罗氏实时荧光定量PCR仪课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实时荧光定量PCR仪,一、实时荧光定量PCR的原理,荧光定量,PCR,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。,荧光定量,PCR,仪,荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电,脑系统及相应的分析软件。,定量,PCR,技术的产生,1992,年由,Higuchi,等人第一次报告：使用,EB,内插染料法插至双链,DNA，,经改装的带有冷,CCD,的,PCR,仪检测样品的荧光强度,PCR,循环=双链,DNA=,染料=荧光,后来用与双链,DNA,有更强结合力的,SYBR Green I,取代,EB,荧光定量实时,PCR,与普通,PCR,的比较,实时在线监控,对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期,降低反应的非特异性,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了,PCR,反应的特异性,增加定量的精确性,全程监控，准确的算法进行定量,结果分析更加快捷方便，无需跑胶,罗氏产品介绍以及与同类产品之间的对比,一、,LC1.5,和,LC2.0,LightCycler,荧光定量,PCR,系统,LC1.5,LC2.0,Lightcycler 1.5 结构分析,以空气加热及冷却迅速改变温度,带有极高表面积/容量比例的密封20,l毛细管,加热线圈,可容纳32个样品的卡盘,将荧光仪定位的,分档器发动机,将样品置于,光学仪上的,分档器发动机,热室,风扇,滤器,免维护的,LED光,源,光学倍增管,Lightcycler 2.0 结构分析,空气加热系统,LED,激发光源,PMT,检测系统,光纤,热力学结构,特点：,1、空气加热,2、毛细管反应体系,优点:,1、升降温速度快（0.05 -20/秒），,2、体系均一，不存在边缘现象,3、把反应体系缩小到0-20ul，节省试剂成本,实现快速PCR,光学结构,特点：,1、免维护的LED冷光源，寿命长达2万小时以上,2、光学倍增管（,Rodenstock,）,3、多达6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）实时检,测,优点：,1、毛细管光学特性将光线散射、衍射降至最低，,避免LED 功率低的问题,2、免维护，带自动检验功能,3、轻易实现内标、内对照及多重PCR,LightCycler,结构分析,激发光源,Rodenstock-LED（发光二极管）,冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。,检测系统,光学倍增管 (PMT),灵敏度高，宽检验范围,背景低，无边缘效应,加热方式,空气加热,管间差小，热传导速率,20,/,秒，温控变化准确（,0.05-20,/,秒）。,反应体系,两种石英玻璃毛细管体系(20ul 和100ul),光学性好，反应体系小，节约试剂成本,适合多种用途。,检测光路范围,530nm,555nm,610nm,640nm,670nm,710nm.,六个波长，并解决相关荧光素荧光干扰问题,LightCycler 软件 4.0,更先进的自动定量方法,全新的相对定量软件,全自动熔点曲线分组,全自动熔点温度提示,简化数据和用户管理,PCR,领域最聪明的革新,LightCycler,荧光定量,PCR,系统,超高速,3,0,至,40,分钟完成,PCR,过程,实时在线监测 收集每一循环的数据并立即显示于联机电脑上,高灵敏 在一个基因组当量中可检测出单基因拷贝,范围广 可检测1,0,10,10,拷贝线性范围，无需稀释样品,开放性 全开放，成为国内外试剂厂家的首选开发平台,六个荧光通道 轻易实现内标、内对照或多重,PCR,最小化,定量反应体积降至1020,ul，,费用低廉,灵活性,支持水解探针、杂交探针及,SYBR Green I,闭管分析,消除污染风险,Lightcycler,的分析模式,适用于所有的通用探针及染料分析模式：,SYBR Green I（荧光染料）,TaqMan（水解探针）,Molecular beacon（分子信标）,Lightcycler上开发独有的分析模式：,Hybridization Probe Format,（杂交探针）,SimpleProbe（单探针）,SYBR-Green I 检测模式,SYBR Green,I能选择性地与双链DNA结合，在外界光源激发下产生强烈荧光。在PCR过程中，,SYBR Green,I可与新合成地双链DNA结合，产生地荧光信号强度与双链DNA含量成正比，荧光检测在每一循环的延期后进行。,SYBR Green,I与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合产生的干扰可通过融解曲线分析而得到解决。,水解探针（Taqman）检测模式,同时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条探针在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬灭分子吸收，因而检测不到荧光。在PCR延伸时，因Taq酶具有的5,，,3,，,核酸外切酶活性，可降解荧光探针，使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，在外界光源激发下即可发出荧光，荧光强度与PCR扩增产物量有关。,分子信标（Molecular Beacon Probe）,独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成，探针的5端标记荧光分子，3端 标记一个吸收或淬灭荧光的分子。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5端荧光分子与3端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。,杂交探针（HybProbe）检测模式,设计与检测区互补的分别带有不同染料标记的一对寡核苷酸（既杂交探针），在与扩增的DNA片断杂交时，两种染料互相接近。其中供体荧光染料受外来光源激发后，将能量传递给附近的受体染料，既发生荧光共振能量转移（FRET），从而释放出受体染料分子的发射波长荧光信号。荧光信号的强度和DNA的产量成正比。其他非特异性产物由于不会与探针杂交，因而不产生信号干扰。,Annealing,Elongation,End of Elongation,Denaturation,Fluorescein,LC Red,for sequence specific detection of DNA,杂交探针检测罗氏专利性技术,Template:Plasmid;Target:CycA;Detection Format:Hybridization Probes,Standard Calculated concentration,9.522E+9,1.024E+9,9.433E+7,1.127E+7,1.029E+6,9.902E+4,1.021E+4,9.217E+2,9.276E+1,1.085E+1,H,2,O,1.0E+10,1.0E+9,1.0E+8,1.0E+7,1.0E+6,1.0E+5,1.0E+4,1.0E+3,1.0E+2,1.0E+1,H,2,O,杂交探针的优点：,1.灵敏度高,2.宽动力学范围,3.特异性高,4.可用于突变分析,Monitoring of PCR with the LightCyclerUsing Hybridization Probes,专用于SNP基因分型和突变检测的,SimpleProbe,SimpleProbe作为一种独特的杂交探针只含有一条寡核苷酸探针，能够特异性的与目的基因上含有SNP位点的靶序列结合。探针与靶序列结合后，释放出能够被检测到的荧光信号，通过对熔点曲线分析中探针释放的荧光信号强度的分析，可以得到对目的基因的多态位点的准确分析结果。,Denaturation phase,:,SimpleProbe free in solution;emission of reporter dye is quenched,Annealing phase,:,Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to its complementary target,5,3-p,Q,R,3,5,primer,5,3-p,Q,R,New Probe Format:SimpleProbe Format,-高效低成本的新型探针,R=Reporter(Fluorescein),Q=Quencher,荧光定量PCR仪的部分应用,医学相关研究,疾病的临床早期诊断,病原体的含量检测,合理用药分子水平的疗效研究,疾病的发病监控研究,肿瘤相关基因肿瘤、耐药基因的检测,研究组织或培养细胞中,mRNA,的表达水平,各种处理对细胞,mRNA,含量变化的影响,比较染病组织与正常组织中各种,mRNA,含量差异,DNA,或,RNA,的转染量与实验结果关系的研究,基因分型及,SNP,分析,转基因动物及植物研究,重点问题说明,超高速的热循环,由于采用空气迅速改变温度，以及利用有高表面积/体积比的光学玻璃毛细管模式，,使升降温速度最高可达20,/秒，温控,0.2,，每2030分钟便能完成3040个循环。,升降温数率唯一可调,可以根据实验的需要调整升降温速率的系统0.0520,/秒，优化实验。,配套功能强大的分析软件：,（1）绝对定量（具“单点定标”功能）,（2）相对定量（可进行效率校正）,（3）自动基因分型（SNP）,（4）颜色干扰校正,独特的,熔点曲线分析功能,，可进一步作PCR后分析：,-检测非特异扩增并作矫正,-鉴别基因型而又无需采用测序凝胶,-检测点突变，并可利用双色检测及颜色补偿软,件在同 一反应中分析较复杂的突变,为什么使用DNase-Free&RNase-Free 的光学玻璃,毛细管?,玻璃反应管可,加快热传导速率,.,毛细管增加表面积/体积比，确保空气和反应成分之间的,温度迅速平衡，温度均一.,缩短了PCR反应时间，特别是荧光激发的时间，保证了,反应成分的稳定性，尤其是,荧光染料的稳定性,。,缩小反应体系，,降低检测成本,。,光学玻璃毛细管的材料适合荧光讯号的测定，类似光纤,的形状，保证荧光讯号的准确捕获。,没有边缘效应,.,LightCycler/毛细管/试剂的成本核算,仪器的维护费用,LightCycler是免维护的仪器,采用的光源是普通的发光二极管，寿命长达,20000,小时以上，非常稳定，,价格低廉,。而卤素灯光源，寿命20000小时,。,卤素灯。寿命短，需预热，寿命2000小时。,LED（发光二极管）,每一个孔位一个独立的激发光源和检测装置。,LightCycler光源无需定期更换，稳定方便，光路相同，样本误差最小，节约成本。,加热方式,空气加热，温控变化准确（0.4）,半导体加热制冷（温控0.5）,半导体加热制冷（温控0.5）,LightCycler变温速度快，温控精确。,升降温速度,热传导速率20/秒，（0.05-20/秒),热传导速率2.5/秒,热传导速率2.5/秒,LightCycler升降温速度快，并可调节,运行时间,3040分钟,23小时,1.52.5小时,LightCycler检测时间短，快速出结果，应用最灵活,单点定标功能,软件可支持单点定标功能,无,无,LightCycler每次实验节约反应管和反应试剂45份，且单点拟合确保实验结果,反应管,反应体系,(定量),石英玻璃毛细管,10-20ul,薄壁塑料管,50ul100 ul,专用薄壁塑料管,50ul100 ul,石英玻璃管荧光检测灵敏度好，导热快,试剂用量省,项 目,ROCHE,LightCycler 1.5,ABI ABI 7300,MJ,OPTICON I,备 注,光路波长,及荧光接,收模式,530nm,640nm,710nm.并解决相关荧光素荧光干扰问题，光电杂合模式,4通道，无颜色补偿功,能,CCD镜头模式(需使,用Rox染料进行校正,占,用一个通道,实际只有3,个通道可用),1通道，无颜色补,