应为7.47.4，培养过程应不低于，培养过程应不低于7.07.0。（耐酸不耐碱耐酸不耐碱）3 3）培养瓶内的空间）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为的空间体积之比为1:101:10。 4 4）容积、深度、表面面积）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.20.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（5mm）中生长较好。5 5）去除死细胞）去除死细胞6 6）温度控制）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5，细胞生长缓慢；温度高于37.5，细胞存活力降低。Section 3：细胞的基本培养技术细胞的基本培养技术 培养操作的基本要领和要求培养操作的基本要领和要求 原代培养操作原代培养操作 传代培养操作传代培养操作 细胞计数细胞计数 细胞培养应注意的问题细胞培养应注意的问题细胞活力的测定方法（细胞活力的测定方法（P28） 细胞计数，血球计数板和电子细胞计数仪 生长曲线：（潜伏期，对数生长期，水平静止期）由于细胞基数和生长进度不同，生长曲线不一致。 细胞分裂指数，分裂细胞占全部细胞的比例 细胞贴壁率=贴壁存活细胞/接种细胞*100% 细胞周期时间测定：用同位素标记，流式细胞仪测定细胞同期Cell culture: Biologys new dimensCell culture: Biologys new dimensionion Role reversal: unlike in 2-D cultures, breast tumour cells in 3-D culture (left) that become malignant (centre) can be made to revert to their original state (right) when an antibody against b b-integrin is added to the system.2003. 8.21 Nature3D culture versus 2D culture3D culture versus 2D cultureCancer cells (green) can escape from their location by becoming amoeba-like (red), an observation first made using a 3-D tissue culture !