动物细胞培养生物反应器(可编辑)

动物细胞培养生物反应器 动物细胞培养生物反应器 随着基因工程的发展,通过动物细胞的培养所生产出多种疗效高的药物、灵敏的诊断试剂及生物技术制品,目前在这一方向上正发展成为一支高新技术产业。由于动物细胞与微生物细胞有很大的差异,对体外培养有严格的要求,如动物细胞对剪切非常敏感,反应器的设计不能像微生物细胞那样高的剪切力,因此,传统的微生物细胞反应器应该经过改造才能适用动物生物反应器,根据动物细胞的特点,开发新型的生物反应器显得十分重要和迫切。一、动物细胞培养过程 (一)动物细胞培养概论 动物细胞培养(cell culture)是从动物体内取出细胞并分散成单个细胞,模拟体内的生长环境,在无菌、适温和丰富的营养条件下,使细胞在体外继续生存、生长、增殖并维持结构和功能的一门技术。体外培养可分为原代培养(primary culture,亦称初代培养)和传代培养(subculture,亦称继代培养)。原代培养是指从机体内取出的细胞进行初次培养的过程。培养的细胞大约增殖10代左右称为原代细胞(primary cell);从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。 动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年,美国生物学家哈里森Harrison在无菌条件下,以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周,并观察到细胞突起的生长过程,创立了体外组织培养法。1923年,法国学者卡勒尔设计的卡氏培养瓶用于培养鸡胚的心肌组织取得成功,也使得多种动物组织培养获得成功。20世纪80年代以来,随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展,人们已经能够把特定的外源基因通过PCR扩增,并转染到动物细胞内,得到高质量的表达,由此可生产各种特殊的生物制品。德国生物技术公司Hauser用一个含人的IFN-基因的科斯质粒pCOSIFN-NDA(36000碱基对)与质粒pHC792COS/tk+DNA(含有单疱疹病毒的tK基因)通过磷酸钙沉淀技术,共转移进入小鼠LK-细胞,从而得到含干扰素基因的能分泌干扰素的细胞克隆。近年来发展起来的淋巴细胞杂交瘤技术,能大量繁殖并生产单克隆抗体,品种不下万种,其中数百种已在医学和生物学的各个领域得到了广泛的应用,使动物细胞培养进入了一个新的领域。到了90年代初期,世界单克隆抗体的销售已超过30亿美元,取得了明显的社会效益和经济效益。利用人工培养的动物细胞,可以分离和鉴定病毒,进行遗传工程、代谢及其调节方面的研究,并能根据其表达产物方面的优点(如转录后修饰和产物胞外分泌等),生产出许多与人类健康和生存密切相关的生物技术产品。因此,动物细胞培养工程正在逐步形成一支独特的高新技术产业,并显示出巨大的工业发展前景。 动物细胞的体外培养有三种类型,一类是悬浮培养,指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程,主要用于非贴壁依赖性细胞,此类细胞体外生长不需贴壁,可采用微生物的方法在培养基中悬浮培养。来源于血液、淋巴组织的细胞,许多肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和许多重组细胞都属于此类细胞。由于是悬浮生长,细胞密度一般都较高,易于大规模生产,便于过程的控制。另一类是贴壁培养,指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养,主要适用于贴壁依赖型细胞(亦称贴附型细胞),大多数动物细胞都属于这一类型。这类细胞生长需要附着于某些带适量正电荷的固体和半固体表面,细胞贴附生长后,不再是原有的形态,形态上一般单一化,主要有成纤维细胞型、上皮型、游走型和多形型等。再有一类是固定化培养,这类培养既适用于贴壁依赖性细胞,又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式,具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。由于所培养的细胞的不同,固定化培养的方式也有所不同,一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋,而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。 (二)动物细胞体外培养的特点 动物细胞属于真核细胞,与细菌等原核细胞相比,其进化程度更高,结构和成分更复杂,功能也更全面。虽然动物细胞培养的基本原理和微生物细胞相同,但动物细胞对营养的要求更为苛刻,除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖等基本营养元素外,还需要血清。动物细胞对于培养环境的适应性更差,对环境更加敏感,包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求,需要严格控制。另外,动物细胞相对于微生物来说,生长比较缓慢,因而培养时间较长。在细胞培养中,离体细胞对任何毒性物质都十分敏感,所以还需要防治污染问题,微生物、细胞残余物以及非营养的化学物质都有可能导致动物细胞培养物的污染。这些都给动物细胞的培养带来了一定的难度。 (三)动物细胞培养条件 1.无污染环境 细胞一旦离开机体,对环境无毒、无菌的要求也更高。因为动物体内存在着强大的免疫系统和肝脏等解毒器官,对侵入体内的少量的有毒物质,可进行抵抗和消毒,使细胞不受危害。当细胞被置于体外培养时,由于失去了抵抗能力,一旦污染便很容易导致细胞死亡。因此,在动物细胞进行体外培养时,保持无污染的环境是维持细胞生存的基本条件。 2.温度 温度是细胞在体外生存的基本条件之一,来源不同的动物细胞,其最适的生长温度是不尽相同的,例如人和哺乳动物的体内的温度为35-37,昆虫细胞的最适温度是25-28,培养细胞的最合适的温度也在这个范围,偏离这一温度范围,细胞的正常生长和代谢将会受到影响,甚至导致细胞死亡。一般来说,培养细胞对低温的耐受能力比高温强。温度不超过39时,细胞代谢强度与温度成正比;若高于40,细胞受到严重损伤,几小时内细胞便会死亡。细胞代谢随温度的降低而减缓,温度不低于0时,能抑制细胞代谢,但细胞仍能生存和生长,但速度缓慢。 3.pH值 大多数动物细胞培养的最适pH一般为7.2-7.4,偏离此范围对细胞将产生有害影响,严重时可导致细胞退变或死亡。不同的细胞对pH的要求也不完全相同,一般原代培养细胞对pH的耐受力更差一点。总的说来,细胞的耐酸性比耐碱性强一些。因此培养过程一定要控制pH,为维持培养液的pH恒定,最常用的是加入磷酸缓冲剂的方法。 4.溶氧及气体环境 细胞的生长代谢离不开气体,所需气体主要是O2和CO2,氧参与三羧酸循环,产生能量供给细胞生长和繁殖。CO2是细胞代谢产物,它能调节培养环境的pH。当细胞代谢旺盛时,不断释放CO2,培养液变酸;反之,当CO2外溢时,会使pH升高。 5.营养物质 动物细胞体外培养所需的营养物质与体内培养的基本相同,对营养的要求较高,需要多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子。大多数培养细胞对渗透压都有一定的耐受性,对大多数细胞来说,渗透压在260-320mOsm/kg每kg细胞耐受的溶质浓度为260-320mmol/L范围都适宜。在保证细胞渗透压的情况下,培养液里的成分要满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所需要的各种营养,只有满足了这些基本条件,细胞才能在体外正常生存、生长。 (四)动物细胞培养基 动物细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。动物细胞的培养基一般可分为天然培养基、合成培养基、无血清培养基几种,此外,动物细胞培养还需要一些常用的溶液。 1.天然培养基即直接取自动物体液或从组织中提取的成分做培养基,主要有血浆、血清、胚胎浸出液、鼠尾胶原等。天然培养基使用最早,营养成分最高,也最为有效,但成分复杂,个体差异大,来源也缺乏,因此使用受到限制。 动物血清是天然培养基中最常用的,血清含有许多维持细胞生长繁殖和保持生物学特性不可缺少的营养物质,包括蛋白质和核酸等。另外,血清能中和培养基中的有毒物质的毒性,使细胞免受伤害。常用的动物血清主要有胎牛血清、犊牛血清、小牛血清、人AB血清、兔血清等。其中胎牛血清质量最好,但来源少,价格较高,最常用的是小牛血清。血清中主要含蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、金属离子、促贴附物质等。 2.合成培养基合成培养基是参照天然培养基的成分,根据细胞生存所需物质的种类和数量,用化学物质人工模拟合成的。合成培养基成分已知,便于实验条件的控制。但由于天然培养基的有些成分尚未知,加上有些成分尚无法用已知的化学成分代替,因此,要想细胞更好的生长和繁殖,还需加入一定量的天然培养基,一般是加入小牛血清。 3.无血清培养基 无血清培养基不加动物血清,在已知细胞所需营养物质和贴壁因子的基础上,在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子,保证细胞的良好生长。动物血清成分复杂,对细胞培养易造成污染和毒性作用,不利于产品的纯化和检测,再加上来源有限、成本高等限制了它的大规模使用。无血清培养基的优势在于避免了血清的这些缺点。在生产单克隆抗体、细胞生长因子和疫苗等生物制品的应用领域中,优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。但无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型,不同类型的细胞甚至不同的细胞系或细胞株都有可能有各自的无血清培养基构成。在细胞早期培养阶段,细胞对于无血清培养基的适应性往往是克隆特异性的,每个新的克隆常需要重新配制培养基和适应过程。最近研究表明,先使野生型宿主CHO细胞适应无血清培养基培养,然后转染这些细胞得到的重组克隆在基因扩增后保持了在无血清培养基悬浮培养中的生长能力,其产品在生化和结构上类似于未处理的宿主细胞产物。 4.无蛋白培养基 无血清培养基中添加的蛋白成分价格昂贵,且有的成分如牛血清蛋白含有很多种杂质,因此,在无血清培养成功以后,科学家们又开始研究从培养基中减去这些成分。在对细胞的营养需求有比较深入认识的基础上,化学成分明确的无蛋白培养基已被用于中国仓鼠卵巢细胞CHO和杂交瘤细胞的培养。 5.细胞培养常用液 (1)消化液 主要用于细胞培养前的组织块解离和细胞的分散以及传代培养时细胞脱离贴壁表面并分散细胞。常用的消化液有胰蛋白酶溶液和二乙烯四乙酸二钠(EDTA)溶液。 胰蛋白酶溶液:呈黄色粉末状,易潮解,应冷藏干燥保存。胰蛋白酶来源于牛、猪等动物的胰脏,能使细胞间的蛋白质水解,使细胞分散。不同的细胞对胰蛋白酶的浓度、温度、作用时间的要求不一样。在pH8.0,37时胰蛋白酶的效果最好。常用的溶液的浓度是0.25%和0.125%两种。Ca2+,Mg2+的存在和血清、蛋白质的存在会降低胰蛋白酶的活力。所以用无Ca2+,Mg2+的溶液配制,消化结束时,用血清来阻制酶作用。 EDTA溶液:又称Versen,是一种化学螯合剂,对细胞有一定的解离作用。它毒性小,易配制,使用方便。常用的浓度是0.02%。如将EDTA和胰蛋白酶溶液按一定的比例混合使用,效果更好。 此外,胶原蛋白酶溶液、链酶蛋白酶溶液等也可用于消化细胞,但价格昂贵,保存困难,因而使用较少。(2)pH调整液 各种细胞对培养基的酸碱要求是十分严格的,因此,培养前一定要用pH调整液将培养基的pH调整到合适的范围。pH调整液应单独配制,单独灭菌,使用前加入灭菌的培养基。常用的pH调整液有Na2CO3溶液(7.4%、5.6%、3.7%)、10%醋酸溶液和HEPES液(20mmol/L,一种氢离子缓冲剂)。 (3)抗生素液 细胞培养的过程中,需向培养液中加入适量的抗生素液,以防止微生物的污染,而不影响细胞的生长。常用的抗生素有: 青、链霉素(双抗)液:取青霉素G100万单位、链霉素100万单位溶于50mL 灭菌的Hanks或三蒸水中作为母液。使用时在100mL培养基中加入0.5mL母液,则最终浓度为每毫升含100单位青霉素、100g链霉素。 卡那霉素液:取5万微克卡那霉素溶于50mLHanks液中,即成10,000g/mL的母液。使用时在100mL培养基中加入0.5mL母液,则最终浓度为50g/mL。 制霉菌素液:因其不溶于水,将其制成5,000g/mL的悬液,使用时在100mL培养基中加入0.5mL悬液,则最终浓度为25u/mL。 (五)动物细胞常用的培养方法 1.贴壁培养技术 大多数细胞在离体培养的条件下,都要附着在固体表面上才能生长。原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展成各种形态,一般在数天后就铺满生长表面,形成致密的细胞单层(monolayer cell)。当细胞生长到表面相互接触时,就停止分裂增殖,这种现象称为接触抑制(contact inhibition)。所以如需继续培养,需将单层细胞再分散,稀释后再重新接种,进行传代培养。贴壁培养的表面要求有带有适量的正电荷和高度的表面活性,主要材料有明矾?硅硼酸玻璃、聚苯乙烯、不锈钢等。贴壁培养的系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。 贴壁培养的一般步骤是,先将组织块消化,使之分散成细胞团或单个细胞状态,经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜营养液的培养系统中。然后放入CO2培养箱培养。 2.悬浮培养技术 少数非贴壁生长型细胞,如杂交瘤细胞,能在培养器中自由悬浮生长。将采集到的活体组织分散、过滤、离心、纯化、漂洗后接种到适宜的培养液中,置于特定的培养条件下培养。传代时不需再分散,只需按比例稀释即可继续培养。对于小规模多采用转瓶和滚瓶培养,大规模培养可采用类似发酵罐的生物反应器。悬浮培养设备要求简单、细胞增殖快,可借鉴微生物发酵的成功经验。但是,只有极少数的细胞适合这种悬浮培养。 (六)动物细胞大规模培养技术 动物细胞大规模培养技术始于20世纪60年代初Capstick及其同事为生产FDM 疫苗而对BHK细胞的研究。它是在传统的培养技术的基础上,融合固定化细胞、流式细胞技术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流和温和搅拌技术等发展起来的。 1.中空纤维细胞培养法 1972年,里查德?克瑞克(Richard Kncazek)等模拟体内微环境,设计了中空纤维细胞反应器。中空纤维是由聚枫或丙烯的聚合物组成的半透膜,水分子、营养物质和气体可以透过,细胞能在表面生长。细胞能在中空纤维上不断从流动的培养液中获得营养物质,细胞代谢产物和培养物又可随培养液的流走而运走。与前面介绍的细胞生长在二维空间的培养技术不同,中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态。培养系统的核心部分由3至6层这样的中空纤维组成,细胞接种于中空纤维的外腔。细胞向三维空间繁殖,形成类似组织的多层细胞群体,细胞密度可达109个/ml。培养一段时间后,可逐渐用无血清培养基代替天然培养基。此时细胞不在增殖,但可继续分泌产物,分泌物的纯度可达60%-90%。这种培养系统具有所占空间小,产物的分离纯化比较方便,细胞保持高度活性等优点,适合多种细胞的培养。 2.微载体培养技术 大多数动物细胞,都具有贴壁生长的特性,而传统的适于贴壁生长的细胞培养系统,由于表面积的限制,很难达到大规模生产的目的。最初采用的滚瓶系统,虽然能增加细胞生长的贴壁面积,但所占的空间大,劳动强度大、细胞产率低、不易监控等缺点限制了他的进一步发展。1967年,凡?维茨儿(Van Wezel)开发了微载体培养系统Microcarrier,MC培养贴壁细胞。经过几十年的研究,微载体培养已广泛地应用于动物细胞的培养,其中尤以Pharmacia生物技术公司生产的微载体Cytodex、Cytopore、Cytoline等使用范围最广。微载体培养是细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长,通过轻轻搅拌使细胞维持悬浮状态。这种培养较传统的单层细胞培养,面积大大增加。如将这种微载体在流化床式、固定床式反应器中进行培养,则可获得比原来多2050倍的高密度细胞。另外,这种培养的劳动强度减少,1升微载体培养生产的细胞相当于50个转瓶490cm2/瓶所生产的细胞,省却了玻璃容器等的清洗和准备工作。而且细胞与培养液的分离简单,一旦搅拌停止,3分钟后细胞即能依靠其重力而沉淀,只要去除上清液,而无须进行离心操作。减少了繁复的操作步骤,降低了污染率。目前,狂犬病毒精制灭活疫苗就是采用Cytodex培养Vero细胞而进行大规模生产的。 常用的微珠载体是DEAE-交联葡聚糖微粒。近年来,国外新开发的MC主要有液体微载体、大孔纤维素微载体、PHEMA微载体、聚苯乙烯孔微载体、聚氨酯泡沫微载体、磁性微载体。其中磁性微载体是由铁、钴或镍的磁性氧化物与经戊二醛处理的明胶混合、研磨,并用水解蛋白酶处理后制成,对疫苗、干扰素、生长素的生产均具有应用潜力,且产品质量较高。 但是,实心微载体的比表面积还是太小,于是人们设计了用微载体内部固定细胞。如海藻酸钠系统、琼脂糖系统、琼脂糖?海藻酸钠系统等。这类技术能维持很高的细胞密度,但很难达到2L以上的规模。1985年,Verax公司开创了大孔微载体培养技术,接着有了Percell系统和Siran系统。1986年,Nssina报道了明胶大孔微载体的制备及其在细胞培养中的应用。大孔微载体除了有利于细胞高密度大规模培养外,在外源蛋白的长期高效表达方面也明显的优势。 大多孔微载体以纤维素为基质,内部有许多网状的相互连通的小孔通向载体表面,细胞在接种后,易于进入微载体内部生长分裂,以避免剪切力或气泡的影响,即使大部分细胞免受机械损伤,又为细胞提供了充分的生长空间。Onderwater等报道,使用大多孔微载体培养能表达人类细胞色素P450同功酶的V79细胞,细胞量从接种时的2105/ml,增加到六天后的1107/ml。Zhaolie C等用多孔微载体Cytopore培养重组CHO细胞系4B3,最高细胞密度达到8.83106/ml11。胡显文等将Cytopore多孔微载体用于中试规模的反应器,也收到了很好的效果。另外,由聚乙烯和二氧化硅制成的微载体Cytoline,则适用于贴壁依赖性及非贴壁依赖性细胞的流化床或灌注培养。 3.微囊化培养技术 微囊是一种由半透膜制成的多孔微球体,酶及大分子不能从微囊中溢出,而小分子物质可以通过。微囊化技术是用固定化技术将细胞包裹在微囊里,在培养液中悬浮培养。细胞微囊化后,由于生长在各自的微小环境里,减少了培养时搅拌对细胞的剪切力,细胞生长良好,培养液易于迅速改变,且无分离细胞与培养液的困难。在培养过程中,微囊化也能提供很高的细胞密度,产物浓度和细胞纯度都有所增加。微囊化培养技术为单克隆抗体、干扰素、乙肝表面抗原等大规模生产提供了广泛的应用前景。 1987年,利姆(Lim)和萨姆(Sum)制成了细胞能在其生长繁殖的微囊。制备微囊化细胞所用的材料主要是海藻酸和多聚赖氨酸。将动物细胞和海藻酸溶液混合悬浮,经微囊发生器制成微球滴入氯化钙溶液中,制成凝胶球。然后用聚赖氨酸处理,使胶球表面包裹一层膜。最后用柠檬酸溶液处理,使细胞得以悬浮在微囊中。得到的动物细胞微囊就可悬浮与培养基中培养。据报道,微囊中单抗浓度很高,可达2.5g/L,且无其它杂蛋白,容易获得高纯度单抗。目前,微囊工艺已用于生产以克计的单克隆抗体。高表达有工业价值蛋白质的重组细胞近年来亦更多地用微囊化培养。二、动物细胞培养生物反应器 生物反应器是生化工艺过程中唯一一个把原料转化为产物的地方。在细胞培养过程中,细胞培养生物反应器是整个过程的关键设备,它要为细胞提供适宜的生长环境并决定着细胞培养的质量和产量。因此,生物反应器的选择对整个生物反应过程至关重要。动物细胞的大规模培养需要特殊的反应器,与微生物和植物细胞不同,动物细胞外层没有细胞壁,质膜脆性大,对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求。因此,传统的微生物发酵用的反应器不能用于动物细胞的大规模培养,而具备低的剪切效应、较好的传递效果和力学性质是这类反应器设计或改进所必须遵循的原则。70年代以来,细胞培养用生物反应器用很大的发展,种类越来越多,规模越来越大,但是反应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固定床为主。在国外,Celltech公司建立了10000L规模的生物反应器,培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体;Sumitomo公司建立了8000L搅拌反应器生产病毒疫苗、干扰素和其它生物制品,我国在“七五”期间已经开始这方面的研究,已成功地研制了CellCul-20A等细胞培养用生物反应器。 除了以人工诱变为目的的培养外,用于动物细胞培养的生物反应器的设计原则应该是尽量模拟培养物在生物体内的生长环境。由于动物细胞生长的特殊性,需要特别注意反应器结构设计以及特殊载体的选择。动物细胞培养用生物反应器大致有:气升式生物反应器,中空纤维管生物反应器,流化床生物反应器,搅拌罐生物反应器,堆积床生物反应器,一次性生物反应器,膜生物反应器等。 (一)气升式生物反应器(airlift bioreactor) 气升式生物反应器是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一,其特点是结构简单,操作方便。目前,我国利用生物反应器生产了大量生物制剂,多采用的是气升式细胞培养生物反应器。气升式细胞培养生物反应器的原理及结构见本书第五章第二节。 戴晓萍等人在气升式反应器中利用微载体培养技术,研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞,在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下,细胞可以正常生长至长满微载体表面,终密度可达1.13106个/mL。香港大学的Wen等人报道了一个新型的灌流装置,由气升式反应器和澄清器组成,用于高密度培养动物细胞。在灌流循环中,细胞经过两级沉降回到反应器,平均培养密度达到1.31107个/mL。 (二)中空纤维管生物反应器hollow-fiber bioreactor 中空纤维细胞反应器主体是由微孔中空纤维管束组成的,纤维束由外壳包裹,因此可分为壳体空间及管体空间两部分,每部分各有其进出口。一般地说,细胞生长在壳体部分,新鲜培养液从壳体部分导人,气体在管体部分通过,其中一部分则均匀地扩散至壳体部分。反应器结构如图6-32、6-33所示。壳体部分的细胞如是附壁性的,则附着在纤维外侧,在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化并冲出;若是非附壁性的,应采用微滤材料将其截留在壳体内而让废培养液排出。中空纤维管细胞培养装置的产率与细胞分泌速度有关外,还与细胞培养装置的设计有关。它由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养,既可培养悬浮生长的细胞,又可培养贴壁依赖性细胞,细胞密度最高可达109 cells/mL数量级。主要用于杂交瘤细胞生产单克隆抗体。 柱状中空纤维反应器是最目前最常用的中空纤维反应器类型,是理查德?克瑞克(Knazek)20世纪70年代初设计的。以Endotronics公司生产的最著名的AcusystPM大规模生产系统为例,这种反应器的套管是一圆柱体,包含了两条独立的流动通道,每条通道连接有6个中型的中空纤维反应器。整个反应器系统采用计算机监控各种生长参数,诸如营养盐供应、废物排出、pH、DO、T等。 因柱状中空纤维反应器中营养供应和代谢产物会存在浓度梯度,所以细胞分布受到影响而不均匀,限制了培养系统的进一步放大。由此,人们开发出板框式中空纤维反应器。该反应器的中心是一束中空纤维浅床,置于两个不锈钢微孔滤板之间,营养液通过滤板垂直流向纤维床乎面。虽然一定程度上克服了柱状中空纤维反应器的不足,但是因为中空纤维浅床厚度有限,因而培养系统也不可能太大。 John等报道了一个用于大规模培养动物细胞的径向流中空纤维反应器。该反应器内有一个垂直的中央分配管,外面由中空纤维管与分配管呈平行组成一个环状床层。培养液由中央分配管径向流过中空纤维床,细胞在中空纤维外壁贴附并生长。空气和CO2的混合气体在中空纤维间与培养液成错流流过床层,向细胞提供氧分并维持一定的PH值环境,细胞的代射物随气流带出。在这个反应器中细胞生长的表面密度可达7.3106个/cm2。 Guinn发明了一个可用于动物细胞培养的生物反应装置,由中空纤维反应器和灌流系统组成。液体通过泵在反应系统内循环,灌流系统补充或置换培养介质及移出代谢物。细胞在中空纤维膜的一侧生长,培养介质在膜的另一侧通过扩散向细胞传递营养。该反应器能为细胞提供一个温和的生长环境。用泵控制培养介质在反应器内循环。培养液在中空纤维腔内流动并通过中空纤维膜向另一侧供应细胞生长所需的养分。该反应器可控制溶氧、介质组成、温度和PH值,适合于细胞的高密度悬浮培养,尤其适合于动物细胞培养反应器,由氧渗透膜管和中空纤维束构成内外空间,供细胞生长和向细胞提供营养。细胞培养密度几乎能达到2108个/ml。该反应器可用于为大规模中空纤维培养系统预测不同介质、培养条件及其他因素对细胞生长可能产生的。中空纤维管反应器总的发展趋势是让细胞在管束外空间中生长,用这种方式,能获的更高密度的细胞。 (三)流化床生物反应器fluidizbed bioreactor 流化床生物反应器的基本原理是培养液通过反应器垂直向上循环流动,不断提供给细胞必要的营养成分,使细胞得以在呈流态化的微粒中生长。同时,不断加入新鲜培养液。这种反应器的传质性能好,并在循环系统中采用膜气体交换器,能快速提供给高密度细胞所需要的氧,同时排出代谢产物;反应器中的液体流速足以使细胞微粒悬浮却不损坏脆弱的细胞。流化床生物反应器满足了高密度细胞培养,使高产量细胞长时间停留在反应器中,优化了细胞生长与产物合成的环境等细胞培养的要求。流化床反应器可用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞的培养。另外,流化床反应器放大也比较容易,放大效应小,已成功地从0.5L放大至10L,用于培养同种细胞生产单克隆抗体,体积生产率基本一致。 (四)搅拌罐生物反应器stirtank bioreactor 搅拌罐生物反应器基本结构为:一个旋转过滤器、一台用于控制温度、pH值、搅拌速度和溶氧DO的数字控制装置DCU和起通气作用的底部环形喷气结构。基本原理是新鲜培养基分散进入旋转滤器的外部区域,从旋转滤器的中间获得无微载体的收集液。旋转滤器一般由不锈钢丝网构成,有良好的生物相溶性,易于清洗和消毒,可重复和长期使用。在搅拌式生物反应器中同样可以培养悬浮生长的细胞,又能培养贴壁生长的细胞。它主要的优点是能满足高密度细胞培养的要求。CelliGen笼式通气搅拌罐和20L双层笼式通气搅拌罐(CellCul-20)已经大规模培养多种细胞。1999年,美国人Zhaolie-c在搅拌式生物反应器中利用重组CHO细胞4B3生产了纤维蛋白溶酶原激活. (五)堆积床生物反应器packedbed bioreactor CelligenPlus堆积床生物反应器的工作原理为:当推进器impeller旋转时,培养基通过推进器的中心空管螺旋式地从罐体底部往上流,然后从3个出口中流出,通过堆积床向下流动至罐体底部,再通过推进器的中心管往上流。细胞附着在堆积床的聚酯片上,气体从喷射器喷出进入培养基中。通过调节气体混合物的组成成分,完成对pH和DO的控制,加入氧气或氮气以满足培养过程中氧气的吸收;当pH太高时加入CO2;空气作为一种填充气体,保持气体进入罐体时流速的稳定。培养基通过蠕动泵从培养基储存瓶mediareservoir中进入反应器,收集液通过蠕动泵从反应器中流出进入收集瓶。堆积床有以下特点:贴壁依赖性和悬浮细胞可成功地在堆积床内附着;细胞不接触气液界面,低漩流和低剪切力,细胞受到的伤害很小;反应器能以分批式或连续/灌流方式运转,并可维持长时间;聚酯片提供高的表面积/体积比率,维持高细胞密度。 国内有人采用美国NEW BRUNS WICK SCIENTIFIC公司生产的CelliGen Plus堆积床生物反应器,用无血清培养基培养分泌rhEPO的工程细胞株XP9501,用于大规模生产重组人促红细胞生成素。 (六)一次性生物反器disposable bioreactor 这种生物反应器由预先消毒的、FDA认可的、对生物无害的聚乙烯塑料箱组成,箱中部分填充培养基并接种细胞。箱中其余部分是空的,培养过程中空气连续通过这里,空气通过完整的过滤器进入箱体。前后摇动箱体使液气界面产生波动,大大提高了氧气的溶解量,有利于排出CO2,控制pH值,也促使培养液混合均匀,细胞和颗粒不会下沉。废气通过一个消毒过滤器和止逆阀。整个生物反应器置于传统的细胞培养用CO2培养箱中,便于控制温度和pH值,或者在箱体底部加热控制温度。培养细胞的密度可达到7106mL-1和100L的工作体积.使用前箱体用射线消毒,用后丢弃。特殊的开孔可进行无菌加样、取样,而不必把生物反应器置于层流罩中。装置简单,易于操作,成本低,低剪切力,无空气鼓泡,减低了气泡对细胞的损害。可用于培养动物细胞和植物细胞,并十分适合生产病毒。此反应器已成功悬浮培养重组NS0细胞生产单克隆抗体;悬浮培养人293细胞生产腺病毒adenovirus;用昆虫sf9细胞生产棒状病毒baculovirus;用微载体Cytodex3培养人393细胞。 植物细胞培养生物反应器 植物细胞培养是指在离体的条件下,将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中,进行振荡培养,得到分散成游离的细胞,通过继代培养使细胞增殖,从而获得大量的细胞群体的一种技术。植物细胞含有人类所需的成分,而传统的方法从植物中提取分离这些成分已很难满足人们的需求。近年来,利用植物细胞培养来生产有用代谢产物已受到广泛的关注,但是,只有一小部分的产品已成功用于商业化生产,其原因是反应器设计、过程发展以及对反应机理知识的欠缺等工艺上的限制。植物细胞生长缓慢、需氧低,此外,由于它们体积较大、细胞壁较厚、液泡较大而对剪切敏感。因此气升式和柱状生物反应器应用较为普遍。随着植物细胞悬浮培养技术的逐步完善,单细胞培养的成功,各种新型生物反应器的问世,利用植物细胞培养技术成为大规模生产植物代谢产物的有效途径。 一、植物细胞培养过程植物细胞培养按照培养对象可分为单倍体细胞培养和原生质体培养;按照培养基可分为固体培养和液体培养;按照培养方式可分为悬浮培养和固定化细胞培养。 单倍体培养 一般是指花药在人工培养基上进行培养,从小孢子(雄性生殖细胞)直接发育成胚状体,然后再长成单倍体植株;也可以通过愈伤组织诱导分化出芽和根,最终长成植株。 原生质体培养 将植物的体细胞(二倍体细胞)经纤维素酶等去掉细胞壁处理后,获得的原生质体(protoplast)在无菌培养基上生长、分裂,最终长成植株。也可以将不同植物的原生质体融合而获得体细胞杂交的植株。 固体培养是在微生物培养基础上发展起来的植物细胞培养的方法。培养基添加一定比例的琼脂配制,用培养皿、三角烧瓶或试管分装,经高压灭菌冷却凝固后接种经消毒过的外植体,整个过程需无菌操作。 液体培养 也是在微生物培养基础上发展起来的,可分为静止与振荡两种。静止培养无需任何设备,适合某些原生质体的培养。振荡培养需要摇床或转床等设备,可使培养物充分混合以利于气体交换。 细胞悬浮培养 是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的液体培养技术。在进行细胞培养时需要提供容易碎裂的愈伤组织进行液体培养。与微生物培养相似,植物细胞的悬浮培养也包括分批培养、半连续培养(也叫流加培养)、连续培养三种方式。目前,植物细胞大规模培养主要采用悬浮培养方式,这主要是由于悬浮培养可以增加培养细胞与培养液的接触面,促进营养的吸收;可带走培养物产生的有害代谢产物,避免高浓度积聚对细胞的伤害;可保证良好的混合状态,从而获得良好的气体传递效果;可以借鉴发酵工程的成熟技术,容易放大实现规模化。 固定化细胞培养 是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的。是固体培养的一种,但不是使用固体培养基,而是与固定化酶或固定化微生物细胞培养类似的一种植物细胞培养技术,目前应用最广泛的、能很好保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。具体培养方法将在下一节中介绍。 (一)植物细胞培养基 对植物细胞的生长而言,培养基的组成成分是一个决定性的因素。植物细胞培养与动物细胞培养相比,其最大的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上生长。其培养基主要由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸等组成。 1.无机盐类 对于不同的培养对象和形式,无机盐的最佳浓度是不相同的。通常在培养基中至少含有25mmol/L的硝酸盐和钾。虽然硝酸盐可以单独作为无机氮源,但是加人一点铵盐对细胞生长有利。如果铵盐单独作为氮源,添加一些琥珀酸或其他三羧酸循环酸效果更好。对常规的愈伤组织培养和细胞悬浮培养来说,硝酸盐加上铵的浓度可达到60mmol/L,说明铵可能对某些培养物有重要作用。镁、钙和硫元素的浓度在l3mmol/L范围较为合适。所需的钠、磷和氯化物有钙盐、磷酸盐和微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。 2.碳源和能源 蔗糖或葡萄糖是常规的碳源,而果糖的利用效果较差。其他糖类均不合适作为单一的碳源。培养基中蔗糖被迅速分解为葡萄糖和果糖,葡萄糖首先被利用,然后再利用果糖。大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是2%到4%。通常增加培养基中蔗糖的含量,可增加培养细胞的次生代谢产物量。 3.植物生长激素 植物激素是培养基中不可缺少的组成部分,大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。通常激素可分为二类:生长素和细胞分裂素。生长素能促进细胞分裂,常用的有吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和萘乙酸(NAA)。前两种不稳定,能被细胞释放的酶降解,而后两种被细胞降解的较慢,对热稳定。细胞分裂素常用的是6-苄基瞟怜(6-BA),激动素(kt)和玉米素(zeatin)。将分裂素和生长素一起使用,效果更佳。使用量在0.110mg/L之间,可根据不同细胞株而异。 4.维生素 在各种维生素中,硫胺素(维生素B2)可能是必需的,而烟酸和吡哆辛(维生素B6)对生长有促进作用。一般在培养基中都加了较多的肌醇,它能促进愈伤组织的生长。 5.有机氮源 通常采用的有机氮源有水解酪蛋白、谷氨酰胺或氨基酸混合物。在细胞初级培养的早期生长阶段,有机氮源可促进胚胎发生和多胚性出现。 6.有机酸在以铵盐作为单一氮源的培养基培养时,加人丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸等,能够保证植物细胞生长,并且耐受钾盐的能力也有所提高。 (二)植物细胞培养基的制备 配制培养基所用的蒸馏水最好是用玻璃容器蒸馏过的去矿质盐的蒸馏水,所用的无机盐、碳源、维生素应该采用高纯度级的药品。生长激素在使用前需要重结晶提纯,其酒精-水溶液要用吸附法脱色处理。蛋白水解液最好用酶水解。对于吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧基乙酸和萘乙酸这样难溶于水的生长激素类物质,配溶液时可先溶于95%的酒精中,然后慢慢加人蒸馏水,稍微加热,稀释至所需体积,再调节pH。由于培养基配比中有些组分量很小,可按培养基配方浓度配成使用浓度的10倍或者更多倍的母液,分成小瓶后冷冻保存,使用时再稀释到正常浓度。为了防止在高浓度下培养基组分间相互作用产生沉淀,钙盐、钠铁盐等要单独配制保存,使用时再稀释混合。维生素每种也是分开配制的。配制细胞分裂素物质,应先用少量浓度为0.5或1mol/L的盐酸来溶解,然后加蒸馏水至所需量。在培养基配制过程中可用0.5mol/L的HCl或0.2mol/LNaOH凋节pH,固体培养基加人琼脂0.6%1.0%,121蒸汽灭菌1520min。大多数培养基成分都经得起高温灭菌,对于一些热敏性化合物,如L谷氨酰胺、植物生长激素等应该用过滤法灭菌,然后再按无菌操作加人到己灭茵的培养基中。二、植物细胞培养生物反应器 与天然栽培法相比,利用植物细胞培养技术生产药用代谢产物、食品添加剂、化妆品等具有明显的优势,但能成功地把摇瓶培养的结果放大到生物反应器中而实现大规模培养的较少,可见研究合适的生物反应器对于植物细胞大规模培养生产有用代谢产物是非常重要的。植物细胞培养反应器最初大多采用微生物反应器。由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同,植物细胞较微生物细胞大,对氧需求小,对剪切力却很敏感,因此不象微生物培养那样采用高剪切的搅拌,而混合显得更重要。目前,由于植物细胞悬浮技术的发展,单细胞培养的成功,加上各种新型生物反应器的问世,使得植物细胞有可能像微生物那样在发酵罐中大规模连续培养。用于植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、非搅拌式及其它新型生物反应器,另外还有植物细胞固定化反应器和膜反应器等。 (一)机械搅拌式生物反应器 机械搅拌式生物反应器混合程度高,适应性广,能获得很高的溶氧系数KLa,在大规模生产中广泛使用。但是搅拌罐中产生的剪切力大,容易损伤细胞,且植物细胞培养一般只需较低的溶氧系数。因而对于有些对剪切力敏感的细胞,传统的机械搅拌罐并不适用。为此,对搅拌罐进行了改进,包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等,力求减少产生的剪切力,同时满足供氧与混合的要求。Kaman等采用带有1个双螺旋带状叶轮helicalribbonimpeller和3个表面挡板的搅拌罐,证明适于剪切力敏感的高密度细胞培养。Jolicoeur等进行了类似的研究,在反应器中得到与摇瓶相同的高浓度生物量。钟建江等通过培养紫苏细胞进行比较,发现带以微孔金属丝网作为空气分布器的三叶螺旋桨反应器MRP能提供较小的剪切力和良好的供氧及混合状态,优于六平叶涡轮桨反应器,并认为在高浓度细胞培养时,MRP型反应器将显示更大的优越性。离心式叶轮反应器centrifugalim-pellerbioreactor与细胞升式反应器cell-liftbiore-actor相比具有较高升液能力,较低剪切力,较短混合时间,在高浓度下具有高得多的溶解氧系数,表明有用于剪切力敏感的生物系统的巨大潜力。另有方框型桨式搅拌、蝶型涡轮搅拌等不同形式的机械搅拌罐用于植物细胞培养的生产和研究,结果证明不同叶轮产生剪切力大小顺序为涡轮状叶轮平叶轮螺旋状叶轮。一种升流式生物反应器lift-streambioreactor利用罐中心一根连有多孔板的杆上下移动达到搅拌的目的,可用于培养剪切力敏感细胞。 (二)非搅拌式生物反应器 相对于传统搅拌式反应器,非搅拌式反应器所产生的剪切力较小,结构简单,因此被认为适合植物细胞培养。其主要类型有鼓泡式反应器、气升式反应器和转鼓式反应器等。通过对培养紫苏细胞的生物反应器比较发现鼓泡式反应器优于机械搅拌式反应器。但由于鼓泡式反应器对氧的利用率较低,如果用较大通气量,则产生的剪切力会损伤细胞。研究表明,喷大气泡时,湍流剪切力是抑制细胞生长和损害细胞的重要原因。较大气泡或较高气速导致较高剪切力,从而对植物细胞有害。气升式反应器广泛应用于植物细胞培养的研究和生产。通过胡萝卜细胞培养研究发现,比较搅拌罐、气体喷射罐和带通气管的气升式反应器,最高细胞浓度和最短倍增时间可从气升罐中得到。气升式反应器用于多种植物细胞悬浮培养或固定化细胞培养,但其操作弹性较小,低气速时,尤其H/D大,高密度培养时,混合性能欠佳。过量供气,过高的氧浓度反而会影响细胞的生长和次生代谢产物的合成。将气升式发酵罐与慢速搅拌结合使用可弥补低气速时混合性差的弱点,采用分段的气升管,也有利于氧的利用与混合。转鼓式反应器用于烟草细胞悬浮培养的研究发现,与有一个通风管的气升式反应器相比,相同条件下转鼓式反应器中生长速率高,其氧的传递及剪切力对细胞的伤害水平方面均优于气升式反应器。 (三)光生物反应器 许多植物细胞培养过程中需要光照,往往考虑在普通反应器基础上增加光照系统,但在实际中存在很多问题,如光源的安装、保护,光的传递,还有光照系统对反应器供气、混合的影响等。小规模实验往往采用外部光照,反应器表面有透明的照明区,光源固定在反应器外部周围。但大规模生产时透光窗的设置,内部培养物对光的均匀接受等问题难以解决,因此许多人对采用内部光源的反应器进行了研究。Mori等发明的反应器将多个透明圆柱体平行安装在反应器罐内,光源放置在透明圆柱体中,供给CO2的气体交换器在罐内两个圆柱之间。Ogbon-na等研制了一种用于大规模培养光合细胞的新型内部光照搅拌式光生物反应器,它由每个单元都包含光源的多个单元组成。大的光生物反应器通过增加单元数目得到。每个单元中心固定一个玻璃管,光源插入其中,由搅拌桨实现混合,该搅拌浆设计成旋转时不接触玻璃管,玻璃管同时作为挡板,该反应器在低转速下仍有较高混合程度,而且剪切力较小。由于发光体并非机械固定在反应器上,且通过玻璃管与发酵液分离,因此反应器可高压灭菌,而发光体在冷却后插入玻璃管。Yamamurak等研究固定CO2的光反应器,特别之处在于搅拌器具有发光作用。 (四)亲和层析生物反应器 亲和层析生物反应器(affinity chromatography bioreactor ACBR)利用一个标准的反应器,加一个亲和层析柱,用于分离收集培养产生的目标蛋白。当细胞培养时,培养物用泵从反应器中抽出,进入柱中循环,所需的产物可分离得到,剩下的培养基回流到反应器。ACBR系统培养生产鼠单克隆抗体重链(HC Mab),其产量提高了8倍;培养生产6-his标记的人体粒细胞巨噬细胞克隆刺激因子(GM-GSF),比单批培养提高了2倍。用ACBR培养植物细胞,可以解除降解的影响,去除了引起产物抑制途径的蛋白。 (五)固定化植物细胞反应器培养 1.细胞固定化定义与意义 最早应用固定化技术是在酶工程中。细胞固定化是指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中、培养液呈流动状态进行无茵培养的一门技术。自从1979年植物细胞固定化成功以来,人们在生物反应器的植物细胞固定化培养方面开展了广泛深人的研究。固定化细胞培养技术是一项新型的细胞培养技术,对植物细胞的固定化并不影响其代谢活动,适合于细胞培养生产活性代谢产物。 植物细胞固定化培养具有许多潜在的优势,如细胞生长较为缓慢,利于次生代谢产物的积累;易于控制化学环境、收获次生代谢产物;细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小;有利于进行连续培养和生物转化。这些都使得固定化细胞培养系统具有很大的发展潜力。 2.植物细胞固定化方法目前,植物细胞经常采用的固定化方法有:凝胶包埋、表面吸附、网格或泡沫材料固定、膜固定(包括中空纤维)。经常采用的固定剂主要是一些多糖和多聚化合物等,如海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、角叉藻聚糖、明胶、聚丙酰胺等。 下面仅介绍几种最常用的细胞固定化方法: (1)滴入法 配置一定浓度海藻酸盐的溶液,高温、高压灭菌。将离心收集的植物细胞悬浮液与海藻酸盐溶液混合,倒人塑料注射器中,然后慢慢滴人到含有CaCl2的培养基中,不断搅拌,形成球形颗粒。过滤收集颗粒,清洗后,转人装有培养基的摇瓶中进行培养。与海藻酸盐固定化不同的是卡拉胶必须加热保持液态。可将卡拉胶和细胞悬浮液滴人含钾离子的培养基中形成颗粒,但形成的颗粒大小不如海藻酸盐均匀。而使用琼脂糖固定植物细胞不需要其他离子来保证胶的稳定性。 2模铸法 将细胞-固定剂的悬浮溶液注人由两块夹子夹紧构成的模子中形成颗粒。这种方法制备的颗粒为柱形颗粒,可用于间歇式培养,不适合填充床式反应器。而且这种方法仅适合制备少量的固定化细胞。 (3)两相法 将细胞-固定剂的悬浮溶液在不断搅拌的情况下分散于豆油等有