植物组织中淀粉含量的测定

植物组织中淀粉含量的测定2007-01-12 08:55I蒽酮硫酸法一、原理淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓 硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛化合物的显色 反应，即可进行比色测定。、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物材料。（二）试剂 浓硫酸（比重 1.84 ） 9.2mol/L HClO 4 。2%蒽酮试剂，同实验 24 。（三）仪器设备电子天平，容量瓶： 100 mL 4 个、 50 mL 2 个，漏斗，小试管若干支，电炉，刻 度吸管 0.5mL 1 支、 2.0 mL 3 支、 5 mL 4 支，分光光度计，记号笔。三、实验步骤1. 标准曲线制作取小试管11支从010编号，按表24-3加入溶液和蒸馏水。以下步骤按苯酚法或蒽酮法均可，见方法一或方法二，绘制相应的标准曲线。表 24-3 各试管加入标准液和蒸馏水量管号012 3 4 5 6910淀粉标准液 （ml）00.40.81.21.62.0蒸馏水（ml）2.01.61.20.80.40淀粉含量（ mg）040801201602002. 样品提取 称取50100 mg粉碎过100目筛的烘干样品，置于15 mL刻度试管 中，加入67 mL 80 %乙醇，在80 C水浴中提取30 min，取出离心（ 3000 rpm） 5 min ，收集上清液。重复提取两次（各 10 min ）同样离心，收集 三次上清液合并于烧杯，置于 85 C恒温水浴，使乙醇蒸发至23 mL ,转移 至 50 mL 容量瓶，以蒸馏水定容，供可溶性糖的测定。向沉淀中加蒸馏水 3 mL ，搅拌均匀，放入沸水浴中糊化 15 min 。冷却后，加 入 2 mL 冷的 9.2 mol/L 高氯酸，不时搅拌，提取 15 min 后加蒸馏水至 10 mL ，混 匀，离心 10 min ，上清液倾入 50 mL 容量瓶。再向沉淀中加入 2 mL 4.6 mol/L 高 氯酸，搅拌提取 15 min 后加水至 10 mL ，混匀后离心 10 min ，收集上清于容量 瓶。然后用水洗沉淀 1 2 次，离心，合并离心液于 50 mL 容量瓶用蒸馏水定容 供测淀粉用。3. 测定 取待测样品提取液 1.0 mL 于试管中，再加蒽酮试剂 5 mL ，快速摇匀，然 后在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620 nm 波长下，用空白调零测定光密度， 从标准曲线查出淀粉含量（ mg ）。四、结果计算 ：含量（ %）=100*C*VT/V1*1000*W式中： C 从标准曲线查得淀粉量， mg V T 样品提取液总体积 , mL 。V 1 显色时取样品液量， mLW 样品重， g 。0.9 由葡萄糖换算为淀粉的系数n碘-淀粉比色法一、原理对于淀粉含量较少的植株样品，也可采用碘 -淀粉比色法。淀粉在加热情况下能溶 于硝酸钙溶液中，当碘化钾和硝酸钙共存时，碘能以碘漩粉蓝色化合物沉淀全部淀粉。将此沉淀溶于碱液，并在酸性条件下与碘作用形成蓝色溶液进行比色。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物材料。（二）试剂1 80 %硝酸钙溶液。2 0.5 %碘液：称 5.00 g 结晶碘和 10.00 g 碘化钾，放入研钵混合干研，然后加 10 mL 蒸馏水研至全部碘溶解，将溶液全部转入 1000 mL 容量瓶定容后，贮于 磨口试剂瓶。 3 5 %含碘硝酸钙溶液：取 10 mL 80 %的硝酸钙溶液，加入 160 mL 水再加入 3 mL 0.5 %的碘液混匀，现用现配。4 标准淀粉溶液：称取纯淀粉 50 mg 于研钵中，加 3 mL 80 %硝酸钙溶液，研细 并转移到 100 mL 的三角瓶中，用 15 mL 80 %的硝酸钙溶液冲洗研钵，无损地收 集于三角瓶中。将三角瓶置于沸水浴中煮沸 5 min ，冷却后全部转入 50 mL 容量瓶 中并定容。此液为 1 mg/mL 的淀粉标准液。5 0.1 mol/L NaOH 。6 0.1 mol/L HCl 。（三）仪器设备 分析天平，研钵，容量瓶，量筒，三角瓶，水浴，小漏斗，电炉，离心机，离心 管，试剂瓶。三、实验步骤1 称取13 g叶片，剪碎放入研钵，加5 mL 80 %的硝酸钙溶液，研磨成糊状 移入 100 mL 的三角瓶中，用 10 mL 80 的硝酸钙冲洗研钵，无损地收集于三角 瓶中，瓶口盖上小漏斗，在沸水浴上煮沸 3 5 min （叶片含淀粉少的 3 min ，含 淀粉多的 5 min ），使样品中淀粉转变为胶体溶液。2 给三角瓶中加 20 mL 蒸馏水，混合液转入离心管中离心（ 2000 3000 rpm ） 2 3 min ，将离心后的淀粉胶体浑浊液移入 100 mL 容量 瓶（淀粉含量少时，可移入 50 mL 容量瓶），三角瓶及离心沉淀物用 5 10 mL 热蒸馏水冲洗并同样离心，离心液并入容量瓶中（共洗 2 3 次） 定容，即为淀粉提取液。3 取 5 10 mL 淀粉待测液，加入到盛有 2 mL 0.5 %碘液的离心管中，混匀静 置 15 min 后离心（ 3000 rpm ） 5 min ，弃上清液。沉淀用 5 %的含碘硝酸钙溶液 冲洗两次，向冲洗后的沉淀中加入 10 mL 0.1 mol/L 的 NaOH 混匀，将离心管浸入 沸水内 5 min ，使沉淀溶解。将溶液转入 50 mL 容量瓶中，加入 0.3 mL 0.5 %碘 液，用 30 mL 左右的水冲洗并入容量瓶，加入 2 mL 1mol/L 的盐酸，用水定容并显 色，在 590 nm 波长处测定光密度。4 绘制标准曲线 取标准淀粉溶液（ 1 mg/mL ） 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mL 于 6 个离心管中，用 80 %硝酸钙溶液将各管的体积补足至 5 mL ，再向各管加入 2 mL 0.5 %碘液， 混匀静置 15 min 后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在590 nm 波长下测定光密度。此系列溶液的淀粉含量分别为 0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 mg ，然后以光密度为横坐标，以淀粉 含量为纵坐标绘制标准曲线。四、结果计算 ：含量（ %）=100*C*VT/V1*1000*W 式中： C 从标准曲线查得淀粉量，mg 。V T 样品提取液总体积 , mL 。V 1 显色时取样品液量， mL 。W 样品重（ g ）III 旋光法（ 谷物淀粉含量的测定）一、原理： 酸性氯化钙溶液与磨细的含淀粉样品共煮，可使淀粉轻度水解。同时 钙离子与淀粉分子上的羟基络合，这就使得淀粉分子充分地分散到溶液中，成为淀粉溶液。淀粉分子具有不对称碳原子，因而具有旋光性，可以利用旋光仪测定淀粉 溶胶的旋光度（a，旋光度的大小与淀粉的浓度成正比，据此可以求出淀粉含 量。溶提淀粉溶胶所用的酸性氯化钙溶液的pH值必须保持2.30,密度须为1.30,加时间的长短也要控制在一定范围。因为只有在这些条件下，各种不同来源的淀粉 溶液的比旋度a才都是203恒定不变。样品中其他旋光性物质（如糖分）须 预先除去。二、材料、仪器设备及试剂：（一）材料：面粉或其他风干样品（二）仪器设备： 1. 植物样品粉碎机； 2. 离心 机； 3.分析天平； 4. 粗天平； 5. 旋光仪及附件； 6. 三角瓶； 7. 分样筛（ 100目）； 8. 布氏漏斗、抽滤瓶及真空泵； 9. 离心管； 10. 小电炉。（三）试剂：三、实验步骤：1. 样品准备：（ 1）称取样品：将样品风干、研磨、通过 100目筛，精确称取约 2.5g样品细粉（要求含淀粉约2g，请参考附注估计），置于离心管内。（2）脱 脂：加乙醚数ml到离心管内，用细玻棒充分搅拌，然后离心。倾出上清液并收集 以备回收乙醚。重复脱脂数次，以去除大部分油脂、色素等（因油脂的的存在会使 以后淀粉溶液的过滤困难）。大多数谷物样品含脂肪较少，可免去这个脱脂手续。（3）抑制酶活性：加含有氯化高汞的乙醇溶液10ml到离心管内，充分搅拌，然后离心，倾去上清液，得到残余物。（4）脱糖：加80%乙醇10ml到离心管中， 充分搅拌以洗涤残余物（每次都用同一玻棒），离心，倾去下清液。重复洗涤数次 以去除可溶性糖分。2. 溶提淀粉：（1）加醋酸-氯化钙：先用醋酸氯化钙溶液约 10ml加到离心管中，搅拌后全部倾入250ml三角瓶内，再用醋酸氯化钙溶液 50ml分数次洗涤离心 管，洗涤液并入三角瓶内，搅拌玻棒也转移到三角瓶内。（2）煮沸溶解：先用蜡笔标记液面高度，直接置于加有石棉网的小电炉上，在4min5min内迅速煮沸，保持沸腾15min17min，立即将三角瓶取下，置流水中冷却。煮沸过程中要时加 搅拌，勿令烧焦；要调节温度，勿使泡沫涌出瓶外；常用玻璃将瓶侧的细粒擦下； 并加水保持液面高度。3. 沉淀杂质和定容：（1）加沉淀剂：将三角瓶内的水解液转入 100ml容量瓶，用醋酸氯化钙溶液充分洗涤三角瓶瓶，并入容量内，加30% ZnSO41ml混合后，再加15% K4Fe （CN） 61ml,用水稀释至接近刻度时，加 95%乙醇一滴以破坏泡 沫，然后稀释到刻度，充分混合，静置，以使蛋白充分沉淀。（ 2）滤清：用布氏 漏斗（加一层滤纸）吸气过滤。先倾清溶液约 10ml 于此滤纸上，使其完全湿润， 让溶液流干，弃去滤液，再倾清溶液进行过滤，用干燥的容器接受此滤液，收集约 50ml,即可供测定之用。4. 测定旋光度：用旋光测定管装满滤液，小心地按照旋光仪使用说明，进行旋光 度的测定。淀粉（）= aX NX 100/20aW K） X100式中：a用钠光时观测到的旋光度；a 20 D:淀粉的比旋度，在这种方法条 件下为203 L :旋光管长度（cm）; W:样品质量（g）; K :样品水分含量（%）; N :稀释倍数；100：换算为百分率。也可以不用上列公式计算，改用工 作曲线来求得淀粉含量，这样准确度高些。m、淀粉含量的测定一、目的掌握植物组织中淀粉含量测定的原理和方法。二、原理淀粉用盐酸水解转化成葡萄糖后，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量。三、材料、仪器设备及试剂材料、仪器设备及试剂与上述蔗糖的测定相同，另增加碘试剂；100ml、 250ml 容量瓶。碘试剂（碘化钾一碘溶液）的配制：称取碘化钾20g及碘10g溶于100ml蒸馏水中。使用前需稀释 10 倍。四、实验步骤1. 葡萄糖标准曲线制作与上述还原糖含量测定相同。2. 淀粉的水解取上述还原糖含量测定中经 85%乙醇浸提后的全部淀粉残渣，放入 100ml三角瓶中，加 入6molL1盐酸10ml，混匀，在沸水浴中加热 10min 30min （用碘试剂检查淀粉水解程 度，直至不显蓝色为止），再加蒸馏水 20ml, 摇匀并过滤于 100ml 容量瓶中，过滤后残渣再用 蒸馏水冲洗3次，一并过滤入容量瓶，定容至 100ml。准确取出10ml过滤液置入250ml容量 瓶中，加酚酞2滴，用10% NaOH中和至微红色，用蒸馏水定容至 250ml，待测。3. 还原糖含量测定取4支25ml刻度试管，编号，其中 3支（三个重复）分别加入待测液 2ml,1支空白管加 2ml蒸馏水代替样品液，然后各管再加入 DNS试剂1.5ml，摇匀，混合液在沸水浴中加热 5mi n,然后用自来水冷却，各加入 21.5ml蒸馏水使总体积为 25ml，摇匀，在520nm波长下测定 吸光度（A）值。五、结果计算根据待测液的吸光度从上述标准曲线中查出其相应的还原糖含量,然后按下公式计算出样 品中还原糖（葡萄糖）含量和淀粉含量的百分率。淀粉水解液总量（ ml）从标准曲线上查得还原糖 （mg） X 测定时水解液用量（ ml）还原糖（%）葡萄糖）= X100样品重( mg)粗淀粉含量（）=葡萄糖含量 X 0.9式中系数0.9依据淀粉（GHQ） n水解时吸收n个分子水。