蛋白质组学实验

蛋白质组学实验蛋白质组学实验2012.09考考 试试 安安 排排n科科 学学 素素 质：质：10%10%n实实 验验 操操 作：作：10%10%n实验结果与报告：实验结果与报告：40%40%n实验原理测验：实验原理测验： 40%40%l课堂提问课堂提问l原始实验记录原始实验记录l团队合作团队合作l课堂纪律课堂纪律l仪器、用具的使用仪器、用具的使用l台面整洁台面整洁l考勤考勤l卫生值日卫生值日1 1、平时表现、平时表现2 2、以其中两次实验的操作为主要评分依据。、以其中两次实验的操作为主要评分依据。实验结果与报告实验结果与报告根据个人所有实验的结果与实验报告的根据个人所有实验的结果与实验报告的评分，取平均分。评分，取平均分。实验原理测验实验原理测验 考试时间：第考试时间：第8 8周周 考试地点：本实验室考试地点：本实验室 考试形式：笔试考试形式：笔试 考试内容：考试内容： 实验理论、知识、技巧：实验中的各种小窍门，注意事实验理论、知识、技巧：实验中的各种小窍门，注意事项，理论知识，操作要点等。项，理论知识，操作要点等。实实 验验 一一目的基因的原核表达、纯化及鉴定实验目的实验目的l掌握目的基因原核掌握目的基因原核诱导表达诱导表达的原理及方法的原理及方法l了解目的蛋白质了解目的蛋白质 “标签标签”纯化纯化的基本原理和的基本原理和方法方法l掌握掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法变性凝胶电泳的原理及方法l掌握考马斯亮蓝染色的方法掌握考马斯亮蓝染色的方法l目的蛋白质的诱导表达l目的蛋白质的纯化l目的蛋白质的检测实验原理实验原理 转化表达宿主菌转化表达宿主菌 诱导优化表达目的蛋白诱导优化表达目的蛋白 纯化目的蛋白纯化目的蛋白1. 转化带有转化带有T7RNA 聚合酶基因聚合酶基因 的菌株的菌株1.确定表达时间和温度的最佳条件确定表达时间和温度的最佳条件2.分析蛋白溶解性分析蛋白溶解性3. SDS-PAGE, Western 印迹等印迹等 确定目的蛋白确定目的蛋白1. 放大培养放大培养2. 制备粗提物制备粗提物3. 亲和纯化亲和纯化（一）（一）目的蛋白的原核诱导表达目的蛋白的原核诱导表达1.掌握蛋白质诱导表达的原理掌握蛋白质诱导表达的原理2.学习蛋白质诱导表达的方法学习蛋白质诱导表达的方法3.了解重组蛋白质表达的体系及其优缺点了解重组蛋白质表达的体系及其优缺点背景理论知识Section 1l蛋白质的表达是指为获取大量的目标蛋白而进行的有目的性的蛋白质合成。l需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其他载体，然后导入活细胞，外源基因可在宿主细胞高效表达，从而获得有重要价值的蛋白质产品。l包括外源基因的克隆、转录、翻译、加工、分离纯化。l进行大量表达和纯化是为了在体外进行功能分析。外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞克隆获得目的基因l酵母表达系统酵母表达系统 昆虫表达系统昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统l表达的蛋白具有正常的活表达的蛋白具有正常的活性、构象性、构象l技术难度较大、耗时、耗技术难度较大、耗时、耗资资l大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统l实验技术简单，时间较短，实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备费用低，系统比较完备l不能有效地对重组蛋白质不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工，易形成包进行修饰加工，易形成包涵体涵体原核细胞表达系统 真核细胞表达系统蛋白质表达系统蛋白质表达系统大大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。低，生产成本低廉。原核表达的特点l细菌细菌RNARNA聚合酶不能识别真核基因启动子聚合酶不能识别真核基因启动子l真核基因真核基因mRNAmRNA无无SDSD序列，不能启动翻译序列，不能启动翻译l缺乏转录后加工系统，不能切除内含子缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, , 要求要求cDNAcDNAl表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏l缺乏翻译后加工体系缺乏翻译后加工体系l不溶性的包涵体不溶性的包涵体在在E.ColiE.Coli中表达重组蛋白：中表达重组蛋白：l目的基因受噬菌体目的基因受噬菌体T7T7强转录及翻译信号控制强转录及翻译信号控制l表达由宿主细胞提供的表达由宿主细胞提供的T7 RNAT7 RNA聚合酶诱导聚合酶诱导l充分诱导充分诱导: : 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, , 数小时后达细胞总蛋白的数小时后达细胞总蛋白的50%50%以上以上l非诱导条件下非诱导条件下: : 可使目的基因完全处于沉默状态而不转录可使目的基因完全处于沉默状态而不转录实验原理实验原理目的蛋白质的诱导表达目的蛋白质的诱导表达lacI （Lactose）lacI是大肠杆菌中lac 操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是lac 操纵基因（Operator）的抑制因子，抑制转录启动。当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac 操纵子上的结构基因lacZ（-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以正常表达，启动转录。IPTG（异丙基-D-1-硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此IPTG经常作为lac 操纵子的诱导剂而使用。实验原理E.E.ColiColi BL21BL21（DE3DE3）：）：DE3DE3是整合在细菌基因组上的一是整合在细菌基因组上的一种携带种携带T7 RNAT7 RNA聚合酶基因和聚合酶基因和lacIlacI基因的基因的噬菌体，其噬菌体，其基因型为：基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5lacIlacI产生的阻遏蛋白与产生的阻遏蛋白与laclac操纵基因结合，从而不能操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTGIPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。基因大量转录并高效表达。l原核表达系统菌株原核表达系统菌株l菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。l经典的E. coli BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型。l大名鼎鼎的BL21(DE3) 则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。 l原核表达质粒的构建原核表达质粒的构建l目的基因目的基因l表达载体表达载体PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位点多克隆位点l表达载体表达载体l能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基础上增加表达元件表达元件，就构成了表达载体。l元件l启动子、终止子、核糖体识别序列l诱导性表达所需要的元件诱导性表达所需要的元件l操纵子序列操纵子序列l调控基因调控基因l多克隆位点l融合Tagl复制起始序列l筛选标记/报告基因l各种表达载体的不同之处 在于其表达元件的差异。l启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子，l 转录终止子l 核糖体结合位点启动子、终止子、核糖体识别序列启动子、终止子、核糖体识别序列操纵子序列及配套的调控基因操纵子序列及配套的调控基因l诱导性表达所需要的元件多克隆位点多克隆位点复制起始序列复制起始序列l筛选标记筛选标记/ /报告基因表达报告基因表达l抗药性基因，抗药性基因，Amp是最常见的筛选标记，是最常见的筛选标记，kana，新霉素，新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。四环素，红霉素和氯霉素。l抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。用。lGFP（绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因，半乳糖苷酶，（绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因，半乳糖苷酶，荧光素酶。荧光素酶。l常用表达载体常用表达载体lpGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白表达系统的载体。lPtac PromoterlAmplpGEX KGlGST GST （26kDa26kDa）lpET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。lT7lKanalpET-DSBAl 6 His Tag 6 His Tag （660Da-2kDa660Da-2kDa）pETpET系列系列pGEXpGEX系列系列D DNANA转录和转录和RNARNA翻译，即遗传信息从基因流向翻译，即遗传信息从基因流向RNARNA又流向蛋白质的过程又流向蛋白质的过程总称为基因表达总称为基因表达, ,基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控。达的调控。1.1.影响转录水平的因素：强启动子，强终止子等。影响转录水平的因素：强启动子，强终止子等。2.2.影响翻译水平的因素：影响翻译水平的因素：SDSD序列，序列，mRNAmRNA稳定性等。稳定性等。3.3.影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。影响表达效率的主要因素优化表达 （1）l增加蛋白质溶解性及折叠增加蛋白质溶解性及折叠: : 温度温度: 37: 37 C C 蛋白质以聚集的形式表达蛋白质以聚集的形式表达-包涵体包涵体 3030 C C 可溶的有活性的蛋白可溶的有活性的蛋白 细胞周质定位细胞周质定位: : 有利于蛋白折叠及二硫键的形成有利于蛋白折叠及二硫键的形成l稀有密码子稀有密码子: : 多数氨基酸都有一个以上的密码子多数氨基酸都有一个以上的密码子, , 但有一些但有一些 E. ColiE. Coli很少很少 使用使用, , 当异源目的基因的当异源目的基因的mRNAmRNA过表达时过表达时, tRNA , tRNA 的数量直接的数量直接 反应密码子的偏倚性反应密码子的偏倚性, , 一个或多个一个或多个tRNAtRNA的稀有或缺少会导的稀有或缺少会导 致翻译的停止致翻译的停止l毒性基因和质粒稳定性毒性基因和质粒稳定性: : 抗生素的使用抗生素的使用 补充葡萄糖补充葡萄糖l提高翻译水平：提高翻译水平： 调整调整SDSD序列与序列与AUGAUG间的距离、点突变改变碱基、增加间的距离、点突变改变碱基、增加mRNAmRNA稳定稳定性性l减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平：减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平： 细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。 化学诱导，温度诱导。化学诱导，温度诱导。l提高蛋白质稳定性，防止降解。提高蛋白质稳定性，防止降解。 表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代谢负荷、恢表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代谢负荷、恢复天然构象）复天然构象）优化表达 （2）实验操作Section 2实验器材1 1、E. coliE. coli BL21(DE3)/pET-DSBA BL21(DE3)/pET-DSBA 每组同学（每组同学（30ml30ml菌液菌液/ /三角瓶）三角瓶）2 2、IPTG IPTG （乳糖结构类似物）（乳糖结构类似物）3 3、LB(AmpLB(Ampr r) )4 4、摇床、摇床5 5、离心机、离心机实验步骤(1)1.1.原核表达载体转化到原核表达载体转化到BL21(DE3)BL21(DE3)菌株中。菌株中。2.2.挑取单菌落于挑取单菌落于2 mL Amp2 mL Amp+ + LBLB培养基培养基37振荡培养过夜。培养过夜。（已做）（已做）3.3.以以1%1%的比例转接于的比例转接于20 mL Amp20 mL Ampr r LB LB培养基中，培养基中， 37振荡培养约培养约1 1小时至小时至ODOD600600=0.4-0.6=0.4-0.6，即，即可开始诱导目的蛋白的表达。可开始诱导目的蛋白的表达。4.4.取取1mL1mL菌液菌液, ,制样作为未诱导对照。制样作为未诱导对照。5.5.三角瓶中加入三角瓶中加入IPTG 20 uLIPTG 20 uL至终浓度为至终浓度为0.1mM0.1mM，继续继续37振荡培养培养1 h1 h。制样：制样：l取取1 mL1 mL菌液置于菌液置于1.5 mL EP1.5 mL EP管中，管中， 12000 rpm12000 rpm离心离心1 min1 min，去掉上，去掉上清；其余菌液装入清；其余菌液装入50 mL50 mL离心管中，离心管中，6000 rpm6000 rpm离心离心5 min5 min，弃上清，弃上清收集菌体，冰箱冷冻保存。收集菌体，冰箱冷冻保存。l向向1.5 mL EP1.5 mL EP管中加入管中加入25 uL ddH25 uL ddH2 2O O，重悬，重悬( (充分分散细胞充分分散细胞) )。l加入加入25 uL 225 uL 2SDSSDS凝胶加样缓冲液，混匀。凝胶加样缓冲液，混匀。l沸水浴沸水浴5 min(5 min(蛋白质变性蛋白质变性) )，取出后立即置于冰上。，取出后立即置于冰上。l冷却后，冰箱冷藏，备用。冷却后，冰箱冷藏，备用。实验步骤(2)l诱导和取样时要进行无菌操作。诱导和取样时要进行无菌操作。l制备样品时制备样品时,细菌培养基上清除干净细菌培养基上清除干净,且要充分且要充分悬浮。悬浮。l 如何通过调节如何通过调节IPTGIPTG的浓度和温度来的浓度和温度来控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的可溶性？可溶性？下下 次次 实实 验验诱导表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测开始吧！LETS BEGIN NOW！