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生物专业植物生理实验论文低温胁迫对菠菜叶片抗寒性的影响颖 低温胁迫对菠菜叶片抗寒性的影响王新颖 王文岩(东北农业大学、农学院、哈尔滨市、150030)【摘 要】:植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常的情况下,细胞膜对物质具有选择性能力。植物组织受到逆境伤害时,由于膜的功能受损或结构破坏,而使其透性增大,细胞内的盐类或有机物将有不同程度渗出,从而引起组织浸泡液电导率发生变化,通过测定外渗液电导率的变化,就可以反映出质膜的受害程度和所测材料抗逆性的大小。伤害越重,外渗越多,电导率的增加也越大;在过氧化物酶催化下,过氧化氢将愈创木酚氧化成棕褐色产物,此产物在470nm处有最大吸收峰值,故可通过测470nm下的吸光值变化测定过氧化物酶的活性。过氧化物酶活性以每毫克蛋白质每分钟内的活性单位来表示。本次实验主要是通过菠菜在低温胁迫条件下,细胞膜遭到破坏,膜透性增大,通过实验使我们了解低温胁迫对菠菜叶片抗寒性的影响。【关键词】:菠菜、低温、抗逆性、外渗电导率、过氧化物酶活性0 前言菠菜Spinach是人们经常食用的主要蔬菜。它属于藜科菠菜属的1、2 a生草本植物。在华北的大部分地区,耐寒性较强的尖叶菠菜可以安全越冬,因此了解低温胁迫对菠菜的生理影响,探索菠菜的抗寒生理机制,对于通过基因工程手段提高冷敏感植物的抗寒能力,选育抗寒性强的品种及其栽培管理都有重要的意义。为此,研究了菠菜在秋、冬季节随着温度的降低,叶片与根的可溶性糖、游离脯氨酸Pro、丙二醛MDA的含量、超氧化物歧化酶SOD的活性,以期了解菠菜在自然环境低温的冷驯化过程中,这些抗性指标的变化及其与抗寒性之间的关系。1虽然植物本身具有一定的抗寒性, 可是不同植物种类和品种有不同的抗寒性,不同器官的抗寒性也不一样。 植物抗寒性也能通过一些途径提高, 这对于避免和减少寒害损失有重要意义。近年来, 许多植物的抗寒性研究取得了可喜的进展, 主要就抗寒性的生理基础, 提高植物抗寒能力的研究以及抗寒育种途径等方面进行阐述2。近20年来,分子生物学的迅猛发展,对于揭示植物抗寒机理和提高抗寒力方面起了重要的作用。但总体来说, 利用分子生物学技术进行植物抗寒性研究还比较薄弱, 有许多急待解决的问题。3首先体现在植物的抗寒分子机理特别是信号转导及调控基因的表达,抗冻蛋白的结构特征和生理功能研究得不够深入, 还处于开始阶段, 而抗寒分子机理研究影响着抗寒基因工程的应用。4 抗寒基因工程大多是围绕着单个基因研究, 而植物的抗寒性是多基因控制的, 应该结合多个相关基因进行系统的研究。5目前植物的抗寒性研究大多集中在作物、果树、 蔬菜上, 对于园林观赏植物研究得较少。 而现在人们对于热带亚热带观赏植物的需求快速增长,这些植物恰恰由于地域气候的限制并不耐低温, 因此观赏植物的抗寒性机理研究, 以及如何提高观赏植物抗寒力将是今后重要的研究方向6。 1 材料与方法1.1 材料 菠菜(Spinach)、市售 1.2 方法(一)外渗电导率的测定 1、取菠菜叶片打孔40片,分成4份,至于4个小烧杯中。 2、将两个烧杯中的叶片放入冰箱中冷处理10min。 3、取蒸馏水10ml测定电导率(S0)。 4、将处理的和未处理的4份叶片分别放入注射器中,吸收10ml蒸馏水,堵住注射器口进行抽气至叶片全部沉入水中。 5、将注射器内的蒸馏水和叶片倒入洁净烧杯中,再加入10ml蒸馏水,摇匀后测定电导(St1)。 6、测定后,将烧杯中的液体煮沸,冷却至室温,测电导(St2)。 过氧化物酶活性的测定 取0.5g叶片、加入少量磷酸缓冲液研磨至匀浆,转入离心管中,4000r、离心10min,然后取上清液定容至10ml,备用。 测定样品对照pH5.5、0.05molPBSml2.82.80.05M愈创木酚溶液(ml)1.01.02%H2O2ml1.01.0酶液(ml)0.20.22%三氯乙酸(ml)?2.0 3、470nm波长下测定吸光度,每隔30s记录数值; 4、根据测量数据制作制作吸光度时间曲线。1.3 生理指标的测定方法 过氧化物酶活性的测定:愈创木酚法7 过氧化物酶是植物体内普遍存在的,活力较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用、及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活力不断发生变化,因此测量这种酶,可以反映某一时期植物体内代谢的变化。在H2O2存在的条件下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色的4-邻甲基苯酚,该物质在470nm处有最大吸收峰,可用分光光度计测量470nm的吸光度的变化,从而测定过氧化物酶的活力。OD470越大,说明过氧化物酶活力越高,反之亦然,故可通过测470nm处的吸光度变化来测定过氧化物酶的活性5 外渗电导率的测定:DDS-307电导率仪法8 植物在遭受低温胁迫后,细胞膜遭到破坏,膜透性增大,从而使细胞内的电解质外渗,以致植物细胞浸提液的电导率增大。基于电导率测定得出低温胁迫对植物抗寒性的伤害率,电导率越大表明植物受到的伤害程度越大。抗寒性较强的植物在冻害较轻的情况下,不仅膜的透性变小,而且渗透性的变化可以逆转、已恢复正常;反之,抗寒性弱的细胞或者受害重者膜透性明显增大,而且不能恢复正常以致造成伤害甚至死亡。这种明显地出现在外部形态的变化之前,因此可以作为抗寒性的生理指标。 结果与分析表1测电导率的原始数据处理煮沸前(St1)(-1煮沸后(St2)(-1Sck正常第1组605200第2组584900St冷冻第1组55006400第2组51006200公式: LSt1-S0/St2-S0 S0 6-1 伤害度(%)(Lt-Lck)/(1-Lck)100 表2 测过氧化物酶活性的原始数据时间(min00.51.01.52.02.53.03.54.0正常处理0.0530.0880.1260.1520.1720.1870.1970.2040.209冷冻处理0.0460.0670.0880.1030.1170.1260.1340.1400.145根据原始数据,制作吸光度时间曲线,如下图:公式: 过氧化物酶活性(A470Vt)/WVs0.01t u/(g?min)A470:斜率W:样品重(g)0.5t:反映时间(min)1Vt:酶液总体积(ml)10Vs:测定时取用酶液体积(ml)0.2表3 低温胁迫下菠菜生理指标的测定结果品种 温度() 过氧化物酶活性 电导率L伤害度%(U/g?min)菠菜室温 350 0.01 85.86 ?20 290 0.862.1 过氧化物酶过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活力较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活力不断发生变化,因此测量这种酶,可以反映某一时期植物内代谢的变化。OD470越大,说明对应的过氧化物酶活力越高,反之亦然。 2.2 外渗电导率 当植物受到逆境影响时,如高温或低温、干旱、盐渍、病原菌侵染后,细胞膜遭到破坏,膜透性增大,从而使细胞内的电解质外渗,以致植物细胞浸提液的电导率增大。本实验中,40恒温培养箱内萎蔫0.51h的处理叶片,等于受到了高温及干旱逆境的影响,相对于对照来说,其叶片细胞膜遭到破坏,膜透性增大,从而使细胞内的电解质外渗,以致处理叶片细胞浸提液的电导率增大。试验中所用的3种伤害率表达方式,都是基于电导率测定得出的,电导率越大,表明叶片受到伤害的程度也越大。 讨论 植物对于低温胁迫的影响是敏感的,以往对于植物组织受的判断仅局限于外观形态表现,而外观表现往往是滞后于体内生理指标的变化,导致不能在早期低温胁迫下,对植株寒害进行评估和采取预防措施。本试验以菠菜为材料,研究低温胁迫对叶片的外渗液电导率和过氧化物酶的活性影响,对进一步研究植物寒害发生机理而言从而进行寒害防止,是一项有意义的研究。经试验研究发现低温胁迫下,细胞内电解质外渗增多,引起组织外渗液电导率增大。所测得的电导率越大,植物叶片的抗寒性越弱,植物组织所受伤害越大;电导率越小,植物叶片的抗寒性越强,伤害越小。同时,低温胁迫下,植物叶片中的过氧化物酶的活性越大,膜的稳定性越强,植物的抗寒性越强;若过氧化物酶的活性越小,则植物膜的稳定性越弱,伤害越大。 本试验以菠菜为材料,研究低温胁迫对叶片的外渗液电导率和过氧化物酶的活性影响,对进一步研究植物寒害发生机理而言从而进行寒害防止,是一项有意义的研究。研究表明在低温胁迫下,植物细胞膜透性增加细胞内的可溶性物质大量外渗,最后引起植物代谢失调。过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类,其活性高低与酚类物质代谢,植物抗性密切相关,活性高当然抗逆性越强,低就越弱,也就是对于逆境的忍受能力。植物膜系统与其抗寒性密切相关。细胞的基本骨架是一个生物膜系统。质膜首先接受外界刺激,然后通过一系列的反应引起细胞发生一系列生理生化反应,并且质膜的组成成分与其抗寒性有密切关系。当植物遭受低温伤害时,生物膜首先发生膜脂物相的变化,导致膜的透性增大,从而导致细胞生理生化代谢的变化和功能的紊乱。 参考文献: 1 范玉贞, 菠菜抗寒性生理机制的研究S.北方园艺,200911:63-65 2 彭筱娜,易自力,蒋建雄, 植物抗寒性研究进展.生物技术通报, 2007 年第 4 期 3 蔡明历,植物抗逆性的测定(电导仪法),2007 4 李忠光,龚明,愈创木酚法测定植物过氧化物酶活性的改进,2005 5 李新国,张建霞,孙中海,植物抗寒基因工程研究进展综述,2004 6 齐付国,王红亮,柳兴丞,低温胁迫下MeJA对小麦幼苗内源激素含量的影响 7、8 郝再彬,苍晶,徐仲,植物生理学实验,2004.11(1):115-116,101-104
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