ngs与其他检测序技术流程的对比ppt课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,世和基因内部培训材料,NGS,与其他检测序技术流程的对比,2016,年,7,月,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,世和基因内部培训材料,临床常用诊断技术,2,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,临床常用诊断技术2Copyright 2016.GEN,肿瘤诊断方法,影像学诊断,：超声，CT，MRI，PET，PET-CT,组织细胞形态学诊断,：,-HE,染色,-,辨别肿瘤细胞及分型,免疫组化诊断,：,-,利用抗原抗体结合反应原理,-,针对蛋白类肿瘤标记物（癌胚抗原，糖类抗原，,甲胎蛋白等）的检测,-,鉴别组织来源,分子诊断,：,-,荧光原位杂交（,FISH,）、基因探针及标记、多聚酶链式反应（,PCR,）、,DNA,序列分析,（,sanger,测序、,ARMS,法、二代测序）,等,-,针对肿瘤的癌基因,/,抑癌基因、生长因子及受体,以及肿瘤相关的某些染色体,位点异常的检测,3,肿瘤诊断方法影像学诊断：超声，CT，MRI，PET，PET-,组织病理学检查,仍是癌症诊断,的,“,金标准,”,4,AC,SC,SCC,LC,组织病理学检查仍是癌症诊断的“金标准”4ACSCSCCLC,FISH,ARMS,肿瘤,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,肿瘤病理诊断治疗已进入个体化分子时代,免疫组化,一代测序,数字,PCR,二代测序,FISH ARMS肿瘤点击添加文本,检测方法的介绍,免疫组化（,IHC,）,荧光原位杂交（,FISH,）,桑格测序（,Sanger,测序法）,扩增阻滞突变（,ARMS,）,-PCR,法,数字,PCR,（,ddPCR,）,二代测序,6,Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,检测方法介绍,检测方法的介绍免疫组化（IHC）6Copyright 2,免疫组化染色,7,原理：根据,抗原抗体反应,和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、,荧光素,等的二抗进行反应，前者再用标记辣根,过氧化物酶,（,HRP,）或,碱性磷酸酶,（,AKP,）等的抗生物素（如链霉,亲和素,等）结合，最后通过,呈色反应或荧光,来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。,免疫组化是从蛋白层面看问题的，与测序不同，一个是因（,DNA,），一个是果（,Protein,），所以体内出现一些未知突变，如果对蛋白功能产生影响，也是可以看出来的。,免疫组化染色7原理：根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片,0,分,1,分,2,分,3,分,0分1分2分3分,荧光原位杂交（,FISH,）,定义：荧光原位杂交,(fluorescence in situ hybridization,FISH),是,通过荧光标记的,DNA,探针与细胞核内的,DNA,靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术。,它的基本原理是：如果被检测的染色体或,DNA,纤维切片上的靶,DNA,与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性,-,退火,-,复性，即可形成靶,DNA,与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测,DNA,进行定性、定量或相对定位分析。,分析,9,Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,荧光原位杂交（FISH）定义：荧光原位杂交(fluoresc,荧光原位杂交,(FISH),检,测,以,HER2,为例,荧光原位杂交(FISH)检测以HER2为例,FISH,检测乳腺癌细胞,HER2,扩增代表性图例,高倍扩增,无扩增,扩增,无扩增,FISH检测乳腺癌细胞HER2扩增代表性图例高倍扩增无扩增扩,DNA序列测定的意义,DNA,的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对,DNA,一级结构的详细了解。,DNA序列测定的意义,桑格测序,原理,原理：利用DNA聚合酶，以待测,单链DNA,为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的,双脱氧核苷三磷酸,（ddNTP）作为链延伸终止剂。,在测序引物引导下，通过高分辨率的变性,聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离，,放射自显影,检测后，,合成链序列,，由此推知待测模板链的序列。,13,Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,桑格测序原理原理：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，,Sanger,测序的流程,结果解读,Sanger测序的流程结果解读,扩增阻碍突变系统,(ARMS)-,又称等位基因特异性扩增（,ASA,），利用,PCR,引物的,3,端末位碱基必须与其模板,DNA,互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性,PCR,扩增引物。,ARMS,（,ASA,）的特点是：,“,只有在引物,3,碱基与模板配对时才能出现,PCR,扩增带，野生型的不扩增”,优势,灵敏度高，重复性好，对标本突变率要求底,操作简单，仪器费用较低廉,检测时间短,不足,仅能检测已知突变类型,不能得到具体碱基突变类,型,ARMS,法检测,扩增阻碍突变系统(ARMS)-又称等位基因特异性扩增（AS,16,数字微滴,PCR,(,dd,PCR,),通过将微量样品扩大倍数稀释和分液,(partitioning),，直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过,1,个，再将所有样品在相同条件下进行,PCR,扩增，并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,16数字微滴PCR(ddPCR)通过将微量样品扩大倍数稀释,ddPCR,的工作流程,ddPCR的工作流程,原理是在,Sanger,测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的,dNTP,。通过碱基互补配对原则逐一的添加标记过的,dNTP,，每添加一种,dNTP,就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机识别、转换，从而生成相应的序列信息。,18,新一代高通量测序,(,NGS,),的原理,四,色荧光,判别,ATCG,四种碱基,激光,超高分辨率照相机,Miseq,为首个,FDA,批准临床,的 高通量,测序仪,国际,NGS,高分文章，绝大多数使用,Hiseq,平台,原理是在Sanger测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四,新一代高通量测序,(,NGS,),能,同时检测不同形式的基因突变,Marc Ladanyi.2015 ASCO Annual Meeting,19,新一代高通量测序(NGS)能同时检测不同形式的基因突变 Ma,检测方法比较,检测方法,优势,劣势,可检测的变异形式,AMRS-PCR,1,、灵敏度,3%-10%,2,、扩增和检测同时进行，封闭的体系，减少污染的可能性,1,、只能检测已知突变,2,、如果检测突变点或者类型较多，出现特异产物概率也增加,3,、当检测位点较多时，对,DNA,样本需求增加,点突变、小片段插入,/,缺失,无法测融合、大片段以及热点测序,荧光原位杂交,FISH,1,、灵敏度高、特异度高,2,、空间定位准确，可同时分析分裂期和间期多个细胞，并进行定量,1,、通量低、成本高,2,、对操作和判读技术要求高，不同读片者判读差异较大,拷贝数变化、大片段插入,/,缺失、融合,/,重排。,扩增的金标准,免疫组化,IHC,1,、可对组织和细胞中相应的抗原进行定性、定位及定量研究,2,、经济快捷,1,、抗体的选择,2,、检测者组织的固定,3,、观察者解释方面的差异,仅检测蛋白表达水平,Sanger,测序,1,、测序长度,2,、准确性高，灵敏度,20%-30%,3,、能处理的处理重复序列和多聚序列,1,、通量低、成本高,2,、对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高,3,、灵敏度低,点突变、小片段插入,/,缺失,二代测序,1,、大规模、高通量,2,、能检测各种变异,形式,3,、灵敏度,1%-3%,1,、成本较高,2,、引入,PCR,过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统的偏向性，同时读长也比较短,3,、对数据注释和报告解读要求高,点突变,扩增,融合,/,重排,插入,/,缺失,20,Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,检测方法比较检测方法优势劣势可检测的变异形式AMRS-P,各种方法检测的对比,方法,检测层面,样本需求,优势,劣势,IHC,Protein,组织,直接展现表达结果，直观,主观判断，对操作人员要求较高，阳性判定不确定,ARMS,DNA,组织，血液,速度快，精准度较高,无法测融合，扩增及大片段测序，热点测序,ddPCR,DNA,组织，血液,单位点精准度非常高，可以进行动态监测,多位点血检匹配度不高，热点测序,FISH,DNA,组织,扩增是金标准，并且可以测融合,主观判断，对操作人员要求较高，对融合的判别要求非常高，结果容易出错,世和,DNA/RNA,普适性,一次检测所有突变类型，多基因，精准度高,价格略高，周期略长,21,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,各种方法检测的对比方法检测层面样本需求优势劣势IHCProt,总结,Summary,22,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,NGS,只需要微量样本就可以一次性检测所有的突变类型,FISH,做扩增与融合对实验室研判人员的要求较高，,NGS,通过优化算法，,降低人工出错的比率。,阴性对照极为重要，具有质控和探查种系突变的作用,ARMS,ddPCR,等传统一代测序方法在热点测序这一块的确精准度较高，,但是本质上仍旧是热点测序，不能满足越来越大的检测需求,世和专有探针库保证了前期提取的,DNA,质量,总结Summary22Copyright 2016.,NGS&ctDNA,技术优势,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,NGS&ctDNA 技术优势Copyright 20,NGS,技术特点及优势,检测全面,精准度高,周期短,样本需求少,全自动化的大数据分析方法,时时更新的医学数据库,高通量,单次检测中同时,发现,多个基因的多种突变,包括,单碱基突变、碱基缺失、碱基插入和基因融合,单次反应只能针对一种突变进行检测，并只