几种浮游植物检测方法研究（可编辑）

几种浮游植物检测方法研究 分类号 密级 UDC 编号 厦 门 大 学 博士后研究工作报告 几种浮游植物检测方法的研究 StudiesonDetection ofseveral Approaches phytoplanktons 孟海军 201 报告提交日期 1年2月 厦门大学 2011年2月 题名页 几种浮游植物检测方法的研究 on StudiesDetection ofseveral Approaches phytoplanktons 博士后姓名 孟海军 流动站 一级学科 名称环境科学与工程 专业 二级学科 名称环境科学 研究工作起始时间2006年8月01日 研究工作期满时间2010年11月 厦门大学 201 1年2月 厦门大学博士后研究工作报告著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用博士后研究工作报告的规 定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交该报告的 纸质版和电子版，有权将该报告用于非赢利目的的少量复制并允许该 报告进入学校图书馆被查阅，有权将该报告的内容编入有关数据库进 行检索，有权将博士后研究工作报告的标题和摘要汇编出版。保密的 博士后研究工作报告在解密后适用本规定。 本研究报告属于： l、保密 ，2、不保密 兮7 纸本在年解密后适用本授权书； 电子版在年解密后适用本授权书。 请在以上相应括号内打“4” 作者签名；刍沏晕 日期乙I&1月。日 I土f 日期：碡胡甲 目录 第一章前言1 11常规的赤潮生物检测技术2 111 光学显微镜和电子显微镜检测技术2 112流式细胞技检测技术 FCM 3 113基于色素的检测技术3 12分子水平的检测技术4 121 基于rDNA的分子检测技术5 1211寡核苷酸探针杂交技术7 荧光原位杂交技术7 三明治杂交技术8 1212其他的DNA标记技术9 122基于蛋白质的免疫荧光检测技术11 123 I ectin探针12 13自动化的赤潮藻检测技术13 第二章三种藻的SEM观察结果15 21材料与方法15 211 样品采集、固定、观察及培养15 212样品处理程序16 2121玻片处理16 2122样品脱水处理16 213电镜观察方法17 22结果与讨论17 221 纤小裸甲藻固定方法的比较17 224纤小裸甲藻的形态和体表线纹观察结果18 225两种青绿藻的形态观察结果21 第三章SSR与PCNA标记的开发23 31材料和方法23 311材料23 312 PC的配置23 313 MISA aicroSAte|lite tooIs 使用环境的建立及使用23 3141 ActiveperI引擎的建立23 PerI 3142 SCFipt50的安装及使用23 314 Spurnik的使用方法25 315序列比对和拼接工具26 316引物和探针设计26 318 PCR扩增反应体系：26 32结果与讨论27 321PCNA标记的开发27 3211 PCNA标记开发的原理27 3212PCNA标记开发的过程29 322SSR标记的开发与应用34 3221序列的获取与预处理34 3222不同软件效率的比较35 3223 SSR的出现频率，35 3224各类SSR的分布规律36 33讨论37 Il 参考文献39 致谢47 附录柏 III 第一章 前言 赤潮 RedTide ，从广义上讲，指的是在某种海域环境条件下，一些单细 胞浮游生物爆发性繁殖，引起水色异常的生态现象。它不一定有毒或有害。日常 生活中，狭义上的赤潮主要指的是对环境有毒或有害的一种浮游生物爆发性繁殖 Bloom， 的生态现象。这种赤潮有一个准确的名称叫做有害藻水华 Harmful Algal HAB 。在特定的条件下，几乎所有藻都能发生藻华，大多数藻华都是无毒或无 害的。但有些种类藻华能产生毒素，危害附近生活的其他生物，甚至通过食物链 威胁到人类和更多的其他生物。还有一些虽然不产生毒素，但是其生物量累积到 一定程度时，能对环境起到极大的危害作用。例如太湖近年频频发生的蓝藻藻华， 蓝藻无毒，蓝藻藻华能污染水源，降低水中含氧量，是鱼类死亡。这两种藻华统 称为有害藻水华 赤潮 。 有很多种因素能导致赤潮的发生，具体的机制尚未研究清楚。近年来随着环 境污染日益加重，大量营养盐流入大海，导致近海富营养化同益明显，赤潮的爆 发的频率的规模呈现急剧扩大的趋势。同时人类对环境监测重视程度的提高，有 关赤潮爆发的报道越来越频繁，赤潮这种海洋生念现象越来越为公众所熟知。我 国近海是赤潮的高发地，近年来赤潮发生的次数和规模也呈现增长趋势，给海水 养殖业、海洋环境乃至人们的健康与安全带来了极大的威胁 易晓蕾，2003，周 名江等，2001，2003 。 为了减少赤潮带来的危害，人们开发了许多技术来监测赤潮，希望能尽快的 了解发生藻华的藻的种类，以判明该藻华是否有害。赤潮生物检测技术的研究也 etaL，1998；Mudie 就成为赤潮监测的重要内容 Kim etaL，2002 。早期的检测 技术主要是基于形态和结构分类学开发的技术，如显微镜和电子显微镜检测等。 由于赤潮生物形态的相似性和复杂性，这些技术在实际应用中存在困难，无法准 确的检测。例如一些形态学上非常相近的种类和变种或形态学相似的但生理功能 不同的种类，这些利用光学显微镜就很难分辨出来。随着科技的快速发展，赤潮 生物检测技术也出现了巨大的进步，例如随着分子生物学的发展，人们开发了分 子检测技术。分子检测技术和自动化技术的结合，又出现了自动化检测技术。 11常规的赤潮生物检测技术 目标藻种类的鉴定和生物量的确定赤潮藻检测的两大基本任务。种类的鉴定 是定性检测，能提供赤潮藻危害的性质。而生物密度和生物量是赤潮发生和生长 的重要指标，它是赤潮发生、发展、消亡以及赤潮规模最直接的证据，同时也是 衡量细胞生长和生理活性的重要指标。相关的目前，我国基本上是采用显微镜检 测的方法来检测藻，辅以细胞计数方法来监测赤潮生物密度和生物量，从而对目 标藻进行定性和定量的分析。近年来开发的一些分子检测技术中，分子技术也只 能进行定性检测，定量通常还是采用细胞计数的方法。经典的细胞计数方法如显 微镜计数比较耗时费力，于是开发了基于分光光度法的技术方法，例如胡先文 2001 曾将这种方法用于鱼腥藻水华的细胞密度检测。其他类似的细胞计数方 et a1，1998 法也有一些，如库尔特计数、FlowCAM计数和流式细胞计数 Sieracki 等方法，这些技术中，流式细胞计数相对常见。 色素技术也常在赤潮监测中。例如选用简单、快速的叶绿素a来表征浮游植 et a1，1978 ，同时借助吸收光谱的差异还可以区分不 物的碳生物量 Sieburth et 同的浮游植物类群 KoehneaL，1999 。现场荧光检测可以用于现场的连续快 速测定。然而，此方法受赤潮藻类光合色素组成变化的影响，只能把浮游植物分 为几个大类群，进行初步定性，藻的准确检测还需其他的技术。 111光学显微镜和电子显微镜检测技术 光学显微镜检测是最传统的赤潮生物样品检测分析方法。这种检测技术是一 种基于藻的形态学特征，鉴定藻的种类的一种方法。它辅以细胞计数板进行密度 etaL，1 计数，它在藻的鉴定及定量方面一直发挥着重要的作用 Hallegraeff995 ， 直到现在它还在广泛应用，通常人们把它当作验证其他新型赤潮生物检测手段准 确性的基本方法和技术保证。然而，显微镜检测技术要求检测人员有丰富的藻类 分类学知识，要求很高，同时费时费力，速度缓慢。而且显微镜观察不能区分赤 潮生物中形态相似的种类以及有毒和无毒的种类，也难以辨别不同生理状态的赤 潮细胞如死细胞和活细胞等。因此慢慢的被新技术所替代。 2 etal，1 etal，1 潮藻的研究和鉴定方面 Berdach977；Pichett-Heaps980 。电 镜的分辨率藻远大于光学显微镜，在一些藻的鉴定方面有着不可替代的作用，然 而电镜样品需要复杂的预处理过程，比较耗时。而且处理过程中样品大量损失， 很难定量。这些缺点限制了其在现场赤潮生物样品检测中的实际应用。 112流式细胞技检测技术 FCM 流式细胞术是一种广泛应用的技术，海洋浮游植物的检测方面也有广泛的应 etaL，1991 o其工作原理是：将待测样品的 用 JonkeretaL，1995；Chisholm 细胞制备成单细胞悬液，利用细胞的自发荧光，或对细胞采用特异性荧光探针标 记后，在一定的流速和鞘液的约束下，使细胞液柱以单个排列的方式通过激光检 测器。细胞液柱与检测器中入射的激发光垂直相交，通过测量其散射光 含前相散 射光和侧相散射光 、细胞自发荧光、染料染色的荧光及探针标记的荧光 包括免 疫荧光探针、核酸和肽核酸探针等 ，从而将特征目标生物、和背景颗粒及噪音区 分开。流式细胞仪可测量待测目标的粒径、光学性质、内部结构、DNA、RNA、 蛋白质和抗原等，也能对其进行准确的分类和收集，以达到分选的目的 侯建军， 998 总结认为，藻细胞形态、大小以 2006 。流式细胞技术也有缺点。Fuchs 1 及生理生化特性会随环境条件改变而发生改变，这将影响流式细胞仪的检测基 础，并进而影响流式细胞术对靶生物细胞的正确区分和识别。流式细胞仪不能有 效地识别荧光标记信号过弱的目标细胞，存在漏计的可能。此外过高仪器成本和 et 工作成本工作条也是个大缺点 ChenaL，2003 。这些情况限制了流式细胞技 术在赤潮监测中的广泛应用。 113基于色素的检测技术 浮游生物种类繁多，生化和代谢途径差异很大，其中一些产物可用来作为生 化标记物，用于分类学。其中光合色素因其特异性和检测的便利性而最为理想 etaL，1 Jeffrey 997 。光合色素根据化学结构可以分为三大类：叶绿素类、类胡 3 萝卜素类、藻胆蛋白类。每类中又有诸多分类，例如参与光合反应过程的叶绿素 et 有三十种；而浮游生物中各种类胡萝卜素超过600种 LiaaenJensena， 1985 。不同浮游植物含有光合色素种类有巨大差别，不同光合色素含量也不尽 相同。这样浮游植物的光合色素组成和某些光合色素比值都可以作为很好的化学 分类学指标，用来表征具有海洋学和分类学意义的浮游藻类群落组成和生物量。 这些数据可以用HPLC技术快速方便的检测。现在，HPLC进行一次运行便可以 eta1，1 分离出50余种光合色素及其衍生物 Hodgson997 。这种技术在赤潮的 etaL，1991；ChoetaL，1999，2001； 检测方面也有诸多应用实例 Hallegraeff Latasaet et aL，2004；Takishita aL，2004 。 基于HPLC的光合色素分析技术，能够有效地进行大量的现场样品分析，即 使在样品处理中存在着过滤产生的损失或处理过程中导致的样品破坏等问题，从 HPLC光合色素产生信号峰的差异仍然能辨析出其种类组成。这种分类手段能在 藻纲一级的分类水平进行较好的分类。某些形态上相似的种类，可能在光合色素 et 等生物标志物上存在差异，从而可以进行有效地鉴定 Wrightal。，1996 。 应用光合色素作检测赤潮，最大的缺点是分辨率较低，它能在藻纲一级的分 类水平进行较好的分类，尚不能完全实现属和种之间的准确分类。此外，环境及 细胞生长状态，对结果也有影响。这需要进行较多的校J下工作才能确保分类结果 的准确性和可靠性。 12分子水平的检测技术 分子检测技术指的是基于DNA、蛋白质的一种检测技术。它的原理是不同物 种，甚至不同个体在基因组大小、DNA的碱基组成、蛋白质种类方面都存在差 别。而这些能较容易的被识别出来，而且较形念学特征提供的信息更多，能解决 et et af，2005；Gontcharova，2005；Kawai 很多传统的形态分类学的难题 Chan ef aL，2005 。DNA的碱基组成，也就是基因组的一级结构是最基本的分类基础。 基因组的一级结构上的相似性也就成了分类学最常用的指标了。一般认为当 on Reconciliationof toBacterial Approach Systematics 就可认为属于同一种基因 4 型。但是，这样全面的DNA组成信息很难获得和阐释，通常是不切实际的。近 年来，分子技术一般是通过比较分析基因组中单个基因的序列来推断微型生物之 间的进化关系。对海洋微型浮游生物群落进行分子进化研究常用的基因序列包括 核糖体rRNA基因序列和一些功能基因序列，也有使用一些不依赖rDNA的分子 标记技术。 121基于rDNA的分子检测技术 核糖体rDNA基因序列按其分子量来分，分为三个亚基：真核生物有 在基因组中基因成簇排列在一起组成一个转录单位。其中18S16S称为小亚基 small subunit，LSU 。这两 subunit，SSU ，23S28S称为大亚基 1arge 个亚基在分子鉴定中使用最广。其他如5S和转录单元内间隔区 ITS区Internal Transcribed rRNA基因和58SrRNA基因之间的区域ITS2和 Spacer，即SSU 58S rRNA基因和LSUrRNA基因之间的区域ITS2 也有人使用 OIsenetaL。 1986，VolkeretaL，1983 。 rRNA作为分子鉴定基础，是因为它有以下特点 1 rRNA作为蛋白合成机 器的关键元件，在所有生物中存在，具有功能和进化上的同源性，它的分子极端 保守，核苷酸序列也相对保守。例如，SSUrRNA基因中存在保守区和高变区， 这两个区域进化速率不同，使得他们在不同物种中，有的表现保守，有的表现不 保守。保守区是指在亲缘关系较远的生物类群 如动植物 之间比较，其大分子 rRNA基因某一段序列中发生的核苷酸变异较少 例如序列相似性在90以 上 。此区域反映了生物在进化上的同源性，主要用于亲缘关系较远的物种问系 et 统进化关系分析的依据 Lenaersa1，1 989 。这个特点非常实用。人们利用SSU rRNA两端的较为保守的核苷酸序列，设计和应用通用的引物来扩增微型生物群 落中生物的SSU et rRNA分子 Stocka1，1992 。而高变区恰恰相反，即使在 亲缘关系十分接近的物种间比较，这些区域也存在核苷酸差异，而且，这些差异 会随着比较物种的亲缘关系的疏远而迅速扩大，并伴随着核苷酸的插入或缺失。 这个特点可以用来鉴定或区分不同种属，甚至不同株系的生物。LSUrRNA也有 类似特点，它有12个高变区和相应的保守区，使得通过保守引物来扩增LSU 5 et rRNA成为可能 Michot 从各种生物中获得，这样使用保守的引物，就能分离微型生物群落中几乎所有的 微型生物。 3 rRNA基因不能在同代生物之间的转移，因此rRNA之间的关系 反映了生物之间的进化关系，rRNA可以提供充分的序列信息来进行统计分析。 现在，人们已经建立了多个rRNA序列数据库和系统进化树，使得快速鉴定成为 et et 986 。 可能 Ludwiga1，2004；Olsena1，1 由于如前所述的rRNA特质，人们通常分离出与之互补的基因组序7UrDNA， 设计特异的寡核苷酸探针，就可以用于赤潮藻的分子鉴定。国际上通常采用ITS 区作为各种生物类群属种间分类和系统研究的区域，也是设计探针的首选区域 etaL，1994；Andersoneta1，1 8S、28S Adachi 999 。1 rDNA，其结构具有 保守区与高变区镶嵌的特点，在研究生物不同类群时，也可采用不同的区域来作 et 为分析比较的区域，是分类学和系统发生方面广泛使用的分子依据 Friedrich a，1997；Adachi etaL，1997；AndersonetaL，1999； etaL，1994；Cangelosi RubleeetaL，1999 。 寡核苷酸探针通常长约1624bp，由于每个碱基对有四种可能 A、T、G、 C ，所以一段16至24个碱基的寡核苷酸有42949672961XXXXXXXXXX76种 般的浮游生物基因组都大。也就是说，是特异性的序列。找到这么一段序列，合 成互补的寡核苷酸探针，通过分子杂交就能特异性识别目的生物。 寡核苷酸探针根据其分子主链骨架的成分可以分为两种，一种是有核苷酸或 脱氧核苷酸构成的DNA或RNA寡核苷酸探针。还有一类是基于肽核酸 peptide nucleic efa，1993；Nielsen 性结合形成杂交分子PNNDNA或PNARNA，这种杂交结合力及特异性比相应的 et DNA与DNA结合要高 KimaL，1993 ，不易被酶降解，表现较DNA探针稳定 Francois 性更高，是非常有前景的探针工具 KimetaL，1993；WagneretaL，2003 。 6 1211寡核苷酸探针杂交技术 寡核苷酸探针在藻类检测上应用很广，发展出了多种检测体系。除了最新的 全自动检测仪一ESP 环境样品处理器 常用的有以下两种： 荧光原位杂交技术 insitu 荧光原位杂交 fluorescence 交方法，它采用荧光标记的探针在细胞内与特异性互补的核酸序列杂交，在保持 细胞形态完整的状态下，通过光学显微镜检测细胞内的目的位点。它具有以下优 点：荧光试剂和探针经济、安全，实验周期短、特异性好、定位准确；能方便的 进行光学和荧光检测；多色FISH通过在同一个细胞中显示不同的颜色，可同时检 et 测多个目标。因此它在赤潮检测和赤潮生态学等领域得到广泛的应用。 Groben et aL，2005；Kim a1，2005；王爱杰等，2004 。 FISH在藻类检测上有大量的成功实例。例如，美国Scholin应用这项技术取 得了一系列的成功。1996，Scholin等以大片段rRNA LSUrRNA 作为目标序列设 计寡核苷酸探针对硅藻类的拟菱形藻 Pseudo-nitzschia 进行了鉴定。之后， 应用该技术在Louisiana沿岸，AtlanticCanadian沿岸，NewZealand海域， Dutch Parsonset et a1，1999；1999；Rhodesa1，1998 。在厦门海域，链状 和A um如海洋原甲藻 Pmicans ， pseudo-gonyaulax以及其他三种非Alexandri Amphidiniumcarterae和Heterocapsa分离开来 侯建军等，2006 。 7 三明治杂交技术 三明治杂交 Sandwich hybridisatinassay 技术是一种基于DNA杂交的一 种技术。它需要将细胞裂解，释放出细胞内容物，先后与两种探针杂交来完成 杂交过程。其中一个探针叫捕获探针“captureprobe”，它带有一个生物素基团， 通过链霉和素固定在玻片等固相支持物上，从而结合并固定细胞裂解物中的目 的rRNA分子。然后加入含有含有荧光标记的信号探针，从而形成三明治式杂交 复合物。这种复合物在通过辣根过氧化物酶检测系统，形成蓝色的有色的产物， 有色的产物的浓度与目的分子数有一定的相关性，通过分光光度计可以检测出目 的分子数目。 Scholin etal，2001 etaL，1996，1997，1999；Tyrrell 以三明治杂交技术为基础，人们开发了以96孔平板或寡核苷酸基因玻璃芯 片 Chips 为特征的自动化检测技术。并成功的用于PseudoNitzschia、 et Heterosigma等赤潮藻的检测工作中Scholinetal，1996，1997，1999：Tyrrell a1，2001，2002 。这种方法快速、简便，并能实现高通量和自动化，不受检 测环境的影响，对不同细胞周期的藻类甚至藻类的孢子也能直接进行检钡lJ Bolch， 2001 ，是最具有发展前景的技术之一。但是这种方法在检测时，无法同时提供 传统的形态学特征，可靠性较FISH低。 8 of in Detection Sample TargetSpecies Homogenates 三明治杂交检测技术的原理图 Adersonpresentation，2006 The ofsandwich principle hybridizationassay 1212其他的DNA标记技术 RFLP RestrictionFragmentLengthPolymorphism 限制性片段长度多态 ified 性，AFLP AmplFragmentLengthPolymorphism 扩增的限制性片长度多 ite 态性段、微卫星DNA MicmsatellDNA ，等分子标记技术在藻类的鉴定上也 有广泛的应用。Kamikawa等 2008 用线粒体分子标记能够有效区分A pseudogonyaulax等6种亚历山大藻。 SSR是近年来发展较快、应用较广的一项分子遗传标记技术。SSR，又可叫 对长的单元组成 Vogt，1990 。在原核生物和真核生物，甚至在最小的细菌基 因组中都曾发现过。在真核生物基因组中，它的含量非常丰富，是基因组的主要 组分之一。 et SSRs在遗传上不太稳定 Totha1。2000 。人们建立了两种模型被用来解释 SSRs的产生及其不稳定性。第一种被称作DNA聚合酶滑动理论。这种理论认为 O 解离会导致碱基错配，从而产生重复，人们形象的称之 andSutherland1994 。在DNA的“滑动之后，如果 为“滑动 Richards and 有“发卡，三链等结构产生，或发生了DNA重排就会固定下来 Peamon Sinden，1998；Sinden，1999 。目前有部分试验结果支持这一模型，然而也有结 andWells 1999 。另 果显示同源重组会使SSRs遗传稳定性变差 Jakupciak 一种理论则认为DNA复制时，微卫星位点易于发生错配，使同源的位点问发生 Gutman1 and 不对称交换，而发生变异 Levinson 987 。 SSRs在基因组上分布非常广泛。依目前的试验结果来看，无论是蛋白质编 码区还是非编码区都有相当数目的SSRs，但在真核生物中外显子中的SSRs数 et 目却少于非编码区域的SSRs Totha1，2000 。如线虫基因组中外显子中的 SSRs数目只占所有SSRs的25。在双壳类生物的基因组中，外显子每Mb碱 基对中有85个微卫星位点，而内含子每Mb碱基对中有245个 Cruzeta1。2005 。 et 不同物种也表现出对SSRs种类的偏好 TautZa1。1994 。有人曾做过比较，在 人，果蝇，拟南芥，线虫和酵母五种生物中，单核苷酸重复分别为每Mb碱基对 et 55，35，40个位点。微卫星的总体含量和物种基因组的大小也密切相关 Katti o a1，2001 十多年前人们就已经发现，广泛存在于真核基因组的SSRs有着高度的多态 et 性 Fischera1，2000 ，SSR标记得以广泛应用基因定位，遗传图谱，遗传 鉴定，物种进化演化分析等诸多领域。在柑橘中，SSR标记已用于构建遗传连 锁图谱，有性繁殖种苗或体细胞杂种鉴定，资源评价，遗传变异分析，物种进化 et et et a1，：CorazzaNunes a1，2003 。 演化分析 2003；Ruiz a1，2002；Pang et eta1，2005 。 各物种开发的SSR标记更是以万计 Matsuokaa1，2002；Cheng et 尽管目前己开发了大量的SSR，但仍未完全满足需求 Hea1。2003 。 长期以来，SSR在高等生物中应用非常广泛，在藻类中的应用相对迟缓。由 于微卫星的多态性以及灵敏度大大超过了rDNA序列或RFLP等以DNA为基础的分 子标记。因此，微卫星标记技术已引起赤潮界的高度关注。Rynearson等 2000 对同一海域不同地点采集的4组硅藻样品进行了区域群体的微卫星分析。Evan等 10 2004 对尖刺拟菱形藻 Pseuddonitzschia laantique的研究。王东东等 2007 将微卫星标记应用于针胞藻纲Chattonel 2008 用微卫星标记技术，对3种7株亚历山大藻进行遗传分析。 此外AP-PCR arbitraryprimed amplified PCR 、DNA DNA amplifying ribosomalDNArestriction amplified analysis，ARDRA 、变性梯度凝胶电泳 denatunnggradientgel Bruinet et 物进行生态学及分类学等研究 de aL，2003；QinaL，2004； Grobenet et aL，2005；Not aL，2007 。Judge等 1993 用RFLP分析了全球 大藻开发了分子标记。Penna等 2000 采用PCR和固相免疫测定法，通过对 ITS和58SrDNA区的序列分析，鉴定了人工培养和海水样品中不同种类的亚历 toxicus的18SrDNA与其它 山大藻。Sako等 1996 对，将甲藻Gambierdiscus 细胞杂交技术和三明治杂交对Pseudo-nitzschiaaustralis进行了鉴定。Bornet 等 2005 采用特异性的分子标记技术ISSR intersimplesequencerepeat 扩增和 基于RAPD技术的SCAR标记区域分析，分类、鉴定了两种来自法国海域的有 毒赤潮种类，包括硅藻中拟菱形藻 Pseudo-nitzschia 状亚历山大藻 A 绿藻类的小球藻 Chlorella vulgaris 藻株之间的分类差异进行了比较。 等 2000 采用ARDRA结合传统方法研究了海洋蓝细菌的多样性及其类群组成， 菌和浮游植物的群落动态。 122基于蛋白质的免疫荧光检测技术 蛋白质电泳也是进行分子检测的一项基础工具。不同物种，株系蛋白质表达 存在差别，通过双向电泳，比较蛋白种类或表达的差异，就能鉴定不同的赤潮藻。 ll 这种技术在对于形态学上非常相近的种类或者变种，如塔玛亚历山大藻 Alexandrium 但生理功能不同的种类，如尖刺拟菱形藻 Pseudo-nitzschia pungens 存在的 产毒与不产毒的两个变种，的检测方面有独特的优势。Chan等 2004 采用双向 电泳图谱分析技术对本地和国外的赤潮原因种海洋原甲藻 Pmicans ，微小原甲 藻 Pminimum ， 斯氏藻 Scrippsiellatrochoidea ，KareniaIongicanalis，Kdigfata，米氏凯伦藻 Kmikimotol 以及短凯伦藻 K 者应归为同种藻。 抗原、抗体之间的高度特异性反应也能用于赤潮藻的分子检测。将抗体进行 直接或间接荧光标记就成为免疫荧光探针检测技术，由于特异性高广泛应用于赤 潮生物进行分类、识别等诸多领域 Vrieling etaL，1989， anophagefferens，凯伦藻和一些裸甲藻也有成功的报道 Anderson etaL，19961 et aL，1994，1995，1996； 1993；Vrielinge Vrielinge 123I ecti n探针 Lectin 细胞凝集素 是一类非酶泌性和非免疫源性的糖结合蛋白或糖蛋白， 有聚集细胞的活性，能非共价特异性地结合到细胞表面的单糖或寡糖等糖基上 et et et et aL，19801 aL，1983 WaiteaL，1995；Hori Goldstein Sengbusch a，1 996 。lectin具有结合糖基的特异性，因此也可作为细胞和细胞间或机体 etaL，1991o lectin普遍存在，藻类中也广泛地分布 间的识别分子 Chnspeels Hori et etaL，19881et 于，并有些已经分离出来了 Sharona1，1989；Hod et etaL，1993；Kima1，2006 。Lectin能特异性结合并 a，1990；Rogem 区分藻细胞表面存在的特征性糖基，因此也可以用于赤潮的分子鉴定。荧光标记 etaL，1993，1994， 如FITC lectin探针可区分海洋中不同的甲藻 Coatas 1995；Rhodes etaL，1995；Rodas 胞凝集素来区分形态学相似的米氏凯伦藻同本株、新西兰株和韩国株。细胞凝集 12 这些 分在 13自动化