解除牡丹种子深度休眠的方法研究

解除牡丹种子深度休眠的方法研究上海中学 张逸伦校外指导教师：卫志明，朱木兰摘要：牡丹为国花之首选，且亦花亦药，具有重要的研究价值。牡丹种子具有深度休眠特性，需2年才能自然萌发，因而研究牡丹种子休眠解除的方法意义重大。本研究通过对解除牡丹种子休眠影响因素的探索，建立了解除牡丹种子深度休眠的成套技术体系。该体系分为实生苗和离体种胚两种途径。实生苗途径操作步骤：（1）1000 mg/L GA3浸泡24 h；（2）附含100 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2 4湿砂储藏；（3）泥炭、菜园土和珍珠岩（361）基质播种；（4）10 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2 叶面喷洒。离体种胚途径操作步骤：（1）1000 mg/L GA3浸泡24 h；（2）100 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2去壳浸泡24 h；（3）添加5 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2 的WPM培养基培养4周。实生苗途径获得明显主茎的牡丹苗木历时180天，离体种胚途径获得明显主茎的离体芽苗历时30天。绪论牡丹(Paeonia suffruticosa)，别名富贵花、百两金、木芍药、鼠姑、鹿韭，洛阳花，为芍药科芍药属木本植物，落叶灌木，素有“国色天香”、“花中之王”的美誉，为我国国花之首选（李嘉玉，1999；李子峰等2006；翟敏等，2007）。牡丹不仅有较高的观赏价值，还具备很好的药用价值。早在汉代，药用植物典籍神农本草经就有牡丹被驯化入药的记载（魏泽圃等，1987；郭绍霞等，2003；翟敏等，2007）。随着牡丹在园林绿化、药材储备中市场价值的增大，催生了牡丹的经济市场，整个市场已经形成了从种苗、盆花、切花、干花到规模化景观开发和精细化精油提取等完整的产业链条，链条上每个环节都蕴藏着诱人的商机和花卉产业全新的经济增长点（刘会超等，2010）。扩大繁殖系数，提高扩繁效率，开展牡丹种苗规模化生产，为市场快速高效提供各级优质牡丹苗木，成为当今牡丹生产与研究的主要关注点。牡丹的种苗繁殖以种子播种方式为主，其中包括结籽稀少的重瓣型品种，只有极少部分不结籽的重瓣型品种采用分株或嫁接方式进行后代繁殖。然而，牡丹种子在自然条件下具有休眠特性，具体表现在胚根(下胚轴)和胚芽(上胚轴)的休眠，尤以上胚轴休眠更为深沉（Julie A.T. et al；1994；贾文庆等，2006；Xin Huang et al，2008）。通常情况下，牡丹种子靠越冬低温打破休眠而自然萌发成苗需两年时间，开花需10年左右，时间跨度过长，生产效率过低，生产成本过高，严重制约牡丹经济的蓬勃兴起（成仿云等，2008）。因此，快速高效破除上胚轴休眠特性，有效提高种子的发芽率及发芽势，缩短牡丹种子成苗成花时间跨度，对日益升温的牡丹经济来说，意义重大。为快速破除牡丹上胚轴休眠特性，尽快缓解牡丹种苗供需矛盾，我们对牡丹自然萌发种子和离体培养种胚的休眠释放进行了研究，获得了快速高效打破牡丹上胚轴休眠特性的良好方法。现总结成文，以期为牡丹的规模化生产和市场化开发提供一定的技术与理论支持。材料与方法1、植物材料：凤丹种子，自 2010年至2012年，每逢9月采集于上海植物园科研中心牡丹育种苗圃，采后去荚、阴凉处风干，塑料袋分装，4或-20冰箱保存备用。2、材料处理：选取成熟饱满的牡丹种子，用自来水冲洗2-4 h，滤纸吸干；再用70%酒精浸泡60s，无菌水或蒸馏水冲洗3次，滤纸吸干，4或-20冰箱保存备用。3、 母液制备： 1000 mg/L的赤霉素（GA3）溶液，用分析纯酒精助溶，现配现用；1 mg/L BA，用1 mol/L HCl助溶，4冰箱保存；5 mg/L Ca(NO3)2，直接溶于水，常温保存。4、 培养基：WPM基本培养基，按需添加植物激素等，121灭菌20 min，用于种胚离体培养。 5、 播种基质：泥炭、菜园土和珍珠岩（361）的基质，用于播种已发根的牡丹种子；冷藏所用湿砂，使用前121灭菌60 min，用于储存各处理的牡丹种子。6、 GA3对牡丹种子休眠解除的影响（1） GA3预处理对发根的影响：选取饱满的牡丹种子，用0，200, 600, 1000, 1400, 1800 mg/L的GA3浸泡24 h，弃液，留种子，温水洗3次，风干，埋藏于湿砂中，黑暗条件下常温储藏。（2） GA3对出苗的影响：将1000 mg/L的GA3浸泡24 h的牡丹种子埋藏于附含0，50，100，150,200,250 mg/L GA3的湿砂中，黑暗条件下4储藏。（3） GA3对实生苗上胚轴伸长的影响：用0, 5, 10，15，20, 30 mg/L GA3喷洒处理6（2）获得的小苗叶片，3天/次，持续喷洒2个月。（4） GA3对离体种胚上胚轴伸长的影响：选取经1000 mg/L GA3浸泡24 h、去壳并用100 mg/L GA3浸泡24 h的牡丹离体种胚为实验对象，直接接种于附含0, 1, 3，5，7, 10 mg/L GA3的WPM培养基中。7、 BA对牡丹种子休眠解除的影响：选取经1000 mg/L GA3浸泡处理的牡丹的带壳种子和去壳种子为实验对象，带壳种子直接埋藏于100 mg/L GA3分别添加0,0. 5，1，1.5，2.0 mg/L BA的4湿砂中，实生苗时期叶面喷洒上述浓度BA处理液；去壳种子用上述处理液浸泡24 h后，剥胚培养，离体种胚直接接种于附含上述浓度BA的WPM培养基中。8、 Ca(NO3)2对牡丹种子休眠解除的影响：选取经1000 mg/L GA3浸泡处理的牡丹带壳种子和去壳种子为实验对象，带壳种子直接埋藏于100 mg/L GA3分别添加0, 1，2，3, 4, 5 mg/L Ca(NO3)2的4湿砂中，实生苗时期叶面喷洒上述浓度Ca(NO3)2处理液；去壳种子用上述处理液浸泡24 h后，剥胚培养，离体种胚直接接种于附含上述浓度Ca(NO3)2的WPM培养基中。9、 概念界定及数据统计：胚根外露称露白，露白天数以连续3天露白种子数低于1%的初始日期为露白日期，并以此计算露白天数（发根、出叶或出苗、出芽、成苗等同此标准），根长达到5 mm即为发根，第一片真叶出土为出叶或出苗，顶芽出现为出芽，主茎达到1 cm为成苗，离体种胚主茎达到1 cm称为成芽苗；各种平均值和百分率按常规计算方法进行。结果与分析1、 GA3预处理对发根的影响通常情况下，牡丹种子在自然状态下发根需要1年左右时间（马新玲等，2011），因而牡丹种子播前预处理受到广泛关注。为了探寻GA3预处理对牡丹发根的影响，我们选取饱满的牡丹种子，用0，200, 600, 1000, 1400, 1800 mg/L的赤霉素（GA3）浸泡24 h，常温湿砂藏，黑暗条件下发根。从表1可见，随着GA3浓度的升高，种子的露白天数逐渐减少，露白百分率出对照外，先升高后下降，1000 mg/L GA3处理达到最高（88.25%）；而发根天数则以1000 mg/L GA3处理为最短（3265天），发根百分率为87.87%，最高。1400，1,800 mg/L GA3两个处理的露白率虽然高于1000 mg/L GA3处理，但平均发根天数大于1000 mg/L GA3处理，发根率也低于1000 mg/L GA3处理。这可能与过高浓度GA3快速促进胚乳代谢而消耗了胚根生长所需营养有关。因此，牡丹种子用1000mg/L GA3预处理24 h后砂藏的发根效果较佳。表1 高浓度GA3预处理对牡丹种子发根的影响浓度露 白发 根（mg/L）露白天数(d)露白百分率(%)发根天数(d)发根百分率(%)0346585.78358482.14200338383.12356582.71600329285.33346386.231000297388.25326587.871400294385.09332384.261800290482.45344482.282、 GA3对出苗或出叶的影响为了探索GA3对出苗或出叶的影响，我们将1000 mg/L GA3浸泡24 h的牡丹种子埋藏于附含0，50，100，150, 200, 250 mg/L GA3的湿砂中，黑暗条件下4储藏，露白后转入常温下萌发，发根后播种于泥炭、菜园土和珍珠岩（361）的基质中出叶（本课题又称出苗）。从表2可见，随着GA3浓度的升高，牡丹种子的发根天数和出叶天数逐渐减少；出苗或出叶百分率在0-100 mg/L GA3处理范围内，随着处理浓度的升高而增加，高于100 mg/L GA3时，反而下降；在0-100 mg/L GA3处理范围内，叶形表型正常，高于100 mg/L GA3时，叶型异常的数量增多。因此，经1000 mg/L GA3预处理24 h的牡丹种子，埋藏于附含100 mg/L GA3 4黑暗条件下的湿砂中一段时间的后续出苗或出叶效果最佳，发根天数为924 d，出苗即出叶天数为1184 d，出叶百分率达到90.45%。表2 GA3对牡丹种子出苗的影响浓度（mg/L）发根天数(d)出叶天数(d)出叶百分率(%)叶片形状01483233883.72正常501285190584.32正常100924118490.45正常150855108584.47少量异型叶20078397576.76部分异型叶25070290573.75多为异型叶3、GA3对实生苗上胚轴伸长的影响在牡丹的休眠特性中，以上胚轴的休眠尤为深沉，种子萌发后，由一片叶柄将叶片送出地面，通常在1年后，顶芽才露出地表（成仿云等，2008）。为了加表3 GA3对实生苗上胚轴伸长的影响浓度（mg/L）出芽天数(d)成苗天数(d)成苗百分率(%)主茎质地03725495387.42坚硬52185270589.14坚硬101552188390.26坚硬151503173587.38软201423165584.76较软301301150583.40松软、节间长速牡丹上胚轴深度休眠的释放，我们用1000 mg/L GA3预处理牡丹种子24 h，再将其埋藏于附含0，50，100，150, 200, 250 mg/L GA3的湿砂中，黑暗条件下4储藏,1184 d（表2）出叶后用0, 5, 10，15，20, 30 mg/L GA3喷洒小苗叶片，3次/天，持续喷洒2个月。从表3可见，随着GA3浓度的升高，牡丹实生苗出芽天数和成苗天数逐渐减少，而成苗百分率以10 mg/L GA3为最高，达到90.26%。0-10 mg/L 范围内GA3处理，实生苗主茎质地均呈现坚硬状态；处理浓度达到15 mg/L时，由于生长速度过快，实生苗主茎质地开始变软；处理浓度达到30 mg/L时，主茎除了生长过快、质地松软外，还出现了节间增长的现象（表3）。综合上述几种考察指标，叶面喷洒10 mg/L GA3对进一步解除牡丹上胚轴休眠效果最佳。4、GA3对离体种胚上胚轴伸长的影响选取经1000 mg/L GA3浸泡24 h、去壳并用100 mg/L GA3浸泡24 h 的牡丹离体种胚，直接接种于附含0, 1, 3，5，7, 10 mg/L GA3的WPM培养基中萌发，主要考察出芽天数、成芽苗天数、成芽苗百分率和主茎质地等四项生长指标。离体种胚上胚轴休眠解除，生长成主茎有效伸长（大于1 cm）的无根芽，称之为成芽苗。从表4可见，随着GA3浓度的升高，牡丹离体种胚出芽天数和成芽苗天数逐渐减少，1, 3，5，7, 10 mg/L GA3处理较对照（WPM基本培养基）的出芽天数、成芽苗天数差异极其显著；在0 - 5 mg/L GA3范围内，成芽苗百分率高而一致，主茎质地表现为致密状态，7，10 mg/L GA3处理的主茎质地逐渐疏松，严重者呈匍匐状，因而成芽苗百分率也随之下降。因此，5 mg/L GA3为离体种胚上胚轴伸长的最适浓度。表4 GA3对离体种胚上胚轴伸长的影响浓度（mg/L）出芽天数(d)成芽苗天数(d)成芽苗百分率(%)主茎质地02165278497.77致密158375198.25致密337255395.66致密525348198.85致密722142285.60疏松1020131178.08松软5、BA对牡丹种子休眠解除的影响选取经1000 mg/L GA3浸泡处理的牡丹的带壳种子和去壳种子为实验对象，带壳种子直接埋藏于100 mg/L GA3分别添加0,0. 5，1，1.5，2.0 mg/L BA的4湿砂中，发根后播种于泥炭、菜园土和珍珠岩（361）的基质中，出苗后叶面喷洒上述浓度BA处理液；去壳种子用上述处理液浸泡24 h后，剥胚培养，离体种胚直接接种于附含上述浓度BA的WPM培养基中。从表5可见，随着BA浓度的升高，实生苗和离体种胚的出芽天数均逐渐减少，而二者的成芽苗天数以1 mg/L BA处理天数最少，高于这个处理浓度，无论是实生苗还是离体种胚均出现多芽现象。这主要由于随着BA浓度的升高，BA打破牡丹种胚上胚轴休眠的强度增加，所以出芽天数逐渐减少；BA又是一种作用很强的细胞分裂素，多芽出现即侧芽生长旺盛，直接抑制主茎生长，因而在限定时间内合格的芽苗减少，1.5,2.0mg/L BA处理的成芽苗天数也随之增加。因此，1 mg/L BA为解除牡丹种胚休眠的最佳使用浓度。表5 BA对牡丹种子休眠解除的影响浓度（mg/L）实 生 苗离 体 种 胚出芽天数(d)成苗天数(d)出芽天数(d)成芽苗天数(d)016622282218328840.5155119836019511.0147218725027831.5132219034738212.0125119514418626、Ca(NO3)2对牡丹种子休眠解除的影响选取经1000 mg/L GA3浸泡处理的牡丹种子和去壳种子为实验对象，用 100 mg/L GA3分别添加0, 1，2，3, 4, 5 mg/L Ca(NO3)2的处理液浸泡，带壳种子直接埋藏于含上述配方的4湿砂中，发根后播种于泥炭、菜园土和珍珠岩（361）的基质中，出苗后采用叶面喷洒0, 1，2，3, 4, 5 mg/L Ca(NO3)2；去壳种子用上述处理液浸泡24 h后，剥胚培养，离体种胚直接接种于附含上述浓度Ca(NO3)2的WPM培养基中。从表6可见，0-3 mg/L Ca(NO3)2浓度范围内，实生苗和离体种胚的出芽天数、成苗天数和成芽苗天数等均随着处理浓度升高而减少；3 mg/L Ca(NO3)2处理的实生苗出芽天数、成苗天数分别为1521 d和2201 d，离体种胚的出芽天数、成苗天数分别为1962 d和2721 d。 4, 5 mg/L Ca(NO3)2处理浓度的出芽天数，成苗和成芽苗天数均较3 mg/L Ca(NO3)2处理有所增加（表6），这可能与Ca(NO3)2处理浓度过高对植物材料反而造成了一定的毒害作用有关。因此，单因素实验结果表明，3 mg/L Ca(NO3)2处理对牡丹种子休眠解除效果最佳。表6 Ca(NO3)2对牡丹种子休眠解除的影响浓度（mg/L）实 生 苗离 体 种 胚出芽天数(d)成苗天数(d)出芽天数(d)成芽苗天数(d)0168323522262298211651229320812861216122272205228233152122011962272141641223122823162516912321235234347、牡丹种子休眠解除体系的建立 通过上述实验，我们分析了牡丹种子休眠解除的几种影响因素及技术参数，并将这些技术参数优化组合，形成了解除牡丹种子休眠特性的具体操作流程，见图1。从图1可见，这一操作流程分为两种途径，实生苗途径和离体种胚途径。 实生苗途径操作步骤： （1）1000 mg/L GA3浸泡24 h；（2）附含100 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2 4湿砂储藏；（3）泥炭、菜园土和珍珠岩（361）基质播种；（4）10 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2 叶面喷洒。离体种胚途径操作步骤： （1）1000 mg/L GA3浸泡24 h；（2）100 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2去壳浸泡24 h；（3）添加5 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2 的WPM培养基离体培养。 8、优化后的休眠解除体系的应用效果：选取健康饱满的牡丹种子，按图1的操作步骤和流程验证该休眠解除体系的应用效果。实验分3批次进行，每次150粒种子。结果见表7。从种子到实生苗，平均历时180 d，成苗百分率平均达到88.1%，见版图；从种子到离体种胚，再到有待离体生根的芽苗（即成芽苗），平均历时仅为30 d，成芽苗百分率平均达到97.3%，版图。表7 休眠解除体系的应用效果实验批次实 生 苗离 体 种 胚成苗天数(d)成苗百分率(%)成芽苗天数(d)成芽苗百分率(%)117887.53097.0218286.63198.0318090.32998.0平均18088.13097.3讨论（1）GA3具有解除牡丹种子休眠的作用（成仿云等，2008），这与我们的实验结果一致。（2）我们的实验结果表明，低浓度的BA也能在一定程度上解除牡丹的休眠特性，这一报道在牡丹上不多见。（3）Ca(NO3)2在本研究的单因素试验中，对解除牡丹休眠的效果不太明显，但在配方中作为添加剂使用时，效果良好。这可能与Ca2+的信号转导作用有关。Ca(NO3)2在牡丹种子休眠解除中的作用及使用效果鲜见报道。（4）牡丹离体生根虽然存在一定难度（Beruto M, et al.）,但本研究所得的主茎伸长后的芽苗，比较容易离体生根。结论通过牡丹种子休眠释放的影响因子研究，建立了解除牡丹种子深度休眠的技术体系。该体系分为实生苗和离体种胚两种途径。实生苗途径操作步骤： （1）1000 mg/L GA3浸泡24 h；（2）附含100 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2 4湿砂储藏；（3）泥炭、菜园土和珍珠岩（361）基质播种；（4）10 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2 叶面喷洒。离体种胚途径操作步骤： （1）1000 mg/L GA3浸泡24 h；（2）100 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2去壳浸泡24 h；（3）添加5 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2 的WPM培养基培养4周。实生苗途径获得明显主茎的牡丹苗木历时180天，离体种胚途径获得明显主茎的离体芽苗历时30天。创新点牡丹种子具深度休眠特性，自然萌发需2年才能成苗。本研究实生苗途径获得明显主茎的牡丹苗木历时180天，离体种胚途径获得明显主茎的离体芽苗历时30天。因而，本研究的创新点在于：建立了解除牡丹种子休眠的技术体系。其意义在于：简便、快速、高效地解除牡丹种子深度休眠，大大缩短了牡丹成苗成花的时间跨度，为牡丹、芍药等具深度休眠特性物种的后续开发利用提供了全新的技术平台。图1 解除牡丹种子深度休眠的操作流程成 芽 苗（历时30 天）上胚轴伸长（出芽）种胚培养WPM + 5 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3mg/L Ca(NO3)2Ca(NO3)2 剥出种胚 无菌化处理去壳种子100 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2常温浸泡24h成 苗（历时180 天）上胚轴伸长（出芽）出苗（出叶）10 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)2叶面喷洒3天/次 发 根 露 白带壳种子100 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 3 mg/L Ca(NO3)24 湿砂储存1000 mg/L GA3 24h浸泡 牡 丹 种 子版图土壤萌发牡丹种子的上胚轴休眠打破版图说明：图A：自然萌发25月的牡丹种苗，仅具叶柄和叶片，上胚轴仍处于休眠状态。 图B：处理萌发6月的牡丹种苗，具叶柄、叶片和明显的主茎，上胚轴休眠被打破。版图离体培养牡丹种胚的上胚轴休眠打破版图说明：图A：离体培养20周的牡丹种胚，仅具真叶，上胚轴仍处于休眠状态。 图B：半量处理后离体培养6周的牡丹芽苗，具真叶、叶柄、叶片和明显的主茎，上胚轴休眠被打破。图C：全量处理后离体培养4周的牡丹芽苗，具真叶、叶柄、叶片和明显的主茎，上胚轴休眠被打破，即全量处理30天彻底解除上胚轴休眠特性。参考文献1. 李嘉玉。中国牡丹与芍药M. 北京：中国林业出版社，1999。2. 李子峰，胡永红，刘庆华，王 佳。我国牡丹组织培养研究进展。安徽农业科学，2006，34（13）：2998-2999, 3001。3. 魏泽圃，安大化。洛阳牡丹M. 郑州：河南科技出版社，1987。4. 翟敏，范晓敏，刘垦。中国牡丹若干研究进展。陕西农业科学，2007，3：112-116。5. 郭绍霞，张玉刚，任茹。中国牡丹研究进展。莱阳农学院学报，2003，20（2）：116-121。6. 刘会超，,刘磊，贾文庆，白志川。牡丹品种洛阳红未成熟胚的培养和植株再生。湖北农业科学，2010，Vol 49. 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