食品生物化学实验指导

08食品科学食品生物化学实验要求1. 学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不许进入实验室。每大组实验人数20-24人，4人一小组。2. 实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。具体过程如下：（1）每大组只配制自己大组所用试剂，不得多配、浪费；（2）每小组派一人，一大组共选出5-6人来共同完成试剂配制工作。其他学生在自己组的台面准备其他试验工作，如领用器皿，滴定管的与准备等工作；（3）各小组成员轮换派人配制试剂，即做一次实验换一次人，保证每个学生都经历了配制试剂的过程。（4）学生在试剂配制过程中，掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。3. 实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作，如有损坏，照价赔偿。4. 卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。08食品科学食品生物化学实验项目表1.淀粉的显色和水解（3学时）2.双缩脲法测定蛋白质含量（3学时）3.牛奶中酪蛋白等电点测定（3学时）4.酶的性质实验（4学时）5.氨基酸的分离鉴定（3学时）6.或蛋白质的颜色反应（3学时）实验总课时：16学时实验一 淀粉的显色和水解一、实验目的和要求1、进一步了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。2、如何验证淀粉是否水解及其水解的条件和产物。二、实验原理1、淀粉与碘的反应 直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200980或相对分子质量范围是32 000160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度2028，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。表 2-1淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色葡萄糖单位的聚合度3.87.412.918.320.229.334.7以上包合物的颜色无色淡红红棕红紫色蓝紫色蓝色淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。2、淀粉的水解 淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m(C6H10O5)nC12H22O11C6H12O6淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖 葡萄糖是淀粉最重要的下游产品之一，工业生产中常常使用玉米淀粉水解来加工结晶葡萄糖。三、试剂和器材1、器材：试管夹、量筒、烧杯各一只、白瓷板一块、试管一支、水浴锅。2、试剂：淀粉及0.1溶液 、10NaOH溶液、20H2SO4溶液、10Na2SO4溶液、稀碘液、乙醇、2%CuSO4溶液。四、操作步骤1、淀粉与碘的反应取少量淀粉于白瓷板空内，加碘液两滴，观察颜色。取试管一支，加入0.1的淀粉6ml，碘两滴，摇匀，观察颜色变化。另取试管两支，将此淀粉均分为三等份并编号做如下实验：1号管在酒精灯上加热，观察颜色变化。然后冷却，又观察颜色变化。2号管加入10NaOH溶液几滴，观察颜色变化3号管加入乙醇几滴，观察颜色变化。记载上述实验过程和结果，并解释现象。2、淀粉水解实验设计设计实验方案，试验淀粉能不能水解，水解的条件和产物是什么？怎样判断淀粉是否水解了？(1) 在试管1中加入0.5g淀粉和4ml水，在试管2中加入0.5g淀粉和4ml 20%的硫酸溶液。分别加热试管34min。 (2) 把试管2中的一部分溶液倒入试管3中，留作下一步实验用。 (3) 向试管1和试管2中加入几滴碘溶液，观察现象。发现试管1的溶液呈蓝色（淀粉遇碘变成蓝色），试管2无明显现象。不同现象的原因是：淀粉在酸性条件并加热的条件下发生了水解反应。 (4) 向试管3中滴入10%的碱液，中和溶液中的硫酸，把溶液调呈弱碱性，使溶液的PH值约为910。 (5) 另取一只试管4加入3ml氢氧化钠溶液，并向其中滴入4滴2%的硫酸铜溶液，立即有蓝色的氢氧红铜沉淀生成。再取试管3中的水解液1ml滴入，振荡混合均匀后，用酒精灯加热煮沸，溶液颜色常有蓝色黄色绿色（黄蓝两色混合）红色等一系列变化。最终有红色沉淀生成。原因是氢氧化铜被还原生成红色难溶于水的氧化亚铜。实验结论：淀粉在酸的催化作用下，能发生水解；淀粉的水解过程：先生成分子量较小的糊精（淀粉不完全水解的产物），糊精继续水解生成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖。注意事项：淀粉水解的中间产物糊精（有分子量较大的红糊精和分子量较小的白糊精），对碘反应的颜色变化是：紫色棕色黄色，若淀粉水解不彻底，也会有不同的颜色出现。问题思考：1、试管1为什么变成了蓝色？试管2为什么无明显现象？为什么？（试管1中的淀粉未水解，淀粉遇碘变成蓝色；试管2中淀粉在酸的催化作用下水解了，所以无明显现象；不同现象的原因是：淀粉在酸性条件并加热的条件下发生了水解反应。） 2、如何验证淀粉没有还原性？（提示：不能发生银镜反应或者不能还原氢氧化铜） 3、实验延伸设计：如何验证唾液酶对淀粉水解的催化作用？（注意事项：用唾液作催化剂水解淀粉时，温度不得超过45摄氏度，因为温度过高，唾液酶易失去活性，最适宜的温度是3740摄氏度。）实验二：双缩脲法测定蛋白质含量一 实验原理:凡具有两个以上肽键（-CO-NH-）的物质，在碱性溶液中与硫酸铜作用，形成紫红色的络合物，此紫红色化合物在540nm处有最大吸收峰，这个反应称双缩脲反应。蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连接起来的，因而一切蛋白质均可与双缩脲试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与同样操作的已知浓度蛋白质溶液相比较可求得其含量。双缩脲试剂也可与CSNH2, C(NH)NH2或CH2NH2等基团反应。但在生物体内除蛋白质外不存在其它能与此试剂显色的物质。本法的测定蛋白质浓度的范围是0.510mg/ml，最好在15mg/ml范围。本法操作简单、显色稳定，对大部分蛋白质显色程度相同，特别是各种血清蛋白显色程度一致。在2040范围内，反应后30分钟的显色程度基本相同，从30分钟到4小时颜色深度不变。如室温过低，可置37水浴中20分钟后测定光密度。铵盐对测定有干扰，硫酸铵盐析的蛋白质粗品必须先行脱盐。含血脂多的血清，可用乙醚抽提一次后再行测定。二、实验材料：1.标准蛋白溶液：紫外分光光度法对大多数蛋白质的显色程度一致，故仅需用一种标准蛋白，常用牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白。准确称取干燥之BSA 100mg，用生理盐水溶解定容至10ml，其蛋白浓度为10mg/ml。2.双缩脲试剂：取硫酸铜1.5g，酒石酸钾钠6g，分放两烧杯中，各加水200ml，使之溶解后，将两溶液全部转移至1000ml容量瓶中。混合后加入10% NaOH 300ml，定容至刻度，混匀。置于暗处保存，有红色沉淀时不能用。三、操作步骤：1 标准曲线的制备： 取7个试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液。 试管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液（10mg/ml） 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 生理盐水（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 双缩脲试剂(ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白浓度(mg/ml） 0 0.001 0.003 0.005 0.007 0.009 混匀后，于37水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各标准管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2 样品测定取待测蛋白样品0.1ml，加生理盐水 0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于37水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。 标准蛋白光密度值蛋白质含量(g%)= 标准蛋白浓度 样品光密度值实验三 牛奶中酪蛋白等电点测定一、实验目的和要求1、初步学会测定蛋白质等电点的基本方法。2、了解蛋白质的两性解离性质。二、实验原理蛋白质分子中有一定数量的自由氨基和自由羧基存在(以及一些其他酸性和碱性基团)，是两性电解质。作为带电颗粒它可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子(zwitterion,净电荷为O)，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(isoelectric point,简写pI)。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。不同蛋白质，等电点不同。在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。因此，可以借助在不同pH溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。通过本实验可以测定酪蛋白的等电点，为提取酪蛋白打下基础。三、试剂和器材1.器材：试管及试管架；吸管与滴管；100mL容量瓶和25mL锥形瓶；水浴锅和温度计。2.试剂：(1)1.00mol/L醋酸；(2)0.1mol/L醋酸；(3)1mol/L醋酸；(4)蒸馏水；(5)牛奶四、操作步骤1、取五支同种规格的试管，编号，按表41顺序精确加入各种试剂，然后逐一振荡试管，并使试管混合均匀。表41 蛋白质的等电点测定表试管号蒸馏水1.00mol/L醋酸/mL1.00mol/L醋酸/mL1.00mol/L醋酸/mL牛奶/mL溶液pH浑浊度18.40.61.05.928.70.31.05.338.01.01.04.749.01.04.157.41.61.03.52、将上述试管静置于试管架上约15分钟后，仔细观察，比较各管的浑浊度，将观察的结果记载于表内，并指出酪蛋白的等电点。注：本实验各种试剂的浓度及用量均要求很准确。 浑浊度可用、等符号表示。五、思考题：什么叫等电点？在等电点时，蛋白质为什么容易被沉淀析出？实验四 酶的性质实验一、实验目的和要求1加深对酶的性质的认识2学会观察酶的专一性以及温度、酸度（PH）等因素对酶活性的重要影响。二、实验原理酶具有高度的专一性。淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。可用班氏（Benedict）试剂检查糖的还原性。酶的活性受温度的影响，在最适温度下，酶的催化反应速度最高，大多数动物酶的最适温度在37-40，植物酶的最适温度为50-60。偏离此最适环境时，酶的活性减弱。酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH为6.8。三、试剂和器材：1试剂（1）2%蔗糖溶液（至少要分析纯）。（2）溶于0.3%氯化钠的1%淀粉溶液（需新鲜配制）。（3）稀释200倍数的新鲜唾液。（4）蔗糖酶溶液：将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2-3次（离心法），然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100g置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨，提取约1小时，再加蒸馏水，使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。（5）班氏（Benedict）试剂：无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中，冷却后稀释至150ml，取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600ml水共热，溶解后冷却并加水至850ml。再将冷却的150ml硫酸铜溶液注入。本试剂可长久保存。（6）0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液（需新鲜配制）（7）碘化钾-碘溶液：将碘化钾20g及碘10g溶于100ml水中。使用前稀释10倍。（8）新配制的溶于0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液（9）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（10）0.1mol/L柠檬酸溶液（11）pH试纸：pH=5、pH=5.8、pH=6.8、 pH=82器材恒温水浴、试管及试管架、锥形瓶、吸管、滴管、白瓷板等四、操作步骤：1酶的专一性（1）淀粉酶的专一性按下表操作：管号1234561%淀粉溶液(滴)2%蔗糖溶液（滴）稀释唾液(ml)煮沸过的稀释唾液(ml)蒸馏水(ml)4-1-4-14-1-41-4-1-4-1-37恒温水浴15分钟Benedict试剂(ml)111111沸水浴23分钟现象2温度对酶活力的影响淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈色。在不同的温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由其遇碘呈现的颜色来判断。取3支试管，编号后按下表加入试剂：管号123淀粉溶液(ml)稀释唾液(ml)煮沸过的稀释唾液(ml)1.51-1.51-1.5-1摇匀后，将1号、3号两试管放入37水浴中，2号试管放入冰水中。10分钟后取出，（将2号管内液体分为两半），用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37水浴中继续保温10分钟后，再用碘液试验，判断结果。3pH对酶活力的影响取4个标有号码的50ml锥形瓶。用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0-8.0的四种缓冲液。锥形瓶 号0.2mol/L磷酸氢二钠（ml）0.1mol/L柠檬酸（ml）pH12345.156.057.729.724.853.952.280.285.05.86.88.0从4个锥形瓶中各取缓冲液3ml，分别注入4支编好号的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2ml和稀释200倍的唾液2ml。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管内容物混匀，并依次置于37恒温水浴中保温。在第4管中加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第4管取出1滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为桔黄色时，向所有试管依次添加1-2滴碘化钾-碘溶液。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔，从第一管起，亦均为1分钟。观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。五、思考题1试解释酶为什么具有很高的催化效率？2什么是酶的专一性？试从你所做实验及其结果解释酶具有这种性质。实验五：氨基酸的分离鉴定纸层析法一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到容剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、器材1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸(新华一号)四、试剂1、扩展剂 650mL是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20 mL正丁醇和5 mL冰醋酸放人分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。2、氨基酸溶液 05的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为05)。各5mL 3、显色剂 50lOOmL01水合茚三酮正丁醇溶液。五、操作1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2、取层析滤纸(长22 cm、宽14 cm)一张。在纸的一端距边缘23 cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。3、点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm。4、扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。待溶剂上升1520 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。5、显色 用喷雾器均匀喷上0。1茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100)或用热风吹干即可显出各层析斑点。6、计算各种氨基酸的Rf值。思 考题1、何谓纸层析法?2、何谓及f值?影响只f值的主要因素是什么?3、怎样制备扩展剂?4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么?实验六 蛋白质的颜色反应一、实验目的和要求1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。2、学习和了解一些鉴定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。二、实验原理1、双缩脲反应 当尿素加热到180左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。2、茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及-氨基酸（除脯氨酸和羟脯氨酸）所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定。三、试剂和器材1、试剂 鸡蛋清尿素10NaOH溶液1硫酸铜溶液0.1茚三酮-乙醇溶液2、仪器 试管及试管夹、酒精灯四、操作步骤1、双缩脲反应取一支干燥试管，加入少量尿素，用微火加热使之熔化，待熔化的尿素开始变硬时停止加热。此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）。待试管冷却，加入约1mL10NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。另取1支试管，加入稀释过的蛋清溶液2滴，再加入5滴10NaOH溶液摇匀，然后再加入1滴1的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。注意事项：加入的硫酸铜不可过量，否则会产生蓝色的氢氧化铜，从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。2、茚三酮反应取1支试管，加入稀释的蛋清溶液4滴，0.1茚三酮-乙醇溶液2滴，混匀后在小火上加热煮沸12min，放置冷却，观察颜色变化。另取2支试管，用0.5的酪蛋白和0.5的甘氨酸溶液代表蛋白溶液，进行茚三酮反应，观察颜色变化。五、思考题通过实验谈一谈你对蛋白质的颜色反应有何认识。