柱色谱分离实验

柱柱 色色 谱谱Column Chromatography了了 解：解： 1. 柱色谱法分离有机物的原理。 2固定相和流动相的选择原则。掌掌 握：握： 1. 色谱柱的填充方法。 2柱色谱分离的基本操作。一、实一、实 验验 目目 的的色色 谱谱 法法 简简 介介 色谱法亦称色层法，色谱法亦称色层法，层析法等，是层析法等，是分离，纯化分离，纯化和鉴定和鉴定有机化合物的重要有机化合物的重要方法之一，还可方法之一，还可定量分析定量分析。 色谱法分类色谱法分类固定相、流动相的物理状态固定相、流动相的物理状态操作形式操作形式分离原理分离原理液液固色谱法固色谱法气气固色谱法固色谱法气气液色谱法液色谱法液液液色谱法液色谱法柱色谱法（柱色谱法（column chromatography）薄层色谱法（薄层色谱法（TLC）纸色谱法（纸色谱法（paper chromatographypaper chromatography）气相色谱（气相色谱（GCGC）高效液相色谱（高效液相色谱（HPLCHPLC）吸附色谱法吸附色谱法分配色谱法分配色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法排阻色谱排阻色谱操作形式操作形式柱色谱法（柱色谱法（column chromatography）二、实二、实 验验 原原 理理柱色谱分离示意图柱色谱分离示意图混合物混合物吸附剂吸附剂(固定相固定相)洗脱剂洗脱剂(流动相流动相)二、实二、实 验验 原原 理理二、实二、实 验验 原原 理理吸附剂的性质：吸附剂的性质：均匀、均匀、表面积大、不反应、表面积大、不反应、吸附能力不同吸附能力不同化合物的结构：化合物的结构：化合化合物的吸附性和它们的物的吸附性和它们的极性成正比极性成正比洗脱剂的极性：洗脱剂的极性：溶解溶解度适中、不反应、易度适中、不反应、易获取回收获取回收影响分离效果主要因素影响分离效果主要因素和和在氧化铝柱子上若分离下列各组混合物，哪一个组分先被洗脱下来？三、实三、实 验验 内内 容容装柱装柱加样加样洗脱洗脱收集收集鉴定鉴定干法：干法：10g 硅胶硅胶 +乙醇乙醇先用乙醇先用乙醇 后用水后用水操作操作组分颜色组分颜色组分颜色组分颜色1mL样品样品加样操作加样操作0.5mL2乙醇洗涤乙醇洗涤 柱色谱操作柱色谱操作：实实 验验 步步 骤骤: 吸附剂装填紧密，排除吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面，无断层。端平整，无凹凸面，无断层。u 干法装柱干法装柱u 湿法装柱湿法装柱装装 柱柱三、实三、实 验验 内内 容容 装柱时应该注意均匀，不能有气泡，裂缝，否则样品可能顺缝隙流动而不吸附，影响样品的分离，应用质软的物体如吸耳球等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面 样品为液体，可直接加样；样品为固体，可选样品为液体，可直接加样；样品为固体，可选择合适溶剂溶解为液体再加样。加样时，要沿管择合适溶剂溶解为液体再加样。加样时，要沿管壁慢慢加入至柱顶部，勿使壁慢慢加入至柱顶部，勿使样品搅动吸附剂表面样品搅动吸附剂表面。 加加 样样三、实三、实 验验 内内 容容洗洗 脱脱 在柱顶不断加入洗脱剂，使洗脱剂永远保持有适当的量，不要让洗脱剂表面流干，使流动相流速适当。三、实三、实 验验 内内 容容洗脱时应注意：（1）向柱内加入95%乙醇溶液洗脱（可以通过注射器沿管壁或安装滴液漏斗）在恒压或加压条件下进行洗脱。控制流出速度1滴/秒。逐渐出现色层带分离。（2）第一色层带到达色谱柱底部时，立即用锥形瓶收集第一色层的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脱时切勿使溶剂流干！（3）然后，改用水溶液作为洗脱剂，当第二色层带到达色谱柱底部时，立即收集第二色层的的溶液，直到其完全被洗出。（4）用量筒分别量取所分离出来的两种溶液的体积后，倒入指定的回收瓶中。（5）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞 向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里。 试样有色试样有色，在层析柱上可直接观察。洗脱后，在层析柱上可直接观察。洗脱后分别收集各个组分。分别收集各个组分。收收 集集 试样无色，试样无色，收集洗脱液时，多采用等份收收集洗脱液时，多采用等份收集，每份洗脱剂的体积随所用吸附剂的量及试样集，每份洗脱剂的体积随所用吸附剂的量及试样的分离情况而定。收集的每份洗脱剂的体积越小，的分离情况而定。收集的每份洗脱剂的体积越小，分离效果越好。分离效果越好。三、实三、实 验验 内内 容容三、实三、实 验验 内内 容容鉴鉴 定定 试样有色试样有色依据颜色直接鉴定依据颜色直接鉴定 试样无色试样无色可结合薄层色谱结果可结合薄层色谱结果 玻砂防堵塞 装柱需紧密 加压不可大 溶剂勿流干四、注四、注 意意 事事 项项色谱法在有机化学中的应用:u分离混合物u精制提纯化合物u利用比移值(Rf)鉴定化合物u跟踪反应进程小小 结结色谱法的特点:u分离效率高 复杂混合物,同系物,异构体等。u灵敏度高 可以检测出g g-1(10-6)级甚至ng g-1(10-9) 级的物质量。u分析速度快 几分钟或几十分钟内可以完成一个试样分析。 小小 结结柱色谱法分离甲基橙和甲基蓝柱色谱法分离甲基橙和甲基蓝实验原理实验原理甲基橙和亚甲基蓝均为指示剂,它们的结构式如下所示:甲基橙甲基橙亚甲基蓝由于甲基橙和亚甲基蓝的由于甲基橙和亚甲基蓝的结构不同结构不同,极性不同极性不同,吸附剂对它们吸附剂对它们的吸附能力不同的吸附能力不同,洗脱剂对它们的解析速度也不同洗脱剂对它们的解析速度也不同,极性小、吸附能极性小、吸附能力弱力弱、解析速度快的解析速度快的亚甲基蓝先被洗脱下来亚甲基蓝先被洗脱下来，而，而极性大、吸附能力强极性大、吸附能力强、解析速度慢的解析速度慢的甲基橙后被洗脱下来甲基橙后被洗脱下来，从而使两种物质得以分离。本实，从而使两种物质得以分离。本实验以硅胶为吸附剂，验以硅胶为吸附剂，95%乙醇作为洗脱剂，先洗出亚甲基蓝，再用蒸乙醇作为洗脱剂，先洗出亚甲基蓝，再用蒸馏水作洗脱剂把甲基橙洗脱下来。馏水作洗脱剂把甲基橙洗脱下来。三、实三、实 验验 内内 容容装柱装柱加样加样洗脱洗脱收集收集鉴定鉴定干法：干法：10g 硅胶硅胶 +乙醇乙醇先用乙醇先用乙醇 后用水后用水操作操作组分颜色组分颜色组分颜色组分颜色1mL样品样品加样操作加样操作0.5mL2乙醇洗涤乙醇洗涤 柱色谱操作柱色谱操作：实实 验验 步步 骤骤:仪器和试剂仪器和试剂 1.仪器锥形瓶、玻璃漏斗、色谱柱 2.试剂 柱层析硅胶、脱脂棉、乙醇（95%）甲 基橙、亚甲基蓝。 H2O 95 %乙醇 = 1 1 (A 液) 0. 2mol L -1HCl 95 %乙醇 = 1 1 (B 液)装置图装置图装柱装柱洗脱洗脱实验步骤实验步骤装柱装柱：1、装色谱柱：（1）取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花将色谱柱垂 直固定在铁架台上。 (2) 关闭活塞，向柱中倒入蒸馏水（也是洗脱剂，至柱体积的 1/2） （3）填吸附剂：称取10g 硅胶于小烧杯中 ,加入 15mL 蒸馏水 ,用玻 璃棒调好通过漏斗慢慢装入玻璃柱, 使其逐渐沉入底 部。用洗耳球敲打柱身使硅胶装填紧密，打开活塞，用小锥型 瓶承接, 控制滴速为1 滴秒,装完后在上面加一层脱脂棉（ ，操作时要注意吸附剂始终不能露出液面）。实验步骤（续）实验步骤（续）加样：加样：当液面刚好流至脱脂棉平面相切时，立刻关闭活塞， 加入 5mL左右的A 液 ,当硅胶面又将要露出时 ,关紧活塞 ,用量筒准确加入 0. 50mL 以 A 液做溶剂的混合液(含甲基橙和亚甲基蓝各为 0. 400 g L -1) 。 洗脱：洗脱：待此混合液将要渗入柱内时 ,立即用 A 液洗脱 ,此时可以观察到有鲜明的黄、蓝两条色带形成。黄色的甲基橙色带随洗脱剂的加入不断下移 ,而其顶部蓝色带不移动 ,当黄色带到达柱底部时 ,更换接受器 ,全部收集此黄色带 ,洗脱时间约 10 min。此后改用B 液做洗脱剂 ,这时可看到蓝色带开始下移 ,当亚甲基蓝色带到达底部时 ,更换接受器 ,全部收集此蓝色带 ,洗脱时间约 30 min。