第八章 植物种质资源的保存(笔记)

2007200720082008学年下学期学年下学期课程名称：细胞工程课程名称：细胞工程 任课教师：董玉梅任课教师：董玉梅第八章第八章 植物种质资源的保存植物种质资源的保存第一节第一节 植物种质资源的概念及保存意植物种质资源的概念及保存意义义第二节第二节 种质资源的保存类型种质资源的保存类型第三节第三节 种质资源的离体保存种质资源的离体保存第一节第一节 植物种质资源的概念植物种质资源的概念 及保存意义及保存意义一、种质资源的相关概念一、种质资源的相关概念二、植物种质资源保存的意义二、植物种质资源保存的意义一、种质资源的相关概念一、种质资源的相关概念 1. 种质：种质：是决定生物遗传性状，并将遗传信是决定生物遗传性状，并将遗传信 息从亲代传递给子代的遗传物质。息从亲代传递给子代的遗传物质。 种质资源也称为品种资源或遗传资源。2.种质资源： 携带各种种质的携带各种种质的材料称为种质资源材料称为种质资源二、植物种质资源保存的意义二、植物种质资源保存的意义 1. 防止植物种质资源从地球上消亡，减缓防止植物种质资源从地球上消亡，减缓生物多生物多样性样性减少的步伐。减少的步伐。 2. 广泛收集植物种质资源，经鉴定部分可直接应广泛收集植物种质资源，经鉴定部分可直接应用于生产。用于生产。3. 主要目的还是用作品种选育的主要目的还是用作品种选育的材料材料。什么是生物多样性？什么是生物多样性？o生物多样性指的是地球上生物圈中所有的生物多样性指的是地球上生物圈中所有的生物，即动物、植物、微生物，以及它们生物，即动物、植物、微生物，以及它们所拥有的基因和生存环境。它包含三个层所拥有的基因和生存环境。它包含三个层次：遗传多样性，物种多样性，生态系统次：遗传多样性，物种多样性，生态系统多样性。多样性。生态系统多样性生态系统多样性o即群落和生态系统的丰富程度，是指生物即群落和生态系统的丰富程度，是指生物圈内生境、生物群落和生态系统的多样性圈内生境、生物群落和生态系统的多样性以及生态系统内生境差异、生态过程变化以及生态系统内生境差异、生态过程变化的多样性。的多样性。 物种多样性物种多样性o它指有生命的有机体即动物、植物、微生它指有生命的有机体即动物、植物、微生物物种的多样化。全世界科学家对物种数物物种的多样化。全世界科学家对物种数量还没有精确的估计，其变化幅度为量还没有精确的估计，其变化幅度为500万万至至5000万种，甚至多达万种，甚至多达1亿种。而现在已定亿种。而现在已定名或描述的物种仅有名或描述的物种仅有140万或万或170万种。万种。 基因或遗传多样性基因或遗传多样性o是指种内基因的丰富程度，包括同种的显是指种内基因的丰富程度，包括同种的显著不同种群（如水稻的不同品种）和同一著不同种群（如水稻的不同品种）和同一种群内的遗传变异。种群内的遗传变异。o通常情况下，人们所说的生物多样性多指通常情况下，人们所说的生物多样性多指物种多样性。物种多样性。o因此保存植物种质资源就是保护遗传多样因此保存植物种质资源就是保护遗传多样性，或是保护生物多样性。性，或是保护生物多样性。生物多样性策略和行动计划生物多样性策略和行动计划 o世界上的保护区是极其重要的保护生物多样世界上的保护区是极其重要的保护生物多样性的设施。与诸如动物园、植物园、种子库性的设施。与诸如动物园、植物园、种子库等迁地保护设施相结合，保护区能够保护世等迁地保护设施相结合，保护区能够保护世界生物多样性的大部分，而且有助于发挥其界生物多样性的大部分，而且有助于发挥其效益。同时，保护生物多样性的行动必须在效益。同时，保护生物多样性的行动必须在人们工作与生活的地方深入开展。人们工作与生活的地方深入开展。生物多样性公约生物多样性公约（Convention on Biological Diversity）o是一项保护地球生物资源的国际性公约，于是一项保护地球生物资源的国际性公约，于19921992年年月日在内罗毕通过，月日在内罗毕通过，19921992年月日，由签约年月日，由签约国在巴西里约热内卢举行的联合国环境与发展大会国在巴西里约热内卢举行的联合国环境与发展大会上签署。公约于上签署。公约于19931993年年1212月月2929日正式生效。日正式生效。截止截止2004年月，该公约的签字国有年月，该公约的签字国有188个。中国于个。中国于1992年月年月11日签署该公约。日签署该公约。生物多样性公约生物多样性公约o该公约是一项有法律约束力的公约，旨在该公约是一项有法律约束力的公约，旨在保护濒临灭绝的植物和动物，最大限度地保护濒临灭绝的植物和动物，最大限度地保护地球上的多种多样的生物资源，以造保护地球上的多种多样的生物资源，以造福于福于当代和子孙后代当代和子孙后代。国际生物多样性日国际生物多样性日o1994年年12月，联合国大会通过决议，将每年的月，联合国大会通过决议，将每年的12月月29日定为日定为“国际生物多样性日国际生物多样性日”，以提高人们，以提高人们对保护生物多样性重要性的认识。从对保护生物多样性重要性的认识。从2001年起，年起， “国际生物多样性日国际生物多样性日”由原来的每年由原来的每年12月月29日改日改为为5月月22日，以方便各国举办各种纪念活动。日，以方便各国举办各种纪念活动。 国际生物多样性日历年主题 2001年年 “生物多样性与外来入侵物种管理生物多样性与外来入侵物种管理”2002年年 “林业生物多样性林业生物多样性”2003年年 生物多样性和减贫对可持续发展的挑战生物多样性和减贫对可持续发展的挑战 2004年年 生物多样性：全人类食物、水和健康的保障生物多样性：全人类食物、水和健康的保障 2005年年 生物多样性生物多样性变化世界的生命保障变化世界的生命保障 2006年年 保护干旱地区的生物多样性保护干旱地区的生物多样性 2007年年 生物多样性与气候变化生物多样性与气候变化 生物多样性减少生物多样性减少o目前世界上的生物物种正在以每天几种到目前世界上的生物物种正在以每天几种到几十种的速度消失。这是地球资源的巨大几十种的速度消失。这是地球资源的巨大损失，因为物种一旦消失，就永不再生。损失，因为物种一旦消失，就永不再生。消失的物种不仅会使人类失去一种自然资消失的物种不仅会使人类失去一种自然资源，还会通过食物链引起其他物种的源，还会通过食物链引起其他物种的消失。消失。世界育种史上的突破性成就世界育种史上的突破性成就 如水稻籼稻矮源低脚乌尖、小麦矮源农林如水稻籼稻矮源低脚乌尖、小麦矮源农林10号与号与世界范围世界范围“绿色革命绿色革命”；水稻矮源矮脚南特和矮；水稻矮源矮脚南特和矮子粘与我国水稻矮秆育种；子粘与我国水稻矮秆育种； “世界杂交水稻之父世界杂交水稻之父”，袁隆平院士的，袁隆平院士的“野败野败” 与杂交水稻育种与杂交水稻育种 因此因此o作物育种成效取决于所掌握的种质资源数作物育种成效取决于所掌握的种质资源数量的多少和对其性状表现及遗传规律研究量的多少和对其性状表现及遗传规律研究的深入程度。拥有丰富多样的种质资源，的深入程度。拥有丰富多样的种质资源，并对其进行保护，是创造或选育新品种的并对其进行保护，是创造或选育新品种的物质基础。物质基础。植物种质资源保存植物种质资源保存o是指利用天然或人工创造的适宜环境保存是指利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中所包含遗传物质保持种质资源，使个体中所包含遗传物质保持其遗传完整性和活力，并能通过繁殖将其其遗传完整性和活力，并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。遗传特性传递下去。第二节第二节 种质资源的保存类型种质资源的保存类型o按保存的地理位置按保存的地理位置o一、原生境保存（原地保存）一、原生境保存（原地保存）o二、非原生境保存（异地保存、迁地保存）二、非原生境保存（异地保存、迁地保存）一、原生境保存（原地保存）一、原生境保存（原地保存） 是将植物的遗传材料保存在它们的自然生是将植物的遗传材料保存在它们的自然生境中。原生境保存的地方多是植物保护区，境中。原生境保存的地方多是植物保护区，它是保存植物整个群落的最好方法。它是保存植物整个群落的最好方法。 中国国家级自然保护区名录，截止到中国国家级自然保护区名录，截止到2007年年8月为月为303个。个。原生境保存原生境保存o农田种植保存，即将原生境植物种植在农农田种植保存，即将原生境植物种植在农田中进行保护。云南水稻就是这种保护方田中进行保护。云南水稻就是这种保护方式的一个例子，数以千计的云南水稻农家式的一个例子，数以千计的云南水稻农家品种种植在农田中得以保护。品种种植在农田中得以保护。二、非原生境保存二、非原生境保存o是将植物的遗传材料保存在不是它们的自是将植物的遗传材料保存在不是它们的自然生境的地方。然生境的地方。o非原生境保存方式有非原生境保存方式有植物园植物园、种子库种子库、种种质圃质圃、试管苗库试管苗库、超低温库超低温库等。等。植物园植物园o从英国皇家植物园到我国的南京中山植物园、北从英国皇家植物园到我国的南京中山植物园、北京植物园、昆明植物园等，其主要任务为发掘野京植物园、昆明植物园等，其主要任务为发掘野生植物资源，引进国内外重要经济植物，调查收生植物资源，引进国内外重要经济植物，调查收集珍稀和濒危植物种类，丰富本国栽培植物的种集珍稀和濒危植物种类，丰富本国栽培植物的种类和品种，为生产实践服务类和品种，为生产实践服务 。o调查、采集、鉴定、引种、驯化、保存和推广利调查、采集、鉴定、引种、驯化、保存和推广利用植物的科研单位，以及普及植物科学知识，并用植物的科研单位，以及普及植物科学知识，并供群众游憩的园地。供群众游憩的园地。 目前国际和国内均有一些机构或组织进行各目前国际和国内均有一些机构或组织进行各种植物遗传资源的保存。种植物遗传资源的保存。1.保护植物种质资源的保护植物种质资源的国际机构国际机构，如国际小麦研，如国际小麦研究中心、国际马铃薯中心、国际水稻研究中心、究中心、国际马铃薯中心、国际水稻研究中心、国际遗传资源研究所等。国际遗传资源研究所等。2.国家植物种质资源平台及其国家植物种质资源平台及其7个平台子系统。个平台子系统。3.保护植物种质资源的保护植物种质资源的32个国家级种质圃。个国家级种质圃。4.保护植物种质资源的保护植物种质资源的13个国家级种质中期库。个国家级种质中期库。种质存入国家种质库有何意义种质存入国家种质库有何意义o植物种质资源是在不同生态条件下经过上千年的植物种质资源是在不同生态条件下经过上千年的自然演变形成的，蕴藏着各种潜在可利用基因，自然演变形成的，蕴藏着各种潜在可利用基因，是国家的宝贵财富，是人类繁衍生存和发展的物是国家的宝贵财富，是人类繁衍生存和发展的物质基础。因此，从大的方面来讲，国家把这些资质基础。因此，从大的方面来讲，国家把这些资源收集起来作为战略资源加于保存，以备子孙后源收集起来作为战略资源加于保存，以备子孙后代加以利用，其意义重大。从小的方面讲，资源代加以利用，其意义重大。从小的方面讲，资源存入国家种质库，除对国家有重要作用外，对个存入国家种质库，除对国家有重要作用外，对个人和单位也是非常有益处的。人和单位也是非常有益处的。例例 1998年以来，已有云南农科院、山西农科院、江苏盐年以来，已有云南农科院、山西农科院、江苏盐都农科所、湖南水稻所、湖南原子能农业应用研究所、都农科所、湖南水稻所、湖南原子能农业应用研究所、中国农科院烟草所、中国农业科学院作物所等十多个中国农科院烟草所、中国农业科学院作物所等十多个单位，从国家长期库取出他们早期存入的种子，其取单位，从国家长期库取出他们早期存入的种子，其取种的种的原因原因是他们自己保存的种子已丧失发芽率，或者是他们自己保存的种子已丧失发芽率，或者因保存条件差及人员的变动，使得原材料已绝种。这因保存条件差及人员的变动，使得原材料已绝种。这些单位取出材料已应用于育种项目，或者用于申请国些单位取出材料已应用于育种项目，或者用于申请国家重大科研项目。家重大科研项目。 送种途径送种途径o属于农作物种质资源，按目前入库保存渠道，由属于农作物种质资源，按目前入库保存渠道，由各作物牵头单位负责统一编目、统一安排繁种送各作物牵头单位负责统一编目、统一安排繁种送交国家长期库保存。例如，某单位现有几百份麻交国家长期库保存。例如，某单位现有几百份麻类种质资源，且未存入国家长期库保存，则可与类种质资源，且未存入国家长期库保存，则可与中国农科院麻类所联系，由该所来协调统一编目中国农科院麻类所联系，由该所来协调统一编目和繁种，然后送交国家长期库保存。和繁种，然后送交国家长期库保存。 o属于农作物以外的种质资源或按目前入库渠道，属于农作物以外的种质资源或按目前入库渠道，没有指定单位负责的作物种质资源，可直接与国没有指定单位负责的作物种质资源，可直接与国家种质库联系。家种质库联系。 取种途径取种途径 因国家种质库长期库保存资源是作为国家战略资因国家种质库长期库保存资源是作为国家战略资源加以长期保存，按国际上通行做法，原则上国源加以长期保存，按国际上通行做法，原则上国家长期库保存资源不对外分发供种。只有一种情家长期库保存资源不对外分发供种。只有一种情况下才可从国家种质库（长期库）提取种子，即况下才可从国家种质库（长期库）提取种子，即原提供单位绝种的种质材料。若想获取种质资源，原提供单位绝种的种质材料。若想获取种质资源，可向国家各作物中期库获取，国家中期库主要职可向国家各作物中期库获取，国家中期库主要职责是负责种质资源的中期保存和分发供种。责是负责种质资源的中期保存和分发供种。非原生境保存的具体方法非原生境保存的具体方法o1. 种植保存种植保存o2. 贮藏保存贮藏保存o3. 离体保存离体保存o4. 基因文库保存基因文库保存1、 种植保存 为了保持品种资源的种子或无性繁殖器官的生为了保持品种资源的种子或无性繁殖器官的生活力活力 , 并不断补充其数量并不断补充其数量 , 品种资源材抖须每隔一品种资源材抖须每隔一定时间播种种植一次定时间播种种植一次 , 即种植保存。即种植保存。 在种植保存时在种植保存时 , 种植条件尽可能与原产地相似种植条件尽可能与原产地相似 , 以减少由于生态条件的改变而引起的变异和自然选以减少由于生态条件的改变而引起的变异和自然选择的影响。在种植过程中应尽可能避免或减少天然择的影响。在种植过程中应尽可能避免或减少天然杂交和人为混杂。杂交和人为混杂。2、 贮藏保存 贮藏保存就是用控制贮藏条件 ( 主要是温度和湿度 ) 的方法 , 来保持品种资源种子的生活力。低温、干燥、缺氧 可抑制总之呼吸，是延长种子寿命的有效措施。贮藏保存o当种子含水率在当种子含水率在4%14%时，含水率每下时，含水率每下降降1%，种子寿命可延长一倍；贮藏温度在，种子寿命可延长一倍；贮藏温度在030时，温度每降低时，温度每降低5 5 ，种子寿命可，种子寿命可延长一倍。延长一倍。贮藏条件贮藏条件o温度：温度：-18 1 1 o相对湿度相对湿度50%50%o含水量干燥脱水至含水量干燥脱水至5 57 7，大豆为，大豆为8 8o种子寿命在种子寿命在5050年以上年以上3、基因文库保存 利用利用人工方法，从植物材料中获利用利用人工方法，从植物材料中获取总取总DNADNA，然后用限制性内切酶将，然后用限制性内切酶将DNADNA切成切成许多片段并与载体连接，然后转移到大肠许多片段并与载体连接，然后转移到大肠杆菌或酵母中进行繁殖，使生物体内的所杆菌或酵母中进行繁殖，使生物体内的所有基因都得到保存。如拟南芥、水稻等基有基因都得到保存。如拟南芥、水稻等基因文库。因文库。 4. 离体保存离体保存o是将植物外植体在无菌的环境中利用组织是将植物外植体在无菌的环境中利用组织培养技术进行植物种质资源保存的方法。培养技术进行植物种质资源保存的方法。它是利用细胞工程技术对植物种质资源进它是利用细胞工程技术对植物种质资源进行保存的一种方法。如甘薯试管苗库和马行保存的一种方法。如甘薯试管苗库和马铃薯试管苗库。铃薯试管苗库。第三节 植物资源离体保存 一、低温保存 二、超低温保存 三、生长抑制剂保存一、低温保存一、低温保存o是通过控制培养温度来限制培养物各种限制是通过控制培养温度来限制培养物各种限制因子的作用，使培养物生长减少到最低限度。因子的作用，使培养物生长减少到最低限度。植物对低温的耐受力与它们的起源和最适生植物对低温的耐受力与它们的起源和最适生长的生态条件有关，热带植物对低温的耐受长的生态条件有关，热带植物对低温的耐受力较温带作物差。力较温带作物差。 二、超低温保存（一）超低温保存的原理（二）超低温保存基本程序（三）影响超低温保存效果的因素（四）超低温保存后细胞和组织活力检测（一）超低温保存的原理冷冻防护剂的用途冷冻防护剂的用途（二）超低温保存基本程序1. 冷冻前材料预处理 预处理方法：将保存材料放在高糖浓度、添加二甲基亚砜（DMSO）、脯氨酸等冷冻防护剂的培养基中，在接近零度下培养数日。 2、冷冻处理（1 1）快速冷冻）快速冷冻将植物材料从0 或者其它预处理温度直接投入液氮中保存的方法。降温速度为1000 /min。植物体内的水分在降温冷冻过程中，从-10-140范围内是冰晶形成和增长的危险温度区，到-140时完全停止增长，关键是利用高速降温越过冰晶增长的危险温度区，不能形成致死的冰晶，细胞内水分固化，不会破坏细胞结构。 （2）慢速冷冻法 将植物材料从将植物材料从0 或者其它预处理温度以降或者其它预处理温度以降温速度为温速度为12 /min从起始温度降到从起始温度降到-100 ，稳，稳定定1h后投入液氮中保存或以此降温速度降至后投入液氮中保存或以此降温速度降至-196 。 在这种降温速度下，细胞内水分有充分的时在这种降温速度下，细胞内水分有充分的时间不断渗入到细胞外结冰，使细胞内水分减少到间不断渗入到细胞外结冰，使细胞内水分减少到最底限度，避免细胞内结冰最底限度，避免细胞内结冰 。 （3）预冷冻法 投入液氮前，需经过短暂时间的低温锻炼的方法两步冷冻： 采用12 /min慢速冷冻至-40 ，停留一段时间，快速冷冻。 逐级冷冻：当无程序降温仪时，材料通过不同温度等级降温至-40 ，停留一段时间，投入液氮快速冷冻。 （4）干燥冷冻 将材料置于2729 烘箱内降低植物含水量，在投入液氮中保存。此法可以防止材料冻死。 3、冷冻保存 -196液氮冰箱中或液氮罐中保存。 4、保存材料解冻 （1 1）快速解冻法）快速解冻法保存材料直接投入到保存材料直接投入到3740 3740 水浴中进行解冻的水浴中进行解冻的方法。方法。-50-10 -50-10 是再结冰的温度区是再结冰的温度区（2 2）慢速解冻）慢速解冻先置于先置于0 0 解冻，在逐渐升温至室温。可以使水解冻，在逐渐升温至室温。可以使水分慢慢渗入细胞内。分慢慢渗入细胞内。 5、保存材料复苏培养 保存材料解冻后，需用液体培养基冲洗几遍，除去冷冻防护剂的残留毒害。然后可以在固体培养基上进行培养，进行正常生长，再生植株。 重新生长的细胞（组织） 存活率= 100% 解冻的细胞（组织） （三）影响超低温保存效果的因素o1. 植物材料植物材料o2. 冷冻防护剂冷冻防护剂（四）超低温保存后细胞和组织活力检测（四）超低温保存后细胞和组织活力检测o再培养再培养三、生长抑制剂保存法三、生长抑制剂保存法o1. 高渗保存法高渗保存法o2. 生长抑制剂保存法生长抑制剂保存法o3. 抑制生长的其他保存法抑制生长的其他保存法