【实用资料】临床基因扩增实验室室内质控PPT

,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床基因扩增实验室室内质控,（优选）临床基因扩增实验室室内质控,存在的问题,概念不清,不知道具体怎么做,不会写室内质控的,SOP,不知道如何选择室内质控物,不会分析室内质控的结果,室内质控,SOP,存在的问题,责任人不清。,质控物的来源及浓度不清或不全，并且通常没有说明阴性质控物的来源。有些是自制，但制备方法不规范，没有任何的质量检验，定量结果没有溯源性。,没有明确所选用的质控方法。对前,20,次的测定的室内质控没有解决方法。,没有明确的失控判断标准，只是做了一些失控的含糊叙述。并且一般都没有阴性失控的判断方法。,没有失控后的分析及处理措施,。,室内质量控制（,Internal Quality Control,IQC),的概念,由,实验室工作人员,，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在,监测和控制本实验室工作的精密度,，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以,确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作,。,可概括为,:,(1),执行者：实验室技术人员；,(2),目的：监测实验室测定的重复性；,(3),功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。,室内质量控制（,IQC,）的基本内容,主要包括三个方面：,（,1,）测定前的质量控制；,（,2,）统计学质量控制；,（,3,）质量控制的评价。,测定前的质量控制,实验室设施、仪器设备及管理,理想的试剂和操作方法,人员培训,实验室设施、仪器设备及管理,实验室空间及工作流程的设计,实验室环境条件的控制：温湿度控制设备、稳压或不间断电源,理想的,PCR,实验室设计,A,产物分析区,空气流向,空气流向,空气流向,空气流向,缓冲间,缓冲间,缓冲间,专用走廊,工作流向,扩增区,标本制备区,试剂准备区,产物分析区,空气流向,空气流向,空气流向,空气流向,缓冲间,缓冲间,缓冲间,专用走廊,工作流向,扩增区,标本制备区,试剂准备区,理想的,PCR,实验室设计,B,临床,PCR,实验室设计的一般原则,各区独立,注意风向,因地制宜,方便工作,“,十六字口诀,”,产物分析区,空气流向,空气流向,空气流向,空气流向,缓冲间,缓冲间,缓冲间,专用走廊,工作流向,扩增区,标本制备区,试剂准备区,传递窗,传递窗,传递窗,化学方法：实验台面可使用10的次氯酸钠（漂白剂）清洗 ；,经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。,培训所涉及的范围:仪器设备使用、维护和校准；,监测实验室的以前扩增产物的“污染”,核酸提取中的随机误差。,只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。,当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。,如以3s为失控限，假失控的概率为0.,测定下限(Detection limit)（定性测定）,均匀分散于临床标本中，与临床标本一同处理（核酸提取）,核酸提取过程中带入的空管,常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。,P(X=k)5%为失控。,临床PCR实验室设计的一般原则,实验室环境条件的控制：温湿度控制设备、稳压或不间断电源,根据二项式分布的概率计算,临床,PCR,实验室质量管理的特点,“,无基因,”,概念,实验室要有严格的人员进入限制和程序,使用合格的试剂和消耗品,PCR,实验室“污染”的主要来源,临床标本中存在的大量待测微生物,科研中得到的质粒克隆,以前分析研究的特定微生物,大量存在于实验环境中的特定微生物,以前扩增产物的残留污染。这也是,PCR,实验室最容易产生的将造成假阳性的“污染”。,PCR,实验室的重要防“污染”措施,实验室的严格分区及工作程序的严格遵守,化学方法：实验台面可使用,10,的次氯酸钠（漂白剂）清洗 ；有些物品比如放置扩增反应管的盘必须从污染区转回到清洁区时，在转回之前，应将其置于,2,10,的次氯酸钠溶液中过夜，并充分冲洗。,紫外照射：实验台面、仪器设备、实验室空间,UNG,仪器设备及管理,PCR,仪、离心机、加样器、恒温设备等应建立技术档案，并定期维护,;PCR,仪、加样器、恒温设备应定期进行校准,理想的试剂,:,试剂的质检,核酸提取或标本处理方法的抗干扰能力（能否 有效地去掉,PCR,抑制物）,测定下限,(Detection limit),（定性测定）,测定准确性和线性范围,批内变异和批间变异,试剂批间的一致性,有否污染,其他：外包装、试剂的完整性、有效期、说明书等,理想的操作方法,按照试剂盒说明书操作即可吗,?,操作中影响测定结果的关键环节,写出具有可操作性的,SOP,人员培训,培训所涉及的范围,:,仪器设备使用、维护和校准；试剂、方法原理；质量管理体系；相关法律法规、相关领域的新技术、新理念和新进展；实验操作技能等。,如何培训：讲座、讨论、自学和参加培训班等。,培训的评估：书面考试、实验考核、讨论心得、论文、综述等。,统计质控方法,质控物浓度的选择,每次（批）测定质控物的数量及放置,质控规则,Levey-Jennings,质控图方法,“,即刻法,”,质控方法,“,假阳性,”,的统计质控方法,质控物浓度的选择,定量测定：测定线性范围内的高、中、低三种浓度,定性测定：接近方法测定下限的浓度,阴性质控物,每次（批）测定质控物的数量及放置,标本数量如小于,30,，弱阳性和阴性质控各,1,份，标本数量增加，质控物数量相应按比例增加,均匀分散于临床标本中，与临床标本一同处理（核酸提取）,扩增时的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。但在扩增仪中的位置，不应永久性的固定的在一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应的顺延，以使在一定的时间内，可以尽可能的监测每一个孔的扩增有效性。,阴性质控样本的种类,阴性原血清样本,实验过程中带入的空管,仅含扩增反应混合液的管,无阳性，说明为标本交叉“污染”,培训的评估：书面考试、实验考核、讨论心得、论文、综述等。,Levey-Jennings质控图基本的统计学含义,(2)目的：监测实验室测定的重复性；,常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。,标本间交叉污染的概率计算,临床PCR实验室质量管理的特点,Taq酶或逆转录酶失活,7%可信限）的结果不多于3个。,如果一个实验室检测HBV DNA，平常病人结果的阳性率为10%，即p=0.,常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。,只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。,大量存在于实验环境中的特定微生物,因此，如果如在100个标本中，连续出现三个为阳性次数有1次，即概率为1.,如果阴性质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出+3SD,则为失控,为1+3S规则。,阴性原血清样本的功能,监测实验室的以前扩增产物的“污染”,由实验操作所致的标本间的交叉污染。具体地说，如强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染、强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开等,扩增反应试剂的污染。,核酸提取过程中带入的空管,监测核酸提取过程中的实验室“污染”的存在,（,在整个实验过程中，开口放置于核酸提取的操作台面区域内，最后以水为基质，进行扩增,）,仅含扩增反应混合液的管,监测试剂的“污染”,质控规则的表达方式及定义,质控规则的表达方式,质控规则的功能,常用质控规则的符号及定义,质控规则的表达方式,通常质控规则以符号,A,L,来表示，其中,A,为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，,L,为控制限，通常用均值或均值,1,3SD,来表示。,当质控测定值超出控制限,L,时，即可将该批测定判为失控。,常用的,1,3S,质控规则，其中,1,为原式中的,A,，,3s,为原式中的,L,，表示均值,3s,，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值,3s,范围，即可将该批测定判为失控。,质控规则的功能,简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。,常用质控规则的符号及定义,符 号,定 义,1,2S,一个质控测定值超出,2s,控制限。,1,3S,一个质控测定值超出,3s,控制限。,2,2S,两个连续的质控测定值同时超出,+2s,或,2s,控制限。,R,4S,同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的,差值超出,4s,控制限。,4,1S,四个连续的质控测定值同时超出,+1s,或,1s,控制限。,7,T,七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变,化。,10,X,十个连续的质控测定值同时处于均值（）的同一侧。,Levey-Jennings,质控图方法,也称Shewhart质控图，是由 的Shewhart于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。,二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制 。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。,质控图,Levey-Jennings,质控图,基本的统计学含义,稳定条件下，在20个,IQC,结果中不应有多于1个结果超过2,SD,（,95.5%,可信限）,限度；在1000个测定结果中超过3,SD,（,99.7%,可信限）,的结果不多于3个。,如以,3s,为失控限，假失控的概率为,0.3%,。,“,即刻法”质控方法,“,即刻法,”,质控方法的实质是一种统计学方法，即,Grubs,异常值取舍法 ；,只要有,3,个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。,“,假阳性”的统计学室内质控方法,基于日常检验的阳性率比值,(,呈正态分布,),直接概率计算方法（不呈正态分布）,基于日常检验的阳性率比值,半,Levey-Jennings,质控图法,质控规则,当阴性质控样本为阳性时,不管阳性率测定比值为何，均为失控，所有阳性标本须重新测定，并增加一倍阴性质控样本。,如果阴性质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出,+3SD,则为失控,为,1,+3S,规则。本次结果阴性结果根据阳性质控样本的情况,决定是否可以发出,所有阳性样本结果不能发出，需查找出现阳性率增高的原因，并在增加一倍阴性质控样本的情况下重新检测。,可能的几种失控表现,曲线向上漂移：提示出现污染，污染可能是由于某一天操作上的失误导致实验室被污染如标本泄漏，产物泄漏，试剂被污染等,向上的趋势性变化：可能存在累积性的产物污染，实验室扩增产物逐渐累积，从而使病人结果的阳性率逐渐增高。此时实验室需要进行彻底清洁。,直接概率计算法,按统计学规律，一个事件发生的概率小于,5%,被称为小概率事件，即发生的可能性很小。,当一个小概率事件发生时，则可能有误差存在，有必要对其发生的原因进行分析。,对每天的日常病人结果中阳性率出现的概率进行计算，如果这种结果出现的概率小于,5%,时，则可判为失控。,根据二项式分布的概率计算,在一个实验室中某检测项目结果的阳性率为,p,计算在,n,个血液样本中有,k,个阳性结果的概率。根据二项式分布的概率计算公式如下：,P(X=k),=n!/k!(n-k)!p,k,(1-,p,),n-k,(1),其中,n,为当次实验检测标本数，,k,为阳性个数，,p,为阳性率。,P(X=k),5%,为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。,根据二项式分布的概率计算,如果一个实验室检测,HBV DNA,，平常病人结果的阳性率为,10%,，即,p=0.1,在某一次检测,25,个样本出现,6,个阳性结果，,19,个阴性结果，则检测过程中是存在污染的可能性可通过下述方法计算。即计算在,25,个样本中出现,6,个或,6,个以上阳性结果的概率，此时的概率为,1-,（获得,0,个或,1,个或,2,个或,3,个或,4,个或多,5,个阳性结果的概率）即：,1-P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=1-(1-0.1),25,+25(1-0.1),24,0.1+300(1-0.1),232,+2300(1-0.1),223,+12650(1-0.1),214,+53130(1-0.1),205,则在这个实验室一次检测,25,个标本获得,6,个或,6,个以上阳性结果的概率为,3.34%,，小于,5%,，属于小概率事件，即发生的可能性很小，可能有污染所致假阳性结果的可能。,根据泊松分布的概率计算,在血液筛查检测中，许多实验室或检测项目如,HCV RNA,、,CT,、结核杆菌、淋球菌的阳性结果率均较低，这时虽然可以使用公式（,1,）计算概率，但如果标本量很大，使用泊松分布来估计二项式分布是一种更为简便的方法。根据泊松分布，可使用下式计算概率：,P(X=k),=(np),k,e,-np,/k! (2),P(X=k),5%,为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。,根据泊松分布的概率计算,一个实验室中，某项目每次检测结果的阳性率约为,2%,，则在,100,个样本中出现,8,个阳性结果的概率。,根据泊松分布，可使用公式（,2,）计算概率，此时,n=100,p=0.02,k=8, np=2,代入公式（,2,）计算得,P(X=10) =2,8,e,-2,。,标本间交叉污染的概率计算,如果所有阳性结果的出现是连续性的，则可能存在标本间的交叉污染，即阳性样本污染了它邻近的阴性样本，这种情况的概率计算公式如下：,P,=(n-r+1)/n!/r!(n-r)!,（,3,）,其中,n,为当次实验检测标本数，,r,为连续出现阳性的个数。,当某次实际测定标本连续阳性的概率大于所计算的概率，则判为失控。阴性标本结果可以发出，阳性标本要考虑标本间交叉污染的问题。,标本间交叉污染的概率计算,如在一次检测,100,个标本的,HBV DNA,检测中，所有两个阳性结果连续出现的概率为：,P=(100-2+1)/100!/2!(100-2)!=99/4950=0.02,概率为,2.0%,。,因此，如在,100,个标本中，连续出现两个为阳性次数有,3,次，即概率为,3.0%,，则为失控。,而在一次检测,100,个标本，所有三个阳性结果连续出现的概率为：,P=(100-3+1)/100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006,概率为,0.06%,。,因此，如果如在,100,个标本中，连续出现三个为阳性次数有,1,次，即概率为,1.0%,，为失控。,室内质量控制的评价,IQC,是一个集体活动，不光是对实验室一次测定的有效性的判断，也反应了实验室测定趋势的变化。,IQC,的失控不能做为处罚的依据，应建设性的找出失控的原因，针对其采取措施加以改进。,对,IQC,应定期进行评价。,阳性质控样本失控的常见原因,核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留、所用耗材如离心管有,PCR,抑制物等。,仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。,试剂的问题。如,Taq,酶和,/,或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。,阳性质控样本测定结果偏低或为阴性,结果偏低,阴性,临床标本中无强阳性,临床标本中有较强阳性,临床标本中有阳性,临床标本全为阴性,观察临床标本情况,所用离心管含抑制物,Taq,酶活性降低,核酸提取试剂效率低,更换进口离心管,更换,Taq,酶再检测,更换核酸提取试剂,所有标本重新检测,核酸提取中靶核酸丢失,核酸提取中抑 抑物残留,核酸提取试剂混入,扩增仪孔间温度差异,随机误差,检测质控样本及,35,份已知阳性样本,质控样本测定正常且阳性样本有些值增加,质控及已知阳性样本测定仍异常,按系统误差途径分析,重新提取或已知浓度,DNA,在同一孔内扩增,结果正常,结果仍低,进行扩增仪孔温度校准后再检测,Taq,酶或逆转录酶失活,避免假阴性的措施,纯化核酸,标本重复双份测定,稀释标本,使用“内质控”（,Internal Control,IC),阴性质控样本的常见失控原因,扩增产物的,“,污染,”,临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉,“,污染,”,阴性质控样本测定为阳性,临床标本亦全为阳性,临床标本中有阳性也有阴性,扩增产物“污染”,试剂“污染”,同时检测的标本情况,扩增产物轻度“污染”,标本间交叉“污染”,35,空管室内静置,58,份水样本检测,试剂直接扩增检测,验证,验证,58,份水样本检测,暂停日常检验，实验室清洁、通风,更换试剂,措施,有阳性，则确认有实验室“污染”,无阳性，说明为标本交叉“污染”,改善操作,措施,避免,PCR,检验假阳性结果的措施,严格的实验室分区,使用带“滤芯”的吸头,设立“阴性”质控（与标本同时处理）,使用防“污染”（含,UNG,）的,PCR,试剂,临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌、淋球菌等经药物治疗后已死亡，但,PCR,仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做,PCR,检测。,谢谢观看！,感谢观看,