体内药物分析-----第六章--色谱分析法课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 色谱分析法,药学院药物分析教研室,【,大纲要求,】,1,、掌握薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱法的基本原理和主要仪器装置,2,、熟悉薄层色谱、气相色谱和高效液相色谱法在体内药物分析中的应用,第一节：薄层色谱法,Thin layer chromatography TLC,一、概述,薄层色谱是一种微量分析的分离过程，它将样品点在以玻璃板或铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上,利用流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移到不同距离处，在色谱展开整个过程中，样品的成份受到正反不同的力的作用。,(1),流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相。,(2),样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极,-,（诱导）,-,偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理,。,薄层色谱法,分配薄层色谱,吸附薄层色谱,离子交换薄层色谱,凝胶薄层色谱法,二、薄层扫描法,薄层扫描法,(Thin layer chromatography scanning method,，,TLCS),是指用薄层扫描测定色谱斑点含量的一种方法,。,(,一,),实现操作的规范化和自动化,1,光谱测定,多用于体内药物的定性鉴别。薄层色谱扫描仪在波长,200,800nm,之间进行斑点的原位扫描，测得该药物的吸收曲线及最大吸收峰位，并与对照品比较从而对检测样品中该成分进一步确证。,2,色谱测定,多用于体内药物的定量测定。被分离的药物斑点在薄层扫描仪上，选择合适的测定参数进行扫描，可得到斑点的面积值，然后与已知量的对照品斑点的面积值进行比较，即可计算出待测样品中被测成分的含量。,Camag,TLC Scanner,瑞士卡马,双波长飞点薄层扫描仪,CS-9301PC,型,SHIMADZU,(,二,),薄层色谱溶剂的优化方法,薄层色谱条件,被分离物质的性质,(,溶解度、酸碱性及极性,),吸附剂的活性,展开剂的极性,固定,变化不多,千变万化,理想的分离是得到,R,f,值在,0.2,0.8,之间、清晰集中、分离度最佳的一组斑点,。,1,窗图法,(Window diagrams),原理：,Xs,为双溶剂体系中极性溶剂的摩尔分数；,k,为容量因子；,a,，,b,为与实验有关的常数,。,2,数值分析法,(,numerical analysis,),(1),对分法优化粗选溶剂系统,样品的溶解度，选择易溶和微溶的两种溶剂，用定一种溶剂用量，每次只改变一种溶剂体积，依对分法优化基本原理，经实验反复比较，可粗选出分离较好的溶剂体系范围。,(2),作图预测最佳展开剂系统,计算溶剂系统极性强度近似值,s,，以难分离物质对的,R,f,对,s,作图，在适当的,s,范围内，所有难分离组分都可以得到有效分离。,(3),数值分析法,R=a+bx+cx,2,R,为难分离物质对的分离度，,x,为另一种溶剂的体积,3,图示法,(,graphic presentation,),(1),两个最初的混合溶剂中每一个不能含两种以上的溶剂组分。,(2),每对溶质应在最初的一个混合溶剂中获得分离。,(3),不超过三次实验，能选出两种最初展开剂。,(4),图示结果应给出一个能分离出混合物中组分的最佳展开剂。,三、定量分析方法,(,一,),外标一点法,:,用一种已知浓度的对照品溶液与样品溶液对比,A,样,，,A,对,分别是点样量为,m,样,，,m,对,时的薄层斑点的峰面积，在吸收扫描法中为吸光度积分值，在荧光扫描法中为荧光强度的积分值。,注意：对照品溶液和样品溶液多点点样，取平均值计算，点样必须准确，对照品与样品的响应值应基本相当,。,(,二,),外标两点法,m,样,，,A,样,分别为样品中被测组分薄层斑点的含量及峰面积，,b,为斜率，,a,为截距。,a,与,b,需由对照品溶液的点样量及峰面积求得,。,用两种浓度的对照品溶液与样品液对照来定量,四、应用示例,(,一,),薄层色谱扫描法检测血清中对乙酰氨基酚,1,色谱条件,CS-930,薄层色谱扫描仪，,GF,254,层析板；,展开剂：正庚烷,-,乙酸乙酯,-,氯仿,无水乙醇,(5,：,5,：,2,：,2),，展距,8cm,、,R,f,为,0.62,；,测,254nm,，,参,310nm,，外标法程序扫描。,2,样品预处理,血清加,pH7,4,磷酸盐缓冲液，用乙醚提取，,40,水浴挥干，残渣用无水乙醇溶解，取,10l,点样于薄层板上。,3,工作曲线制备,空白稀释血清,100l,，依次加入,0.2,，,0.6,，,1.0,，,3.0,，,5.0,，,7.0,，,9.0l,对乙酰基酚标准液,求得回归方程，线性范围为,80,1800g/ml,，最低检出限为,0.1g/ml,。,4,回收率试验,5,板间测定误差试验,6,测定结果,1,仪器与试剂,CS,一,930,薄层扫描仪；紫外分析仪,(254nm),；扑炎痛、扑热息痛,(,成都第二制药厂,),、去乙酰物,(,自制,),、葡萄糖醛酸酯酶,(sigma,公司,),。,2,尿中代谢产物薄层分析,水杨尿酸,实例,2,：尿中扑炎痛代谢产物分析,3,薄层扫描定量,(1),线性试验：,取,0.1g/ml,扑热息痛标准液,2.5l,，,10l,，,15l,点样，展开，进行锯齿形扫描，测定波长为,252nm,，参比波长为,300nm.,(2),尿样提取回收率试验：,依次点含扑热息痛,2.0,，,3.2,，,4.4,，,5.6g,的标准液，另将加入这,4,种浓度标准液的空白尿液按上述操作提取，点于同一块薄板上，扫描，平均回收率为,83.60,(RSD 1.45,),。,(3),尿样中扑热息痛及其葡萄糖酸结合物的定量：,取,24h,累积尿样,2ml,，按上述方法提取，点样,20l,，将扑热息痛标准液,2.5,，,10,，,15l,分别点于同一块薄层板上，展开，扫描，计算尿液中和,24h,累积尿中扑热息痛含量。,于提取过扑热息痛的尿样中，加入用,pH5.58,的醋酸缓冲液溶解的葡萄糖醛酸酯酶,3ml,，,37,恒温,4h,，提取，点样，扫描，计算尿样中和,24h,累积尿中与葡萄糖醛酸结合的扑热息痛的量。,兔血浆及脏器中西沙必利薄层扫描测定法,测定波长入 为,307nm,，参比波长入 为,360nm,，线性化参数,SX,：,3,，反射锯齿扫描，狭缝,1.2mm1.2mm,，扫描速度,20mm,ml,第二节 气相色谱法,一、概述,气相色谱法,(,gas chromatography,，,GC,),优点：,“三高” “一快” “一广”,1.,高效能：一般填充柱的理论塔板数可达数千，毛细管柱可达一百多万。,2.,高选择性：可以使一些分配系数很接近的以及极为复杂、难以分离的物质，获得满意的分离。,3.,高灵敏度：可以检测,10,11,10,13,g,物质，适合于痕量分析,4.,分析速度快：通常一个试样的分析可在几分钟到几十分钟内完成。,5.,应用广泛：可以分析气体试样，也可分析易挥发或可衍生转化为易挥发的液体和固体。分析的有机物，约占全部有机物,(,约,300,万种,),的,20%,。,缺点：,要求被测药物及其代谢物必须具有一定的挥发性和热稳定性。,二、仪器简介,(,一,),载气,(,二,),进样,1,气体样品,0.1,1ml,2,液体样品,0.1,1,l,3,毛细管色谱的进样,0.01-0.001,l,(,三,),色谱柱,填充柱：,4,6 mm,，,1.5,4 m,毛细管柱,:,0.1-0.5mm,数十至数百米，开口毛细管柱和填充毛细管柱,色谱柱组成,柱管,填充剂,填充柱,：,24,米柱长，,26mm,内径,毛细管柱：几十米,几百米柱长，,0.10.5mm,内径,固体吸附剂,气,-,固吸附色谱柱,载体,+,固定液,气,-,液分配色谱柱,(,四,),检测器,1,氢焰离子化检测器,(FID),氢,-,空气火焰中能电离的有机药物及其代谢物都可被检出,FID,的有效检测浓度在,100ng/ml,以上，最低检出量可达,1ng,2,氮磷检测器,(NPD),碱焰离子化检测器（,AFID,）或火焰热离子化检测器（,FTD,）,与,FID,不同之处是：该检测器火焰处设置有加热的碱金属盐如卤化钠、卤化铷或硅酸铷等晶体，增加了检测器对某种特定元素的灵敏度，如专门对氮、硫、磷等元素敏感。,NPD,灵敏度可达,10,-12,g,水平。其对含氮或含磷有机药物的灵敏度分别比,FID,高,50,倍和,500,倍。,3,电子捕获检测器,(ECD),基本原理：由,3,H,或,63,Ni,等放射源发出的,射线使载气分子电离，产生慢速度低能量的电子，色谱柱分离物中含有亲电子基团的成分捕获了慢速电子而变成负离子，这些负离子与载气受放射粒子轰击产生的正离子复合，产生电信号。,ECD,是一种有选择性的高灵敏度的检测器。它对含有电负性原子或官能团,(,如卤素、硝基、氰基、巯基、多环芳烃以及金属有机化合物等,),的有机或无机化合物特别敏感。,在体内药物分析中常用于测定含有卤素或含有,CONH,2,、,CN,、,ONO,、,NO,2,等吸电子基团的有机药物及其代谢物。,4,质谱检测器,三、定量分析方法,(,一,),系统适用性试验,1,色谱柱的理论板数,(n),2,分离度,3,重复性,RSD,应不大于,2.0,4,拖尾因子,1.5,0.95,1.05,(,二,),内标法,1,内标法的基本原理,W,i,、,W,s,、,W,m,分别为待测组分、内标物和样品的重量；,f,i,、,f,s,分别为待测组分和内标物的重量校正因子；,A,i,、,A,s,分别为待测组分和内标物的峰面积,。,2,内标物的选择原则,(1),内标物与被测药物只差一个化学元素：,测定血浆中的,5-,氟尿嘧啶时，选用,5-,氯尿嘧啶作内标物。,(2),内标物与被测药物为同系物：,测定血中乙醇含量时，常选用丙醇作为内标物。,(3),内标物与被测药物结构相似：,应用最多。,3,内标物的应用,内标物应在样品预处理之前等量加入各管然后在相同条件下进行预处理，进样分析。,以峰面积比值对药物标准品浓度作图或进行回归的标准曲线或回归方程，用于体液样品中药物含量测定。,加入内标物既可消除误差，又可使操作简化,。,4,多内标物的应用,血浆中地西泮,(,安定,),及其代谢物去甲安定的测定,100:1,(,三,),外标法,1,工作曲线法本法,目前采用建立回归方程的方法来代替工作曲线法。,2,外标一点法,m,i,，,m,s,分别代表待测组分和标准品的重量；,A,i,，,A,s,分别代表待测组分和标准品峰面积。,四、应用示例,(,一,)GC-FID,测定血清中丙戊酸钠浓度,1,仪器和试药,(1),仪器：,viran,GC3400,型气相色谱仪，使用,2m3mmID,不锈钢柱，充填以涂渍,15,FFAP,的,Gas,Chrom,Q(80,100,目,),，,FID,检测器，日本岛津,C-RIB,型色谱数据处理机,。柱温,200,，汽化室和检测器温度分别为,220,和,235,，,N,2,，,H,2,和空气的流速分别为,45ml/min,、,45ml/min,和,450ml/min,，检测器灵敏度为,10,11,1/2,。,(2),试药：,(3),标准溶液：,(4),内标工作液：,环己烷羧酸钠内标工作液,2,方法与结果,(1),标准曲线制备：,(2),样品测定,：,血清样品色谱图,1,丙戊酸,2,内标物,(3),方法精密度,：,(,4),方法回收率：,取已知含,SVP,浓度为,14.6 mg/L,的混合血清样品再加人一定量的,SW,，使其浓度为,77.1 mg/L,，照样品测定法测定含量,5,次，测得平均值为,76.721.0l,，扣除原有量后，计算平均方法回收率为,99.51.6,。,3,讨论,（,1,）萃取条件选择：,SVP,不溶于极性小的有机溶剂，需经酸化转变为丙戊酸后才能用有机溶剂萃取，本实验考察了使用不同浓度的硫酸酸化，用不同量的正己烷和氯仿萃取。实验结果表明，用低浓度硫酸,(1mol,L),酸化时，萃取回收率低，用,3,和,6mol,L,硫酸酸化时萃取回收率相近，但用氯仿提取时杂质峰,3moL,L,的比,6mol,L,的大。相同条件下正己烷比氯仿萃取的回收率低，但正己烷的溶剂峰比氯仿大。因此本实验选用,6mol,L,硫酸酸化，用氯仿提取。,(2),色谱条件：,使用涂渍,15,FFAP,的,Das,Chrom,Q(80,100,目,),不锈钢色谱柱，通过提高柱温使丙戊酸和环己烷羧酸的保留时间分别由大于,12min,和,20min,，缩短为,5.50min,和,9.47min,，色谱峰形好，而且杂质峰不干扰测。,(3),内标的使用：,采用环己烷羧酸钠作内标，用,SVP,一起酸化后萃取，消除萃取操作中误差。,(,二,)GC-FID,法测定血清中布洛芬浓度,样品处理方法,取血清样品,0.5ml,，置,5ml,具塞离心试管中，加水,0.5ml,混合，加正己烷,2ml,，氯化钠,0.5g,，振摇,3min,，离心,10min(3000r/min),，吸出上清液，置,10ml,具塞离心试管中，余留液中加,2ml,正己烷，振摇提取,3min,，离心，吸取上清液，合并上清液，置,40,水浴中，通氮气吹干。加,三氟硼甲醇,液,1 ml,，置,60 ,水浴中,5min,，加正己烷,0.5ml,，振摇,0.5min,，静止分层。取上层液,1l,进样气相色谱仪分析。,(,三,)GC,-,ECD,测定血浆中盐酸可乐定,样品前处理与测定方法,于血浆样品中加入,20l,内标溶液,(0.1mg/ml),及,pH13,的氯化钾一氢氧化钠缓冲液,1 ml,，用乙酸乙酯,6ml,提取，充分振荡后离心,(3.500r/min, 5min),，将有机层转移至,10ml,离心管，加,0.1mol/L,的盐酸溶液,l ml,，再振荡提取，离心后弃去有机层，水层中再加,pHl3,的氯化钾,-,氢氧化钠缓冲液,1.5rnl,后，用乙酸乙酯,5ml,提取，分取乙酸乙酯层并于常温下用氮气吹干。于残渣中加入衍生化试剂,bisTMFBO,2l,，混匀后置,65,温度下放置,4h,，在于,80,用氮气流吹干，残渣用正己烷,200l,溶解后，再用,pH8,的磷酸盐缓冲溶液,1 ml,洗涤，取洗涤后的正己烷层,1l,进样。,一、 衍生化试剂的选择,从可乐定结构可知，衍生化易产生单、双取代。本文对,4,种衍生化试剂：五氟苄溴,(),、七氟丁酸酐,(),、五氟苯甲酰氯,(),和,bisTFMBO,(),进行了比较。由于,(),灵敏度低，,(),血空白有干扰，,(),单、双取代衍生物比值不稳定，,(),则具有灵敏度高、血空白不干扰、衍生物稳定等优点，故选择,bisTFMBO,二、内标的选择,曾据文献选用苯并咪唑，但与抗凝剂肝素峰分离不好。盐酸普萘洛尔提取条件与可乐定一致，提取率可达,95%,以上，其衍生物稳定性好，与样品峰分离好，血浆中内源性物质对测定无干扰，是比较理想的内标物。,三、衍生化可乐定条件的选择,采用大量衍生化试剂或衍生化时间达,12h,以上，可得到单一的双取代峰。衍生化试剂量大不易除去，对,ECD,检测器污染严重，同时为了大大缩短分析时间。本文选择,2l,衍生化试剂于,65,反应,4h,。该条件下用的标准液,(400ng,ml),进行试验，测得可乐定单取代物的峰高与其双取代物的峰高之比基本不变，重现性好，其衍生化物稳定,(3d),。选择双取代峰进行定量测定，结果良好。,(,四,),毛细管气相色谱法测定血浆中平痛新,1,仪器与色谱条件,VISTA6000,气相色谱仪，,NPD,检测器；,CDMC,色谱数据处理仪；交联,SE-54,石英毛细管柱,(30m0.25mm ID),；载气,N,2,，柱前压力为,1.0kg/cm,2,；,H,2,为,100kPa,；进样室温度为,280,，检测室温度为,300,；柱温初始温度为,180,，先以,20/min,升温至,240,后，再以,5/min,升温至,250,，保持,7min,；,1min,内不分流，,1min,后分流；灵敏度为,10,-12,1,2,样品前处理,取离心后狗血浆,1.0ml,，加内标,(,奥芬那君,),l,l,及,0.5mol/L,氢氧化钠溶液,1ml,，混匀，加环己烷,5ml,，混匀离心，取有机相加,O.1mol/L,盐酸溶液,3ml,，混匀离心，弃去有机层，水层加,0.5mol/L,氢氧化钠溶液,1ml,、环己烷,5ml,，混匀离心，取有机相于,60,水浴中氮气流下吹干，残渣加甲醇,100,l,充分溶解，取,1.0l,进样。样品和内标的保留时间分别为,10.3,和,8.5min,。,3,标准曲线与回归方程,配制,20,，,50,，,100,，,200,，,300,，,600ng/ml,的盐酸平痛新标准溶液和,200ng/ml,内标溶液，取上述标准溶液和内标溶液各,100m,加至盛有,1.0ml,空白血浆的,10ml,离心管中，加,0.5mol/L,氢氧化钠溶液,1ml,，混匀,5s,，下同样品处理项下“加环己晚,5ml”.,以样品对内标的峰面积比,X,对样品浓度,Y(ng,/ml,血浆,),回归得回归方程为：,Y=-4.88+377.06X r=0.9992,当信噪比为,5,：,1,时的样品检测限为,5ng/ml,血浆。,4,回收率与精密度试验,5,血药浓度测定,第三节 高效液相色谱法,一、概述,高效液相色谱法,(,high performance liquid,chromatography,，,HPLC,),它是以经典液相色谱为基础，以微粒型填料作固定相，采用高压送液泵和各种高灵敏度检测器。因此，,HPLC,法具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高等特点。与气相色谱法比，在体内药物分析中,HPI,法具有更广的应用范围。,随着近年来新型色谱柱和固定相的研制，毛细管电色谱等新的分离模式的出现，色谱仪器的完善以及固相微萃取技术对样品处理的引入，使,HPLC,法解决实际问题的能力日益增强，特别是在体内药物分析中得到广泛的应用，成为开展体内药物分析工作不可缺少的分离、分析工具。,二、仪器简介,贮液瓶,(1),中的流动相溶剂经过滤器,(2),被输液泵,(3),吸入，经压力和流量计后导人进样阀,(4),。待测样品由进样器注入进样阀，并随流动相一起通过色谱柱,(5),后进入检测器,(6),。检测信号用微机,(8),采集进行数据处理，记录色谱图及色谱峰面积或峰高。制备型色谱仪，可使用馏分收集器,(7),获得制备的样品。对于复杂待测样品，可采用梯度泵进行梯度洗脱操作，使待测样品中的各组分均得到最佳分离。,（一）输液泵,输液泵的作用是产生高压输送流动相。采用柱塞往复采用柱塞往复泵，柱塞向前运动流动相溶剂输出，流向色谱柱；柱塞向后运动，将输液瓶中的溶剂吸入缸体；柱塞往复泵具有体积小、循环快、流量恒定，泵中保留的溶剂很少，容易清洗及更换流动相等特点。泵流速精密度的标准偏差小于,1,；泵的泵压一般可达到,400kg/cm,2,。,(,二,),进样器,7725i,高压六通进样阀,VALCO,十通进样切换阀,6000AS,Agilent,7683,(,三,),色谱柱,1,柱管与柱填料,色谱柱由柱管与固定相组成，采用匀浆高压装柱。色谱柱分为分析型柱和制备型柱两类。分析型的柱长为,10,30cm,，内径为,2,6mm,；制备型的柱长为,25,100cm,，内径为,20,40mm.,填料类型不同,液固吸附色谱固定相为吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、分子筛；,液液分配色谱固定相一种为物理涂渍固定相，另一种为化学键合固定相。在药物分析中，多采用硅氧烷型化学键合固定相。化学键合固定相按极性强弱可分为极性、中等极性和非极性三类。极性键合固定相有氨基、氰基键合相等。氰基键合相适用于分析极性和中等极性药物；中等级性键合相常用的有醚基键合相；非极性的键合相常用的有十八烷基键合相，适用于分析非极性或弱极性的药物。,2,预柱与保护柱在体内药物分析中，为延长色谱柱的使用寿命，不降低柱效，常在进样器前装一根预柱，其作用是平衡流动相和吸附流动相中的杂质，使其不污染分析柱。为了防止分析柱被较脏的样品和流动相中的杂质污染，常在进样器与分析柱之间，装一根填料与分析柱完全相同的短柱作为保护柱。,(,四,),检测器,检测器连在色谱柱的出口端，被色谱柱分离后的样品各组分随流动相流入检测器，样品种的各组分在流动相中的浓度或物理量的变化，由检测器连续地转换成电信号，在记录器上迅速的给出直观信息。,UV,FD,DAD,VWD,ELSD,MS,不同的检测器对同一样品的灵敏度不同，给出的定性或定量信息不同,1,紫外检测器紫外检测器,(,ultraviolet detector,，,UV,),适用于被测样品组分的分子结构中含有,共轭及,n,共轭药物的检测。,单波长紫外检测器,可调波长紫外检测器,VWD,二极管阵列紫外检测器,DAD,2,荧光检测器,(,Fluorophotometric,detector,，,FD,),比紫外检测器有更高的灵敏度和选择性，其灵敏度可检测到,10,-10,g/ml,的药物。只适用于能产生荧光或能生成荧光衍生物的药物。,3,电化学检测器,(,electrochemical detector,，,ECD,),是将电化学中的氧化还原反应，应用于洗脱液中痕量电活性组分的测定，其检测限可达,10,-12,g/ml,。,原理,:,在两电极间施加一恒电压，在组分发生氧化或还原时，连续测量通过的电流，并记录对时间的函数系。氧化电压或还原电压及其检测的可能性，取决于被测样品组分的氧化或还原电位。所用的流动相必须具有一定电导率，一般为盐类或有机溶剂与水的混合液。,特点：,既具有宽的线性测定范围及高的灵敏度，又可用于色谱行为相似而电化学性质不同的化合物的测定，且具有更好的专属性。,4,蒸发光散射检测器,(,evaporative light scattering detector,，,ELSD,),一种质量型检测器其色谱峰的面积只与峰中所含物质的质量有关。,基本原理：,将色谱柱流出液引入雾化器与通入的高纯氮或空气混合形成均匀的微小液滴，经过加热的漂移管，蒸发除去流动相，而被测样品组分形成气溶胶，然后进入检测室。用强光或激光照射气溶胶，则产生光散射，用光电二极管检测散射光。根据散射光强度与被测样品各组分的质量成正比的关系，则可进行定量分析。,PL ELS 2100,低温,ELSD,制备型,Prep ELS,Alltech,2000ES,三、常用色谱分离方法及其应用,(,一,),液固吸附色谱法,流动相为液体，而固定相为固体吸附剂的色谱法，称为液固色谱法，是根据被测样品组分吸附作用的不同来进行分离。常用的固定相均为具有吸附活性的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺和高分子多孔微球等，其中硅胶是应用最广泛的一种。,液固吸附色谱法的分离，是靠被分离样品组分与流动相分子争夺固定相填料表面的活性中心来实现。如果流动相是极性的，它将与固定相填料表面稳定结合，弱极性的样品组分会很快从柱中流出，则样品组分的保留时间短；若流动相比样品组分的极性弱，则样品组分将与固定相填料表面稳定结合，从柱中流出的就慢，样品组分的保留时间就长,。,(,二,),液液分配色谱法,其分离原理是根据样品组分在流动相和固定相中的相对溶解度或分配系数的差异。固定相应是样品组分较好的溶剂，而流动相应是样品组分较差的溶剂。,(,三,),离子交换色谱法,离子交换色谱是一种比较成熟的技术，色谱柱中的填料含有极性基团，而且可离子化，如羧酸、磺酸或季铵离子等。在合适的,pH,值下，这些基团将离解，吸引相反电荷的物质。离子交换色谱法，就是利用离子性物质能与色谱柱中的填料反应，而达到分离的目的,(,四,),凝胶排阻色谱法,凝胶排阻色谱法又称为分子排阻色谱法，基于被分离样品组分的分子量大小不同而对样品组分进行分离的一种色谱方法，是一种获得有关合成聚合物分子量和分子量分布情况的标准分离检测方法。,凝胶排阻色谱法常用的固定相是有一定孔径的多孔性填料，小分子量的样品组分可完全进入孔中，而流动相则是可以溶解样品组分的溶剂。被测样品组分分子，通过在流动相的大量溶剂与色谱柱中多孔填料固定相之间反复交换，从而达到按分子量大小的顺序进行分离，大分子量的样品组分先从色谱柱中洗脱出来，而小分子量的样品组分则后从色谱柱中洗脱出来。,(,五,),色谱分离方法的选择,四、反相色谱,(,一）反相高效液色谱法,(,reversed-phase high-performance liquid chromatography,，,RP-HPLC,),以极性很低或非极性的十八烷基等键合相作为色谱柱填料，以极性较大的水一甲醇或水一乙腈系统作为流动相。,1.,多数药物的极性小于内源性物质的极性，因此利用两者极性差可有利地进行分离。,2.,极性物质不被色谱柱保留，故内源性极性杂质要比亲脂性的药物先流出柱。,3.,可选用的反相柱很多。,4. RP-HPLC,法加进离子对色谱技术，可以同时分析各种极性的离子性药物和无极性的非离子性药物。,(,二,),反相离子对色谱法,反相离子对色谱法将离子型化合物带相反电荷的反离子加到流动相中，使其与呈解离状态的被测样品组分作用，生成脂溶性的电中性的离子对结合物，从而增加了被测样品组分在固定相中的溶解度，使被测样品组分的分配系数增大，改善了分离效果，达到样品组分分离测定的目的。,优点：,适用于易解离物质的混合物、解离物质与非解离物质混合物的分离,1,分离机制,(,1),离子对模型：,被测样品组分中的离子在流动相中与离子对试剂解离出的反离子生成,不带电的疏水性离子对,，随后此中性离子对溶解或吸附在疏水固定相上。离子对试剂的烷基碳链越长，生成的离子对与固定相的亲和力越大，被测样品组分的保留值也就越大，并较缓慢流出色谱柱；反之，被测样品组分则较快流出色谱柱，从而达到组分的分离。,(2),动态离子交换模型：,离子对试剂在流动相中解离后，疏水的反离子被吸附在固定相上，形成动态覆盖的离子交换剂，通过离子交换反应而使样品组分保留在固定相上。烷基碳链越长，越易被固定相表面吸附，对被分离样品组分的交换容量越大，因此样品组分保留值也就越大，样品组分较缓慢流出色谱柱；相反样品组分则较快流出色谱柱，以达到样品组分分离的目的。,(3),离子相互作用模型：,离子对试剂被吸附在固定相表面形成动态双电层，由于离子对试剂的电荷数相同，其在固定相表面均匀排列，只覆盖很少一部分固定相表面，而大部分固定相表面仍为非极性键合烷基碳链，被分离样品组分的保留值，由双电层的静电作用力和固定相表面的非静电作用力所决定。当流动相中的离子对试剂浓度增大时，或离子对的烷基碳链增长时，吸附在固体相表面的离子对试剂的量增大，则电荷密度增大，因此被分离样品组分的保留值也增大，样品组分流出色谱柱较慢；反之样品组分则流出色谱柱较快，因而使样品组分获得了较好地分离,。,2,影响离子对色谱法的主要因素,(1),离子对试剂的选择：,离子试剂的种类不同，形成离子对的平衡常数,K,有很大的差异，从而对被分离样品组分的保留值产生影响。,(2),反离子浓度的选择：,反离子浓度在一定范围内,(0.003,0.0lmol/L),增加，被分离样品组分的保留值增加。当超过时，可能会形成胶束，致使被分离样品组分的保留值降低。,(,3),流动相,pH,值的选择：,离子对的生成依赖于被分离样品组分的解离程度，调节流动相,pH,值可在较大范围内，改变弱酸或弱碱样品组分的保留值和分离选择性,.,应考虑色谱柱,填料的承受性,，因此流动相,pH,值一般控制在,28,范围内，才能确保键合固定相的稳定性。,(4),有机改性剂的选择：,甲醇水或乙腈水系统为最常用的流动相。流动相中,有机溶剂的比例越高,，被组分的,保留值越小,。被分离样品组分的疏水性及离子对试剂的,疏水性越强,，所需有机溶剂的比例越高。多数反离子易溶于甲醇，而在,乙腈,中的溶解度小于甲醇，有利于调整保留值，且乙腈粘度小于甲醇，因此乙腈也是一种较好的有机改性剂。,五、制备高效液相色谱法,(,一,),分离条件的选择,以分析型,HPLC,作为选择分离条件的起点，固定相相同，粒径较大,(2040m),。流动相采用等溶剂强度洗脱。为了维持与分析型,HPLC,相似的保留时间，必须增大流动相的流量，一般原则为,流量之比是柱内径之比的平方,。,(,二,),上样量的影响,制备型,HPLC,常在,超载,条件下工作，但超载常常影响分离效能。在实际操作过程中，制备柱的上样量如果按分析柱上样量放大，一般不会影响分离效能；上样量过大,质量超载,，会出现,拖尾峰,，而保留时间发生变化；样品浓度稀，,上样体积过大,，但质量不超载，则出现,平头峰,，其半峰宽等于柱头样品宽度；样品体积与质量都超载，则产生两者的综合影响,。,(,三,),检测器的选择,低灵敏度的检测器即可，但要求检测器的线性响应范围要宽，而且要求对被分离样品组分是非破坏性的，才能达到制备的要求。,(,四,),分离样品组分收集,被分离样品组分的收集是通过手动或自动馏分收集器进行的。,分辨率,载样量,分离速度,六、直接进样分析法,(,一,),直接进样与沉淀蛋白进样,1,、只要被测样品组分不经浓集就能达到足够的检测灵敏度，而且在流动相中引人较多体液水份，对被测样品组分的色谱分离及色谱系统无影响，就可采用直接进样法。,2,、直接进样分析法最适合尿样的分析，因为正常尿液中含有极微量的蛋白质，不会污染堵塞色谱柱。,3,、除去蛋白后进样,除去蛋白通常采用沉淀法，即在体液样品中加入沉淀剂如甲醇、乙腈及三氯醋酸等，使蛋白质沉淀，取上清样品液进样。此法虽然快速、简便，但加入的沉淀剂也会带来不良影响。,4,、被测样品中的药物或代谢物极性很大，又难于用有机溶剂自样品中萃取出来时，就适合采用上述的方法。,(,二,),柱切换技术,基本原理：,首先在预柱上实现生物体液样品中干扰大分子与被测药物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移到分析柱上完成色谱分析。,优点：,(1),样品前处理简单且自动化操作：,(2),被测样品组分富集提高了监测的灵敏度：,(3),精密度高：,(,三,),胶束色谱,胶束色谱,(,micellar,chromatography,，,MC,),又称拟似相色谱或假相液相色谱，其特点是用含有高于临界胶束浓度的表面活性剂溶液作为流动相。,常用表面活性剂,1,、阳离子表面活性剂，如溴化或氯化十六烷基三甲胺,2,、阴离子表面活性剂，如十二烷基磺酸钠；,3,、非离子表面活性剂，如聚氧乙烯一十二烷基醚等,1,胶束色谱法的分离原理及其应用,原理：,被分离样品组分在,固定相与水相之间,、,胶束与水相之间,以及,固定相与胶束之间,存在着分配平衡，被分离样品组分的洗脱行为取决于三相之间分配系数。胶束色谱就是充分利用被分离样品组分和胶束之间存在的,静电作用、疏水作用、增溶作用和空间作用以及其他综合性的协同作用,等，而获得一般液相色谱所达不到的分离效果。,应用：,在胶束色谱法中，流动相中的表面活性剂可使血清蛋白大分子保持溶解状态，不被保留而不干扰测定，同时还能降低被测样品组分的保留值，因此体液样品可直接进样分析。,2,胶束色谱法的特点,(1),选择性高：,静电、疏水以及空间效应的综合作用，因此通过改变流动相胶束浓度，可使分离选择性获得明显改善和提高。另外，还可通过选择适当固定相与表面活性剂，来改善和提高分离的选择性。,(2),有利于梯度洗脱：,(3),提高检测灵敏度：,胶束具有改变某些化合物荧光强度的能力。,(4),不适用于制备：,(,四,),直接进样分析专用固定相,原理：利用小孔径硅胶对蛋白质的排阻性质和对硅胶基体表面进行适当的改性来实现。如被分离样品组分中蛋白质等大分子的直径大于硅胶填料的孔径，蛋白质分子完全被排阻于填料之外，并较快随流动相流出色谱柱，不干扰被测样品组分的测定。因此，当色谱柱中的填料为孔径小于,8nm,球形硅胶时，被分离样品人血清中的白蛋白将被排阻，则不干扰被测组分的测定。,硅胶改性处理可分两类：,一类是在硅胶的内外表面上有不同的键合基团，外表面亲水性强，不吸附蛋白质；内表面疏水性强，以反相色谱原理保留被测样品组分。,另一类是在硅胶的内外表面上键合有相同的亲水和疏水两种功能基团。这些键合混合功能团的作用，首先引进亲水基团调节外表面的疏水性，使蛋白质不沉积在外表面上，但由于同时存在有疏水基团，外表面上仍然有一些可吸附蛋白质的部位，经过几次体液进样之后，这些部位被蛋白质封闭，就不再对蛋白质进一步吸附。被分离样品组分则进入色谱柱填料的空隙中，并于混合功能基团中的疏水基团相互作用，而保留在固定相上。,七、定量分析方法,(,一,),系统适用性试验,(,二,),内标法,(,三,),外标法,八、应用示例,(,一,),正相高效液相色谱法测定氯硝安定血浓度,氯硝安定属于苯骈二氮杂革类抗癫痫药物。该法以茶碱为内标，用二氯甲烷提取，氮气流吹干，流动相溶解进行测定。,1,溶液配制,茶碱,6.0mg/ml,作为内标溶液，氯硝安定,1.0mg/L,作为标准工作液。,2,样品预处理,取血清,0.5ml,，加内标溶液,200l,，二氯甲烷,2.0ml,，轻轻振摇提取,1min,，离心,5min,，弃去上层水相，取有机相,1.6ml,置于尖底塑料离心管中，氮气吹干，残渣加流动相,100,叫，溶解，取,20l,进样。,3,色谱条件,YWG-SiO,2,柱；流动相为正己烷无水乙醇,(52,：,48),；流速为,0.9 ml/min,；检测波长为,254 nm,；室温为,202,。,4,标准曲线制备,氯硝安定浓度为,10.0,、,20.0,、,40.0,、,80.0,、,160.0,、,200.0g/L,溶液。,5,回收率试验,氯硝安定工作液,15.0,、,100.0,、,150.0l,，结果平均回收率分别,77.65,、,79.1,和,78.8,。,6,精密度试验,氯硝安定两种浓度,(10.0,、,160.0g/L),同一天重复测定,10,次，其日内精密度分别为,4.9,和,2.0,；同一批血清连续测定,10,天，其日间精密度分别为,5.2,和,2.3,。,7,干扰试验,卡马西平、苯巴比妥、苯妥英钠、丙戊酸钠、戊巴比妥痛等不干扰测定。,(,二,),反相离子对色谱测定人血浆中芬太尼浓度,1,色谱条件,色谱柱为,Bondapak,C,18,；流动相为水,(,含,0.005mol/L,辛烷磺酸钠，,0,01mol,L,磷酸,)-,乙腈,(69,：,31),；流速为,1.0ml/min,；检测波长为,220nm,；柱温为室温；检测器灵敏度为,0.005AUFS,。,2,标准溶液,10g/ml,，芬太尼注射液浓度,5g,ml,，作为内标溶液。,3,样品预处理,取肝素抗凝抗血浆,1.0ml,于具塞试管中，准确加入,20l,内标液，混匀。加,1mol/L,NaOH,溶液,0.5ml,，正己烷乙醇,(20,：,1),提取剂,5ml,，混合，涡旋,3min,，进行振荡提取，离心,),取上层有机相于另一尖底试管中，在,50,水浴中氮气流下吹干，以,50l,流动相溶解残渣，取,30l,进样分析,。,4,标准曲线制,5,回收率试验,6,精密度试验,(,三,),人血浆中尼美舒利的高效液相色谱测定及其药代动力学研究,1,色谱条件,2,样品预处理,3,线性关系与精密度考察,4,提取回收率,5,给药方案及血样采集,采用双交叉试验设计方案，即,10,名男性健康受试者，按体重随机分成,A,、,B,两组，随机一半先,po,制剂,A,，后,po,制剂,B,；另一半先,po,制剂,B,后,po,制剂,A,。剂量均为,200mg(2100mg),，两种制剂间隔,1wk,。于早上,7,：,00,空腹服药,200mg(2100mg),，用温开水送服。于服药后,0.5,，,1.0,，,1.5,，,2.0,，,3.0,，,4.0,，,6.0,，,8.0,，,12.0,和,24.0h,于肘静脉取血,3,0ml,置肝素化试管中，,3000r/min,离心,5min,，取,0.5ml,血浆,供分析。,6,药代动力学研究结果,制剂,A,及制剂,B,在人体内的药动学过程为一房模型，以制剂,B,为对照，算得制剂,A,的相对生物利用度为,104,。,(,五,),柱切换,HPLC,法直接测定人血浆中咖啡因的含量,1,色谱条件,色谱仪配六通柱切换阀；二极管阵列检测器，检测波长为,275nm,；,保护柱为,ODS-Hypersil(C,18,，,22mm2.1mm,，,5m),；分析柱为,ODS-Hypersil(C,18,，,200mm4.6mm,，,5m),；流动相,A,为水，,B,为乙腈；梯度条件为保护柱为,0,3.5min,：,O,B,，,3.5lmin,：切换柱；保护柱,+,分析柱为,3.51,13.0min,：,5,25,B,，,13,16min,：,25,65,B,。,2,咖啡因标准溶液的配制,2,标准曲线制,3,回收率试验,计算峰面积，得出该方法的回收率分别为,98.20.75,(n=5),和,98.70.62,(n=5),。,4,精密度和重现性,5,样品测定,对照实验的提取方法：,取待测尿样,2mL,，加约,0,5g,碱性固体缓冲剂,NaHCO,3,K,2,CO,3,(3,：,2,，,W/W),，摇匀后加入乙酸乙,14mL,，振荡提取,15min,，离心,10mln,，精密吸取上清液于,5O,吹干，,甲醇溶解残渣，进样,10L,。,练习与思考,1,、简述,HPLC,分析中常用的检测器及区别？,2,、简述胶束液相色谱和离子交换液相色谱的分离原理？,3,、简述用,HPLC,法测定药物含量时，分析条件的优化过程？,