微微型真核浮游生物丰度和多样性研究综述

海洋微微型浮游生物研究方法综述马晓丽 2014生态学硕士 21140611116摘要：海洋微微型浮游生物是指径粒大小介于0.22仙m和2微米之间的浮游生物， 在世界各海域广泛存在， 包括微微型浮游植物和微微型浮游动物。 它们是海洋生态系统的重要组成部分， 在维持海洋生物系统稳定， 促进物质循环和能量流动上起重要作用。 研究微微型浮游生物在不同时间、 不同海域的丰度和多样性可以探索其分布规律和生态学作用， 为环境评价、 预测等提供数据参考和理论依据。为此， 本文综述了目前世界范围内微微型浮游生物丰度和多样性的研究方法以及我国在该领域的研究状况。关键词 ： 微微型浮游生物；生态系统；丰度和多样性；研究方法Abstract： Picoplankton (varying from 0.2 to 2 仙 m) including picophytoplanktonand picozooplankton are widely distributed in the oceans all over the world. They are important portions of plankton and play an crucial role in the maintaining of stability of ecosystem in the ocean and the material recycling and energy flow. Studying of the abundance and diversity of picoplankton in different locations and time will help in the understanding of the rules of the distribution and the ecological status of picoplankton. And the knowledge of abundance and diversity of picoplankton will help to make a solid foundation for studying the impact of human activities on biological diversity and provide reference data and theoretical foundation for environmental assessmentand forecast. Therefore, the research methods of the abundance and diversity of picoplankton and domestic research situation in the field were reviewed in this paper.Keywords: picoplankton; ecosystem; abundance and diversity;methods of research引言：海洋微微型浮游生物指的是海洋中存在的粒径小于2微米的浮游生物，主要包括聚球藻、原绿球藻、微微型真核浮游生物异养细菌等类群。随着微食物 环概念(Microbialloop) 的提出，微微型浮游生物在海洋生态系统中的作用越来 越受到人们的重视 。对于它们在海洋中的生态分布变化及影响因素的研究也日 益受到研究者的关注。海洋微微型浮游生物在全球海洋中是生物量和生产力的重 要贡献者，是生命和非生命系统联系的关键环节，是生源要素循环的重要驱动力 。微微型浮游生物中的光合自养生物，在全球各大洋和近岸海域都有分布，对海 洋初级生产及海洋碳循环有巨大的贡献，是微食物网重要的组成部分 。异养细 菌在海洋中既是分解者，又是生产者，它们利用水体中的溶解有机物(DOM解化为 自身物质以生长和繁殖从而形成颗粒有机物(POM),随着原生动物摄食异养细菌，这部分POMJ再次传递返回经典食物链中，使海洋中大量的溶解有机物得以迅速 循环再利用，大大提高了初级生产提供的物质与能量的利用效率浮游病毒作为分 解者对微食物网中各主要角色都有相当程度的影响，病毒对细菌和藻类的裂解向水中释放DOM这部分DOM又被细菌再利用，产生了微食物环的病毒回路(Viral Shunt),影响了海洋海洋生态系统物质循环和能量流动的途径 4。在国际上，对海洋微微型浮游生物的研究在上世纪70年代,随着显微技术以及其他多种研究技术和手段的发展，开始逐渐兴起我国的海洋微微型浮游生物 生态学研究起步较晚，一方面是研究手段的限制 ，另一方便是历史原因所导致， 直到上世纪80年代后期才逐渐开展。近年来，对我国近海微微型浮游生物生态学 的报道逐渐增多，取得了重要的进展，积累了许多宝贵资料。图1:微微型和微型浮游生物的一种分类方法:微微型浮游生物22 pm)微微型原核生物微微型光合原核生物|化能自养细菌异养浮源细菌超微型浮游生物(W5 pm)2 5 pm微型浮游生物C220 /im)I微微型真核生物 +(微型真核生物I微型原核生物一(微型原核生物一超微型光合其核生物超微型原生动物微型真核生物微型光合原核生物 微型光合原核生物 微型光合真核生物 微型原生动物1. 微微型浮游生物研究进展在微微型浮游生物丰富研究上， 由于早前研究对微微型生物未给予足够重视对其形态结构、种类组成等知之甚少。 1970 年代起 , 研究者们开始运用荧光显微技术 ( FEM ) 、流式细胞术(FCM)【5】 及电子显微技术(EM)【6】 进行海洋微微型生物的丰度检测和形态观察。 微微型浮游生物按其食性， 细胞核性质， 细胞进化与结构等分类方法不一， 这里分为微微型浮游植物和微微型浮游动物两类。 其中的微微型浮游植物类群主要有原绿球藻( Prochlorococcus ，简称 Pro ) 、聚球藻(Synechococcus ,简称Syn)和微微型真核浮游植物 (Picoeukaryote ,简称Euk)3 类 。根 据藻 胆素 组分 的不 同 ，又 可 将聚球藻 分成富 含藻红素的 聚球藻( Phycoerythrin-rich,PE) 和富含藻蓝素的聚球藻( Phycocyanin-rich,PC ) 两类。聚球藻(0.6-1.6 m)对低温较不敏感，并且可以利用多种营养盐，在纬度较 高，水深较浅的海域和河口中广泛分布 。原绿球藻细胞极小(0.54-0.67 m), 含有独特的色素二乙烯基叶绿素( divinyl-chlorophyll a,b )，也是唯一利用该种色素作主要光合色素的野生型物种，分布在南北纬40之间的大洋中，在寡营养热带、 亚热带大洋海区等营养盐含量较低的海域是浮游植物的优势种群【10】。微微型真核浮游植物泛指直径 3Nm的所有真核浮游植物类群，物种组成非常复杂，多样性丰富，分布比原绿球藻和聚球藻更为广泛【 11】 。由于微微型浮游动物与微微型真核浮游植物基本结构相似， 有许多交集， 目前国际上划分不是很明显，两者研究方法基本相同【12】。在微微型生物多样性研究方面， 20 世纪 70 年代末 , 由于落射荧光显微镜技术的应用 , 科学家们发现聚球藻在海洋中的普遍存在聚球藻是一类单细胞、个体微小(0.6-2 n m)、球形或短棒状、进行二分裂的蓝细菌(cyanobacteria)。与真核藻类和高等植物相似, 聚球藻以叶绿素a 作为主要光合色素进行放氧光合作用【7-9】。 20世纪80年代， Chisholm 等于 1988年在对北大西洋和太平洋浮游植物进行研究时发现在真光层底部有一种细胞体积极小但数量极大， 能够发弱红色荧光的球状或棒状细胞，其细胞色素为类似叶绿素 a 的色素。通过纯化培养后Chisholm 等人于 1992 年将其命名为 Prochlorococcus marinus 。 【21】 此后 , Pro的研究引起了浮游生物研究者的极大兴趣, 并在短短数年内获取了关于其分布、动态生理和进化等等方面的大量资料。 直至 21 世纪初 , 分子生物学的迅速发展才使得人们可以直接利用 DNA 序列分析开展微微型真核生物的分子多样性研究11310 2001年,Moon-van de Staay等【闻 首次运用真核生物通用引物研究太平洋表层海水中微微型真核生物的分子多样性。目前, 研究者们已利用分子生物学技术对太平洋【 15】, 地中海【16】 , 红海【 17-18】, 印度洋【19】, 北冰洋【20】, 南极附近水体【21】等世界各大海域进行了微微型浮游生物多样性研究, 获得了大量微微型真核生物基因序列。2. 微微型浮游生物丰度常用研究方法2.1 培养技术法即通过对细菌进行一定条件的培养, 根据细菌的菌落数或生长状况计算细菌的数量。平板计数法是经典的细菌计数方法：将所要计数的细菌适度稀释, 然后在特定的平板培养基上进行培养, 通过计数生长出的单菌落数, 来计算细菌的丰度。该方法的缺点较明显: 需要严格无菌的操作环境, 不适于现场试验; 现有的培养基和培养条件并不适宜所有海洋细菌的生长, 所以目前本方法在现场试验中较少使用。但是通过平板法可以获得活的单菌落, 在对细菌的分离纯化、分类鉴定研究中还在使用。空斑法是计数病毒数量的经典方法, 原理与平板计数法类似,将病毒稀释后与过量的宿主混合, 然后铺种于平板培养基上 , 培养一定时间后细菌繁殖成乳白色衬底, 被病毒裂解的区域则在此衬底上表现为圆形的透明斑, 称为噬斑 噬斑数代表该接种量中有活力的噬菌体数量。 如果挑出单个噬斑来培养,可以获得由单个噬菌体所繁殖的后代, 达到分离纯化的目的 空斑法依赖于病毒对宿主的感染, 并不适宜自然水样总病毒的定量研究。2.2 透射电子显微镜法 (Transmission electron microseopyTEM)TEM法的基本原理为以电子激发的光子作为光源照射被观测样品 ，这种方法 分辨率高 , 可以观察到细胞的亚显微结构【 22】 ; 可以观察到含有病毒颗粒的细胞;可以观察到病毒颗粒的形态, 初步确定病毒的种类; 可以测量细胞的大小和体积,进而估算细胞碳含量。但TEMt样品制备方法复杂，成本高，仪器操作复杂且耗时 不适合在现场调查中使用。2.3 表面荧光显微镜法 (Epifluorescence microseop ， EPM)EPM是较常规的实验室检测方法，主要原理是利用特异性荧光染料对样品 进行染色 , 通过在荧光显微镜下观察特异荧光来计数细胞数目。 对于海洋微微型 浮游生物的研究, 由于聚球藻、 原绿球藻和微微型真核浮游生物自身含有荧光基团 (PE 和叶绿素 ), 不需染色可直接在荧光显微镜下观察; 异养细菌和浮游病毒由于不含色素,需要染色后进行观察。与TEM&相比,EPM法样品制备过程简单, 仪器操作和样品观察简单, 但在浮游病毒的计数中 , 个体较大的病毒和个体较小的细菌不易区分。2.4 流式细胞仪法(Flow Cytometry,FCM)流式细胞仪是集现代物理电子技术、 激光技术、 计算机技术于一体的科学技术设备 , 是生命科学研究领域中先进的仪器之一。通过流式细胞仪可以对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、 多参数、 快速的定性、 定量 分析或分选。Olson等于1985年首次将FCMK装在科考船上进行样品的现场检 测 【23】。 相对于前面介绍的几种方法 , 流式细胞仪在海洋微微型浮游生物研究方面 有很大的优点 , 它可以自动、快速的对细胞进行多参数测量, 获得细胞的荧光性质、 散射光性质, 以及样品细胞丰度等多种信息 , 近年来已被广泛应用于海洋生态调查中。 但是 , 流式细胞仪也存在一定缺点 , 如仪器价格较昂贵， 对仪器的操作需 要丰富经验, 每次检测样品之前都要对仪器进行校正。3. 微微型浮游生物多样性常用分子技术研究方法由于海洋微微型浮游生物种类繁多， 个体微小， 且常常不同种类间缺乏明显 的形态区别，故难以用传统的方法来研究其系统发生关系和种类组成。直至 21世纪， 各种分子生物技术的应用， 极大推动了微微型浮游生物多样性的研究。 以下对目前国内外常用的研究微微型浮游生物多样性的分子生物学技术以及其优缺点进行了归纳总结。3.1 构建克隆文库构建克隆文库是研究微微型真核生物分子多样性的传统方法【24】 。其优点为步骤简单, 不需要使用特殊仪器, 并且避免了一些分子标记技术的技术限制。Takishita 等【 25】 运用构建克隆文库技术对海底淤泥样品进行了微微型真核生 物多样性研究。 Zuendorf 等【 26】对丹麦玛丽艾厄海峡样品进行克隆文库的构 建 , 对随机选取的 400 个克隆进行测序, 最后获得 70 个属于不同种类微微型真核生物的OTUs这些研究均获得了丰富的微微型真核生物多样性。这表明 ，克隆 文库构建方法适合用于微微型真核生物分子多样性研究, 利用该方法能够获得对环境样品中真核生物多样性的客观认识。但是, 构建克隆文库直接测序耗时且花费较大，并且和其他基于 DNA分析分子多样性的技术一样，存在另一个弊端，即 仅通过DNAff列分析无法区分获得的序列所代表的细胞是否真实存在,如对海底 沉积物样品进行研究, 时常获得实际并不生活在淤泥中的硅藻类, 其死亡细胞由于沉降作用而存在与淤泥中。 Stoeck 等设计了 1 个避免此类误差的方法, 他们通过对同一环境样品同时构建rDNA文库和cDNA文库的方法区别死亡细胞和真实 存在的细胞。这一技术给微微型真核生物分子多样性研究提供了新途径【27】 。3.2 变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳(DGGE/ TGG)EDGGE/ TGG的法的原理是：通过在电泳过程中人为造成变性剂浓度梯度或 温度梯度,使得长度相同而碱基序列不同的DNA片段由于解链特性的差异而得以分离，甚至是仅有单一碱基差异的DNA片段也能利用该方法得到有效分离。在 DGGE/TGG由法中,为确保DNAt段不完全变性,需要在引物一端加上一段 GC夹 子.DGGE方法已运用于地中海，红海，南极等海域的微微型真核生物多样性研究，是该领域研究中的常用方法之一 128-29,0然而，由于利用DGGE和TGGE对环境样 品进行微微型真核生物分子多样性研究时,PCR 扩增模板是不同种类基因组的混合物，故而DGGE/ TGG由法仍会无可避免地产生一些鹰像。例如，异源结合现 象(Heteroduplex formation),即非同源DN明段相结合，从而在电泳过程中产生 特异条带，但该条带并不是多样性的真实体现；不同种类真核生物DNA片段的共 迁移现象；以及同一 DNAt段由于存在多个解链区域而造成相同片段产生不同条 带的结果.但是,其中部分鹰像可以通过对 DGGE获得片段切胶后再次扩增得。3.3 多聚酶链式反应- 限制性片段长度多态性 / 末端限制性片段长度多态性 ( PCR-RFLP ; T-RFLP)PCR-RFL限术是研究微微型真核生物多样性最早使用的分子生物学方法之 一，其原理是利用不同 DNA片段中特定限制性内切酶酶切位点的不同而将其区 分开。 RFLP 技术由于简单易行, 且不需要特殊仪器, 故而是微微型真核生物多样性研究中使用 最频繁的方法之一 1301 o 2001年,D 1 e”对地中海、南极水域、北 大西洋等海域环境样品构建克隆文库并进行 RFLP分析。此后,该方法被广泛运用 于不同海域的微微型真核生物多样性研究【 31】 。T-RFLP技术基于RFLPW形成,其流程是：用5端带有荧光标记的引 物对总 DNA进行扩增；对PCR产物进行限制性内切酶酶切，用DNA测序仪对末端带有荧 光标记的限制性酶切片段进行分离和检测。 不同的荧光片段可以认为是不同微微 型真核生物种类T-RFLP 技术的优点是可以快速大批量地对样品进行多样性分析 , 并且可在分子层面上研究微生物群落结构随时间和空间的丰度变化和分布情况。Count-way等同时运用构建克隆文库和T - RFLP技术对北大西洋西部环境 样品进行以18SrDNA为靶标基因的微微型真核生物分子多样性分析。 结果发现,32】。T- RFLP 方法丰富 , 但是 ,T-T- RFLP#术的缺点主要在于需两种方法都获得了丰富的微微型真核生物多样性尽管利用克隆文库构建方法获得的多样性较RFL叨法因其可实现快速分析而具有显著优势。要使用昂贵的遗传分析仪。3.4 荧光原位杂交(FISH)FISH 技术利用带有荧光标记的探针与环境样品或经富集的样品杂合, 并在荧光显微镜下成像, 使研究者得以观察某一特定细胞类群的形态学特征及其在海洋中的分布和丰度。目前微微型浮游生物研究领域, 对 FISH 的利用主要集中于对新发现的未获培养的类群(如MASTs等)进行研究 由。Massana等利用构建克隆 文库技术对MASTs 类群研究发现 ,MASTs 中至少包含 8 个独立的进化枝。通过对其中 2 个进化枝进行FISH 检测 , 获得这 2 个类群的形态资料, 并进一步研究得出MASTs类群是重要的细菌捕食者。此后，他们又运用FISH技术进一 步对MASTs!行研究发现，MASTs在五大洋中均有分布，属于自由生活以细菌为 食的异养鞭毛虫【34】 。在微微型真核生物研究领域,FISH 技术的运用使得对这些微小生物进行形态学观察和生理生化研究成为可能。 然而利用 该技术必须首先对目的类群基因序列等背景资料有一定认识 , 才能进行探针设计和合成。3.5 宏基因组宏基因组技术避免了 PCRT增,通过直接对环境样品中提取的 DNA勾建宏基因组文库或鸟枪法测序 , 从而对感兴趣的微微型真核生物进行不依赖纯培养的序列分析和功能研究。其中常用的克隆载体包括细菌人工染色体(BAC) , 酵母人工染色体(YAC),fosmid 和黏粒。 Massana 【35】 等首次将宏基因组技术引入微微型真核生物研究领域， 他们利用采集自地中海西部的布拉内斯湾的样品构建了微微型真核生物的宏基因组fosmid 文库 , 获得了 1 个全长为 35 kb 的克隆FBB25。PiganeaJ36等对马尾藻海的微微型真核生物进行了宏基因组研究，获得了 41个不同的大片段真核生物序列 , 且这些大片段真核生物序列的 GC 含量较高 , 因而推测不同环境压力可能对微微型真核生物碱基组成产生影响。对于多数种类均无法培养的微微型真核生物而言 , 宏基因组技术能够直接对基因组序列进行分析从而获知某一类群生物基因序列信息 , 进一步对其生理生化特征和生态地位等做出推测 , 是微微型真核生物研究领域的发展方向之一。但由于利用该技术需要较高的实验操作水平。3. 小结海洋微微型浮游生物是全球海洋中生物量和生产力的重要贡献者， 是海洋生 态系统的基础组成部分，对海洋碳泵作用、能量传递、微食物环等具有重要作用。目前研究微微型浮游生物丰度的方法主要有培养法、电镜、表面荧光显微镜、流式细胞仪等方法。而研究其多样性多使用分子生物学手段， 方法不一，熟悉其优 缺点将有利于选择合适的方法，减小误差。我国在微微型浮游生物研究领域起步 较晚，采用研究手段单一，数据积累较少，尤其是针对微微型真核生物分子多样 性的研究。希望本文可以为我国研究微微型浮游生物提供一个技术理论支持。参考文献【 1】 Azam F, Fenchel T, Field J G, Gray J S, Meyer-Reil L A, Thingstad F. 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