Sirt3在电离辐射损伤中的抗氧化机制研究

Sirt3 在电离辐射损伤中的抗氧化机制研究王彦，杜利清，徐畅，樊飞跃，刘强（中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所）51015摘要：目的观察 293T 细胞经不同剂量 137Cs射线照射后，细胞中沉默信息调节因子 3（sirt3）及相关抗氧化因子的变化，研究 sirt3 基因在辐射防护中的抗氧化活性机理。方法对 293T 细胞分别进行 2Gy、4Gy、8Gy、16Gy 照射，采用 real-time PCR 的方法，检测照后 6h、12h、24h、48h，细胞中 sirt3 和超氧化物歧化酶 2（SOD2）mRNA 的表达水平变化；采用免疫印迹法，检测细胞中 sirt3 和 SOD2 蛋白水平随时间的变化；采用 siRNA 干扰和抑制剂处理的方法，检测 sirt3 与 SOD2 的作用关系；采用 SOD Assay Kit-WST 试剂盒检测细胞中 SOD2活性的变化；流式细胞术检测细胞中活性氧（ROS）随时间的变化。结果分组处理后，细胞中 sirt3 和 SOD2 的 mRNA 水平和蛋白质水平均表现出不同程度的上升，分别在 12 h（t=7.620，P0.05）和 24 h（t=5.954，P0.05）达到最大值；sirt3 siRNA 干扰和抑制剂处理结果显示 sirt3是 SOD2 的上游调控因子；照射 24 h 后细胞中 SOD2 的活性显著增加（t=12.555, P0.05），细胞中 ROS 水平也发生相应变化。结论 sirt3 可能通过对细胞中 SOD2 的表达量及活性调控加强抗氧化保护系统，为临床辐射防护和治疗提供理论基础和潜在靶点。关键词：电离辐射；沉默信息调节因子 3；超氧化物歧化酶 2；活性氧中图分类号：Q69120The antioxidant mechanism research of Sirt3 in ionizingradiation-induced damageWang Yan, Du Liqing, Xu Chang, Fan Feiyue, Liu Qiang(Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical253035College)Abstract: Objective To study the effects of the silent information regulator 3(Sirt3) and thecombined anti-oxidation factors in 293T cells responses to ionizing radiation(IR)-induced damage.Methods Real-time PCR and immunoblotting were used to examine the changes of sirt3 andSOD2 in 293T cells exposed to 2, 4, 8, 16 Gy at 6, 12, 24, 48(72) h. Specific siRNA was used todeplete sirt3 in cells and inhibitor was used to decrease SOD2 protein levels. SOD2 activities weremeasured by SOD Assay Kit-WST kits and ROS in cells were detected by flow cytometry. ResultsIn response to IR, the mRNA levels of sirt3 and SOD2 were reached the maximum at 12 h(t=7.620, P7.620) and 24 h (t=5.954, P0.05), and protein levels also increased. Sirt3 was aupstream regulatory factor of SOD2. The activity of SOD2 were much higher at 24h（t=12.555,P0.05）than that in the control cells as well as the level of ROS. Conclusion sirt3 may strengthenantioxidant protection system through regulation of the SOD2 expression and activity , andpossibly plays an important role in IR-induced damage response and clinic treatment.Key words: Ionizing radiation; Silent information regulator 3; Superoxide dismutase 2; Reactiveoxygen species400 引言辐射损伤最主要的机理之一是通过水的电离增加机体内活性氧（ROS）水平，产生氧化应激损伤，是辐射防护研究的重要靶点之一。Sirt3 是哺乳动物 7 个 sirtuins 家族成员之一，与酵母沉默信息调节基因 sir2 同源，定位于线粒体1，参与线粒体蛋白的翻译后修饰调节，基金项目：卫生部卫生行业科研专项 201002009，国家自然科学基金资助项目（31240052）；作者简介：王彦（1975-），女，副研究员，主要从事放射生物学研究通信联系人：刘强（1974-），男，研究员，主要从事放射生物学研究. liuqiangirm-1-4550影响线粒体的能量代谢、底物氧化和细胞凋亡等活动2。超氧化物歧化酶 2（SOD2）也存在于线粒体，有研究发现 sirt3 能够直接导致 SOD2 的去乙酰化，增强细胞抗氧化活性，清除细胞中 ROS3。因此，sirt3 可能在电离辐射中通过增强细胞中抗氧化活性发挥辐射防护作用。本研究初步探索不同剂量照射下，293T 细胞中 sirt3 及其下游调控因子的变化，期望能够为临床辐射防护和治疗提供理论基础和潜在靶点。1 材料与方法1.11.1.1实验材料三级标题人胚肾上皮细胞（293T）由本实验室留存，用含 10%胎牛血清（购自美国 Gibco 公司）的 DMEM 培养基 37、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱传代培养。TRIzol（购自 invitrogen55公司），逆转录试剂盒（购自 Takara 公司），SYBR Green 预混合物（购自 Roche 公司），sirt3 抗体、SOD2 抗体（均购自 abcam 公司），-tublin、兔抗、鼠抗（均购自北京康维试剂生物有限公司），BCA 蛋白定量试剂盒、SOD2 活性检测试剂盒、ROS 检测试剂盒（均购自于碧云天），siRNA（购自 santa 公司），引物委托上海生工生物有限公司合成。601.2实验分组和照射条件实验分为空白对照组，单纯照射组（照射剂量分别为 2 Gy、4 Gy、8 Gy、16 Gy，取照射后 6 h、12 h、24 h、48 h 的细胞进行研究），siRNA 干扰组，抑制剂组。应用 Gammacell40 137Cs 放射源照射（加拿大原子能有限公司），剂量率为 1.01 Gy/min。1.3Real-time PCR取对数生长期细胞，按每孔 5106 个细胞接种于六孔细胞培养板中，每孔 2mL 培养基，6570细胞贴壁后分组给予相应处理。收集细胞，用 TRIzol 法提取细胞总 mRNA，然后用逆转录试剂盒将 mRNA 反转录成 cDNA，ND8000 系统检测 cDNA 浓度。使用 SYBR Green 预混合物，按照说明书要求添加引物和模板，每个 PCR 反应总体系为 25L。Real-time PCR 反应程序：50预变性 2min，95变性 10min，95退火 15s，60延伸 1min，共 40 个循环；溶解曲线为机器默认设置。表 1 Real-time PCR 反应所用引物基因名称Sirt3SOD2GAPDH上游引物序列5-CAGTCTGCCAAAGACCCTTC-35-CGTGACTTTGGTTCCTTTGAC-35- TGACTTCAACAGCGACACCCA-3下游引物序列5-AACACAATGTCGGGCTTCAC-35- AGTGTCCCCGTTCCTTATTGA-35- CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-31.4免疫印迹法裂解细胞，提取总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。等量蛋白上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转移法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（简称 PVDF 膜），755%脱脂奶粉室温封闭 1h，4一抗（anti-tublin 稀释 1:5000，anti-sirt3 稀释 1:500，SOD2稀释 1:5000）孵育过夜，室温二抗（1:5000）孵育 1h，加显色剂化学发光凝胶成像系统显影。-2-1.5SiRNA 干扰SiRNA 干扰 sirt3 检测细胞中 SOD2 的变化，siRNA 转染前 1d，将细胞按照每孔 2105个细胞接种于 6 孔板中。待细胞完全贴壁后，移弃孔内培养基，将 siRNA 与转染试剂混合80室温孵育 30min 后，与 0.8mL 转染介质混合加入 6 孔板中，细胞培养箱孵育 7h 后，加入 1mL含 2血清的新鲜培养基继续培养 24h，然后更换新鲜培养基继续培养 48h，收集细胞。1.6WST 法检测细胞中 SOD2 的活性裂解细胞，提取总蛋白，BCA 法测蛋白浓度。稀释 10g 蛋白至相同体积，1:24 体积比加入 Cu/Zn-SOD 抑制剂 A，37孵育 1h，按比例加入 Cu/Zn-SOD 抑制剂 B，37孵育 15min，85根据 SOD2 活性检测试剂盒配置反应体系，37孵育 30min，450nm 测定吸光度。1.7流式细胞术检测细胞中 ROS 水平根据上述方法接种 6 孔板后给予相应处理，每孔加入 10mol/L DCFH-DA 2 mL，37孵育 40min，并设置 ROS 阳性对照，探针装载完毕，无血清培养基洗涤 3 次，流式细胞仪检测。901.8统计学分析：实验数据以均数标准差（xs）表示，组间均数比较采用 SPSS17.0 软件进行独立样本 t 检验。P0.05 表示差异具有统计学意义。2 结果2.1Real-time PCR 检测细胞中 sirt3 和 SOD2mRNA 水平95图 1：各组照射后不同时间点细胞中 sirt3 和 SOD2 mRNA 变化情况。A：sirt3 mRNA 表达情况；B：SOD2mRNA 表达情况。如图 1A 所示，293T 细胞接受 2Gy、4Gy、8Gy、16Gy 不同剂量照射后，与对照组相比，100sirt3 的 mRNA 水平显著上升，12h 达到最大值（t=7.620，P0.05），说明电离辐射能够引起细胞中 sirt3 mRNA 水平的增加。如图 1B所示，与对照组相比，细胞中 SOD2 的 mRNA 水平在 6h（t=24.239，P0.05）出现显著下降，随着时间的变化逐渐升高，在 24h 达到最大值（t=5.954，P0.05）（达到对照值的1.51.9 倍），48h 逐渐恢复增长水平（t=6.692，P0.05）。以上研究数据表明，电离辐射能-3-105够引起细胞中 sirt3 和 SOD2 的 mRNA 水平的上升，sirt3 的升高提前于 SOD2 的升高，说明细胞中 SOD2 的升高可能是由于 sirt3 的升高引起的。1102.2Western Blot 检测 sirt3 和 SOD2 蛋白的表达水平图 2：Western Blot 检测 293T 细胞接受不同剂量电离辐射后，6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 时间点细胞中 sirt3 和 SOD2 蛋白的表达情况。A：照射剂量为 2 Gy；B：照射剂量为 4 Gy；C：照射剂量为 8 Gy；D：照射剂量为 16 Gy。如图 2 所示，与对照组相比，照射后细胞中 sirt3 和 SOD2 蛋白表达量均升高，但是 2Gy组不同时间点之间无显著差异（图 2A）。如图 2B、2C、2D 所示，4Gy、8Gy、16Gy 照射细115胞后，24hsirt3 和 SOD2 的表达量发生短暂降低，至 48h 显著提高，随着照射剂量的增加，sirt3 和 SOD2 蛋白表达量的增加更加显著。说明电离辐射能诱导细胞 sirt3 和 SOD2 蛋白水平的表达，随着剂量的增加而增加。-4-2.3sirt3 siRNA 干扰和抑制剂处理120图 3：各组细胞中 sirt3 和 SOD2 蛋白的表达情况。A：对细胞进行 sirt3 siRNA 干扰，检测细胞中 SOD2蛋白水平的变化；B：对细胞进行抑制剂处理，抑制细胞中 SOD2 的活性及表达后，检测细胞中 sirt3蛋白水平的变化。以上结果证明了电离辐射导致细胞中 sirt3 和 SOD2 mRNA 和蛋白表达水平的增加，125为进一步证明 SOD2 蛋白表达水平的增加受到 sirt3 的调节，本研究对 sirt3 进行 siRNA干扰，并对细胞进行 SOD2 去乙酰化抑制剂处理。如图 3A 所示，与对照组相比，sirt3敲降后，SOD2 蛋白表达水平也显著降低；抑制剂处理细胞 7h 后对细胞进行照射，48h收集细胞，免疫印迹结果如图 3B 所示，照射后 SOD2 的表达仍然显著受到抑制，而 sirt3的表达并未受到影响。结果说明 Sirt3 蛋白确实对 SOD2 蛋白的表达具有调节作用。1302.4SOD2 活性检测图 4：各组细胞受照后不同时间点 SOD2 活性变化如图 4 所示，不同剂量照射细胞后，与对照组相比，细胞中 SOD2 的活性显著上升，24h135达到最大值（t=12.555，P0.05）。上述结果显示，照射后细胞中 SOD2 的活性显著增加，说明 sirt3 不仅能够影响细胞中 SOD2 的表达量，还能够影响 SOD2 的活性。-5-1402.5细胞内 ROS 水平分析图 5：293T 细胞中 ROS 水平的变化。A：细胞分别接受 2 Gy、4 Gy、8 Gy、16 Gy 不同剂量电离辐射后，6 h、12 h、24 h、48 h、72h 时间点细胞中 ROS 水平不同时间点的变化情况；B：分别对细胞进行 sirt3 siRNA 干扰和 SOD2 抑制剂处理后细胞中 ROS 水平的变化。辐射损伤最主要的机理之一就是通过水的辅解增加机体内的 ROS 水平，产生氧化应激损伤，SOD2 能够清除细胞中 ROS，维持细胞的氧化还原状态。因此，本研究对细胞中的145150155160ROS 水平进行检测，观察细胞中 ROS 水平是否也发生相应的变化。如图 5A 所示，照射后细胞中 ROS 水平显著上升，24h 达到最大值（t=19.174，P0.05），其含量变化与 SOD2 活性变化呈现出相同趋势；如图 5B 所示，siRNA 干扰组（t=29.103，P0.05）和抑制剂处理组（t=14.998，P0.05）的 ROS 水平均显著升高。结果表明 sirt3 的敲降能够导致细胞 ROS水平增加，说明 sirt3 可能通过加强细胞抗氧化保护系统来保护细胞免受 ROS 损害。3 讨论目前认为，电离辐射能够引起细胞中 ROS 水平的显著上升，sirt3 蛋白主要定位于线粒体，接近 ROS 的产生部位4，能够在理想的位置发挥抗氧化作用，但是其在辐射防护机理的研究中还比较少。有研究认为卡路里限制5、饥饿、运动6、寒冷刺激、电离辐射等应激能够激活 sirt3 的活性，其具体作用机制尚不明确，一方面可能是通过组蛋白的乙酰化修饰和染色质蛋白的改变来调节 sirt3 的上游基因，识别 DNA 损伤，启动细胞信号级联反应，增加 sirt3 表达量，阻止基因损伤的累积，并产生修复效应7-9；另一方面可能是通过促进下游蛋白的转录后修饰，调节细胞新陈代谢和细胞信号传递功能，通过补体激活途径应答外界应激条件，参与多种细胞代谢和生理调节，包括多数的氧化应激，基因的稳定性，细胞的存活、增殖、代谢和衰老，以及器官的长寿等10-12，预防与衰老相关的疾病和肿瘤的发生分别。有报道称，sirt3 蛋白能够直接去乙酰化 SOD2 上两个重要的赖氨酸残基13，显著增强SOD2 的活性，降低细胞中 ROS 的水平，提高细胞抗氧化应激的能力，调节细胞的氧化还原状态和代谢途径，减少细胞因电离辐射引起的氧化损伤。本实验旨在研究 sirt3 基因在辐-6-射防护中的抗氧化活性机理。通过不同剂量的电离辐射刺激 293T 细胞，研究细胞中 sirt3 及其下游调控因子随时间的变化趋势，结果表明电离辐射剂量的增加导致细胞中 sirt3 表达量165170175180185190195200205的增加，SOD2 的表达和活性也发生相应变化，提示 sirt3 可能是细胞中的辐射敏感因子，照射剂量越大，sirt3 的变化越显著。本实验还通过 siRNA 干扰细胞中的 sirt3，敲降细胞中 sirt3mRNA 的表达，发现细胞中 sirt3 蛋白水平显著降低后，SOD2 的蛋白表达也发生相应降低，而抑制 SOD2 的表达对 sirt3 无显著影响，提示 sirt3 可能是 SOD2 的上游调控因子，对 SOD2的表达及活性具有调控作用。此外，有研究发现抑制细胞中 sirt3 的表达能够引起 SOD2 去乙酰化活性降低，本实验由于 sirt3 的敲降对细胞中 SOD2 的表达产生影响，尚未检测 sirt3敲降后 SOD2 的乙酰化水平，故还需在下一步研究中观察。4 结论综上所述，sirt3 在电离辐射损伤后可提高 SOD2 的表达和活性，进而减少细胞中 ROS，降低细胞氧化损伤程度，具有保护细胞的重要生物学功能，提示 sirt3 在辐射损伤修复中可能发挥重要作用，具体的研究机制还需要进行深入研究。参考文献 (References)1 Alhazzazi TY, Kamarajan P, Verdin E, et al. Sirtuin-3 (SIRT3) and the Hallmarks of Cancer J. GenesCancer, 2013, 4(3-4): 164-171.2 Osborne B, Cooney GJ, Turner N. Are sirtuin deacylase enzymes important modulators of mitochondrialenergy metabolism? J. Biochim Biophys Acta, 2013.pii: S0304-4165(13)00360-7.doi:10.1016/j.bbagen.2013.08.016.3 Weir HJ, Lane JD, Balthasar N. SIRT3: A Central Regulator of Mitochondrial Adaptation in Health andDisease.J. Genes Cancer.2013,4(3-4):118-124.4 Qiu X, Brown K, Hirschey M D, et al. Calorie restriction reduces oxidative stress by SIRT3- mediated SOD2activation J. Cell Metabolism, 2010, 12(6): 662-667.5 Hebert AS, Dittenhafer-ReedKE, Yu W, et al. Calorie Restriction and SIRT3 Trigger Global Reprogrammingof the Mitochondrial Protein AcetylomeJ. Mol Cell, 2013,49: 186-199.6 Rardin MJ, Newman JC, Held JM.et al. Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome inmitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathwaysJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110:6601-6606.7 Slane BG, Aykin-Burns N, Smith BJ.et al. Mutation of succinate dehydrogenase subunit C results inincreased O2.-, oxidative stress, and genomic instabilityJ. Cancer Res. 2006, 66, 7615-7620.8 Deng CX. BRCA1: Cell cycle checkpoint, genetic instability, DNA damage response and cancer evolutionJ.Nucleic Acids Res. 2006, 34, 1416-1426.9 Wang RH, Sengupta K, Li C. et al. Impaired DNA damage response, genome instability, and tumorigenesisin SIRT1 mutant miceJ. Cancer Cell 2008, 14, 312-323.10 Saunders LR, Verdin E. Sirtuins: critical regulators at the crossroads between cancer and agingJ. Oncogene2007, 26:5489-5504.11 Alhazzazi TY, Kamarajan P, Verdin E, Kapila YL SIRT3 and cancer: tumor promoter or suppressorJ?Biochim Biophys Acta. 2011;1816:80-88.12 Michan S, Sinclair D. Sirtuins in mammals: insights into their biological functionJ. Biochem J 2007, 404:1-13.13 Qiu X, Brown K, Hirschey M D, et al. Calorie restriction reduces oxidative stress by SIRT3- mediated SOD2activation J. Cell Metabolism, 2010, 12(6): 662-667.-7-