免疫化学技术

酶联免疫吸附反应酶联免疫吸附反应(Enzyme-linked Immunosorbent (Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)Assay,ELISA) 免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法双抗体夹心法竞 争 法双抗原夹心法间 接 法双位一点法 什么是什么是 酶联免疫分析技术酶联免疫分析技术 ELISAELISA的基本原理和方法的基本原理和方法 ELISA ELISA的种类和变化的种类和变化 ELISA ELISA的特点的特点 ELISAELISA的应用实例的应用实例一、基本原理一、基本原理 是利用抗原抗体进行的检测技术。是利用抗原抗体进行的检测技术。即利用制备好的特异抗原或抗体作为试即利用制备好的特异抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）ELISA原理原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关 其所生成的颜色深浅与欲测的其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗抗原（抗体）含量成正比。体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。标仪）加以测定。 其方法简单，方便讯速，特异性强。其方法简单，方便讯速，特异性强。二、酶及其底物二、酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原酶结合物是酶与抗体或抗原, , 半抗原半抗原在交联剂作用下联结的产物。是在交联剂作用下联结的产物。是ELISAELISA成败成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应将得到不同的颜色反应. .酶酶 底底 物物显色显色反应反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420420 ELISAELISA的种类和变化的种类和变化 （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（二）间接法（二）间接法（三）竞争法（三）竞争法 （四）双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕获法测（五）捕获法测IgMIgM抗体抗体（六）应用亲和素和生物素的（六）应用亲和素和生物素的ELISAELISA （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法此法适用于此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原检验各种蛋白质等大分子抗原双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于，就可用于包被固相载体包被固相载体和制备和制备酶结合物酶结合物而建立此法而建立此法。（1）双抗体夹心法测定抗原A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。 双抗原夹心法（抗双抗原夹心法（抗-HBs等）示意图等）示意图1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原-抗体-酶标记抗原复合物。4.酶催化底物并显色。酶抗原酶标记 抗原抗体抗原固相载体双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAgHBsAg的检测常采用的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。构的不同，寻找合适的标记方法。 间接法是间接法是检测抗体最常用检测抗体最常用的方法，其原理的方法，其原理为利用酶标记的为利用酶标记的抗抗体以检测已抗抗体以检测已与固相结合的受与固相结合的受检抗体，故称为检抗体，故称为间接法。间接法。（二）间接法（二）间接法酶抗抗体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色。间接法（抗-HCV等）示意图间接法测抗体间接法测抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用利用同一酶标抗抗体同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。建立检测相应抗体的方法。包被固相载体包被固相载体: : 用已知抗原包被用已知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本: : 使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体: :与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底物显色显色 根据颜色反应的程度进行根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定（三）竞争法（三）竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体量测定，也可用于测定抗体 。用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体 测定管加待测抗原和测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分 加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量计算标本中待测抗原含量 （3）竞争法测定抗原A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。 对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。物后显色反应较弱。 放射免疫测定法放射免疫测定法(Radioimmunoassaly,RIA) 应用同位素标记技术来检测抗原抗体反应应用同位素标记技术来检测抗原抗体反应的高灵敏度方法。的高灵敏度方法。此法兼有放射性同位素标记物所显示的高此法兼有放射性同位素标记物所显示的高灵敏度（可达到灵敏度（可达到 ng和和pg水平）和血清学反水平）和血清学反应的高特异性优点。应的高特异性优点。发光免疫测定法发光免疫测定法(Luminescent immunoassay) 将化学发光反应与免疫测定法结合起来的将化学发光反应与免疫测定法结合起来的新型技术。新型技术。 常用的发光试剂有鲁米诺（常用的发光试剂有鲁米诺（luminol)和光和光泽精泽精(lucigenin)。一：灵敏性一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众所周知所周知, , 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。因此该体系常被称为酶放大体系。 ELISAELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。进行定量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平，酶反应测定法的敏感水平，酶反应测定法的敏感度约为度约为510g/ml 510g/ml 。 ELISAELISA的特点的特点二：特异性二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。抗原抗体反应具有高度的特异性。 ELISAELISA的试剂的试剂(A(A、B B、C C三部分三部分) )ELISAELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。物。（1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）酶反应终止液）酶反应终止液ELISAELISA的试剂准备的试剂准备A A 固相载体固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。高，但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好，空白值低，孔底吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近间性能相近。包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。 蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的通常含有更多的疏水基团疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。，故更易吸附到固相载体表面。不易吸附不易吸附的非蛋白质抗原的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNADNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。物质的定量测定。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。包被用抗体包被用抗体IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在FcFc段上，抗体段上，抗体结合点暴露于外。结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液. .须除去杂抗体后须除去杂抗体后才能用于才能用于ELISAELISA，以保证试验的特异性。，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。混合包被，可取得更好的效果。包被的条件包被的条件pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液。缓冲液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜，3737中中保温保温2 2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。封封 闭闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质后的步骤中干扰物质的再吸附。的再吸附。常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶; ;脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉，可以高浓度使用（比较价廉，可以高浓度使用（5%5%）。）。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封闭？固相均需封闭？洗涤液洗涤液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀释液为含中，常用的稀释液为含0.05%0.05%吐温吐温2020磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液。ELISA的试剂准备的试剂准备B 结合物结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是即酶标记的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关键的试剂中关键的试剂 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2 抗体（或抗原）的免疫活性抗体（或抗原）的免疫活性 3 3 含有或少含有游离的抗体（或抗原）含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4 4 结合物尚要有良好的稳定性。结合物尚要有良好的稳定性。p 结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的制备结合物时所用纯度较高的IgGIgG，以免在与酶联结，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISAELISA中用酶标抗中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。p 酶酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。存，价格低廉，有色产物易于测定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷半乳糖苷酶和脲酶等。酶和脲酶等。HRPHRP是一种糖蛋白，含糖量约为是一种糖蛋白，含糖量约为18%18%，分子量为，分子量为4400044000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。）结合而成，是一种卟啉蛋白质。p 结合物的制备结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-60%-70%70%）和重复性好。）和重复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。（2 2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRPHRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成氨基形成chiffchiff氏碱而氏碱而 结合。简便有效结合。简便有效. . 结合物中混有的结合物中混有的游离酶游离酶一般不影响一般不影响ELISAELISA中最后的中最后的酶活性测定。但游离的酶活性测定。但游离的抗体抗体则会与酶标抗体竞争相应的则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。酶和抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个一浓度时，能维护一个低的本底低的本底，并获得测定的最佳灵，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。p结合物的保存结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRPHRP结合结合物加硫柳泵，物加硫柳泵，APAP结合物可加叠氮钠）。结合物可加叠氮钠）。p 结合物的稀释液结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%0.1%牛血清牛血清白蛋白，白蛋白， 0.05%0.05%吐温吐温20 20 。试剂盒均已用合适的缓冲。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-84-8保存期保存期可达可达6 6个月。个月。试剂准备试剂准备 C 酶的底物酶的底物酶的底物酶的底物HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结结合物最常用的底物。合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2为供氧体，为供氧体， H2O2为受氢体。为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。ETMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMBTMB性质较稳定，可配成性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与溶液试剂，只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用液。酶反应终止溶液混和即成应用液。酶反应终止后，后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如虽不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值极低，也为一些试敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。剂盒所采用。HRPHRP对氢受体的专一性很高，仅作用于对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2H2O2、小分醇的过、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 APAP的底物为磷酸酯酶，一般采用对的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm405nm波波长处有吸收峰。用长处有吸收峰。用NaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳终止酶反应后，黄色可稳定一时间。定一时间。APAP也有发荧光底物（磷酸也有发荧光底物（磷酸4-4-甲基伞酮甲基伞酮），可用于），可用于ELISAELISA作荧光测定，敏感度较高于用作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。显色底物的比色法。酶反应终止液酶反应终止液常用的常用的HRPHRP反应终止液为硫酸，其浓反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板度按加量及比色液的最终体积而异，在板式式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative control)(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。标本物质的量。参考标准品参考标准品 定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的围的4-54-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中缓冲液中. .阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAgHBsAg检检测的阴性对照品中不可含测的阴性对照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。5 5 标本的采取和保存标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。体或抗原成份。以血清标本为例：血浆中除尚含有以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原纤维蛋白原和和抗凝剂抗凝剂外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以化物酶活性的物质，以HRPHRP为标记的为标记的ELISAELISA测定中，可能测定中，可能会增加非特异性显色。会增加非特异性显色。加样加样: : 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，加酶次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。产生气泡。基本操作注意事项基本操作注意事项保温保温抗原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么上发生。为什么ELISAELISA反应总是需要一定时间的温育？反应总是需要一定时间的温育？温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度（冰箱温度）等。）等。3737是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。原抗体结合的合适温度。保温方式：保温方式：ELISAELISA仪器附有特制的电热块，水浴。仪器附有特制的电热块，水浴。若用保温箱：若用保温箱：ELISAELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将，最后将ELISAELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指围内，标准室温温度是指20-2520-25，但具体操作时可根，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。不宜多于两块板同时测定。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。实验的成败。ELSIAELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有，手工操作有流水冲洗式和流水冲洗式和浸泡式两种：浸泡式两种：（1 1）流水冲洗式）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗非离子型洗涤剂涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏疏水性水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。显色显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMBTMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。适当时间阅读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至顶峰，随即逐渐减弱，至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退至无色。比色比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。白孔的吸光度，然后进行计算。结果以光密度（结果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），现按规定用），现按规定用吸光度（吸光度（absorbenceabsorbence，A A），两者含义相同。通常的表），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于示方法是，将吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸的吸收波长为收波长为492nm492nm，表示方法为，表示方法为AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。酶标比色仪酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISAELISA光度计。针光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到优良的酶标仪的读数一般可精确到0.0010.001，准确性为，准确性为1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%。操作时室温宜在操作时室温宜在15-3015-30，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器15-3015-30分钟分钟，测读结果更稳定。测读，测读结果更稳定。测读A A值时，要选用产物的敏感吸值时，要选用产物的敏感吸收峰，如收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测波长。有的酶标仪可用双波长式测读。读。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。6 6 结果判断结果判断 6.1 6.1 定性测定定性测定定性测定的结果判断作出定性测定的结果判断作出“有有”或或“无无”的回答，分别的回答，分别用用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。在这种半定量测定中，将表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法在间接法和夹心法ELSIAELSIA中，中，阳性孔阳性孔呈色深于阴性孔。呈色深于阴性孔。在竞争法在竞争法ELISAELISA中则相反，中则相反，阴性孔阴性孔呈色深于阳性孔。两呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。类反应的结果判断方法不同，分述于下。A.A.阳性判定值：阳性判定值： （cut-off valuecut-off value）一般为阴性对照一般为阴性对照A A值加上一个特定的常数值加上一个特定的常数(0.05)(0.05)，以此作为判断结果，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。阳性或阴性的标准。B.B.标本标本/ /阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（标本（S S）和阴性对照（）和阴性对照（N N）的）的A A值后，计算值后，计算S/NS/N值。值。间接法和夹心法间接法和夹心法（2 2）竞争法）竞争法因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出一般均用比色计测定，读出S S、P P和和N N的吸光值。的吸光值。a. a. 阳性判定值法阳性判定值法 阴性判定值阴性判定值=0.4=0.4NCX+0.6NCX+0.6PCXPCX 阳性阳性 AA阳性判定值阳性判定值 阴性阴性 A A阳性判定值阳性判定值 b. b. 抑制率法抑制率法 抑制率（抑制率（% %）= = （阴性对照（阴性对照A A值值- -标本标本A A值）值）100%/100%/阴性阴性对照对照 阳性阳性 抑制率抑制率50%50%为为 阴性阴性 50%50%定量测定定量测定ELSIAELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法测定大分子量物质的夹心法ELISAELISA，标准曲线的范围一，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S S形，其形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。的检测区域。4. ELISA4. ELISA的操作要点的操作要点严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证是保证ELISAELISA必要条件。必要条件。严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。ELISAELISA应用实例应用实例 饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏（如沙门氏菌菌 ） 甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析 ELISA在饲料安全检测中的应用在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟碱、吗啡、藻类毒素植物毒素如罌粟碱、吗啡、藻类毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草剂与杀虫剂两大类主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（例如杀暝松（ FN FN ）、）、 甲氟磷酸异已酶（甲氟磷酸异已酶（ SOMAN SOMAN ）、）、 草不绿（草不绿（ Alachor Alachor ）、）、 西维因（西维因（ Carbaryl Carbaryl ）、）、 多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（ Captan Captan ）等。）等。农药的检测农药的检测： ELISA ELISA检测检测 “ “非典型肺炎非典型肺炎”冠状病毒冠状病毒 ELISA ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白检测抗异质性胞核核糖蛋白A2A2（hnRNPA2hnRNPA2）/ /类风湿性关节炎（类风湿性关节炎（PtAPtA）3333抗体抗体ELISAELISA在疾病诊断中的作用在疾病诊断中的作用 ELISA ELISA法检测幽门螺杆菌抗体法检测幽门螺杆菌抗体ELISAELISA试剂盒商业资讯试剂盒商业资讯ELISA试剂盒试剂盒酶联免疫酶联免疫