河南科技学院常景玲

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,6.1,微生物发酵与制药,6.2,微生物生长与生产的关系,6.3,制药微生物生产菌种建立,6.4,培养基制备,6.5,灭菌工艺,6.6,发酵培养技术,6.7,发酵工艺过程的控制,6.8,青霉素的生产工艺,第六章微生物发酵制药工艺,青霉素的概述,生产菌的生物学特性,发酵工艺过程,提炼工艺过程,6.8,青霉素的生产工艺,1929:Fleming,在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。,杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。,1939,：牛津病理家,Howard Florey,化学家,Ernst Chain,Norman Heatley,。发酵瓶培养霉菌，培养里提取，测活性，青霉素结晶。,6.8.1,概述发现（,1,）,1940:8,只鼠注射链球菌，提取物对,4,只治疗。未经治疗鼠在,24,小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。,1941,年,2,月开始治疗第一批人类病人。,1943,：威斯康辛大学小组，取得突破,生产菌表面培养：几十个单位。,深层培养产黄青霉：,100U/ml,。,X,、,UV,诱变育种：,1000,1500U/ml,。,不产色素变种：,66000,70000U/ml,目前：,85000U/ml,。,细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段,肽多糖的,D-,丙氨酰,-D-,丙氨酸二肽类似物,竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。,生长中的细胞有效，静止细胞无效,高效、安全的抗细菌感染药物,6.8.1,概述作用机理（,2,）,（,1,）临床抗感染治疗：大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。,毒性小，但需要皮试。,（,2,）各种半合成抗生素的原料：,氨苄青霉素，磺苄青霉素，乙氧萘青霉素,头孢菌素母核。,6.8.1,概述应用（,3,）,6-,氨基青霉烷酸（,6-aminopenicillanic 6APA,）苯乙酰衍生物。,侧链基团不同，形成不同的青霉素,G,：苄基青霉素，,C6H5CH2-CO-,，为主,双氢霉素,F,：戊青霉素,X,：对羟苄基青霉素,F,：,2-,戊烯基青霉素,K,：庚青霉素,V,：苯氧甲基青霉素,产品：钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺,6.8.1,概述分子结构及衍生物（,4,）,产黄青霉：,Penicilliumchrosogenum,孢子,:,绿色和黄色,菌落：平坦或皱褶，圆形。,青霉穗,:,分生孢子链状深层培养菌丝：球状和丝状两种。,6.8.2,青霉素生产菌的生物学特性,第,1,期：分生孢子萌发，具有小泡。,第,2,期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒。,第,3,期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。,第,4,期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。,第,5,期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。,第,6,期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，,pH,上升。,第,7,期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。,发酵培养下的生长过程及细胞学变化,规定时间取样，显微镜观察,7,个时期的态变化，控制发酵。,1,4,期为菌丝生长期，,3,期的菌体适宜种子。,4,5,期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。,第,6,期到来之前结束发酵。,镜检控制,青霉素生产流程框图,斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养,米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长,7,天，,25,注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。,6.8.3,发酵工艺过程,一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。,培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。,空气流量,1,：,3,（体积比）；,300-350rpm,；,pH,自然，温度,271,40h,二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量,10,培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。,1:1-1.5,；,250-280rpm,；,pH,自然，,251,。,10-14h,质量：菌丝致密，菌丝粗壮，,III,期，倍增期,6-8h,2,、种子罐培养工艺,三级罐：生产罐；接种量,20,培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，,CaCO3,玉米油,硅油,.,参数条件：,通气量,1,：,0.8-1.2,；,150-200r/min,；,前,60,小时,:pH6.4-6.6,，,26,；,60,小时后,:pH6.7,24,。,3,、生产罐培养工艺,操作方式：反复分批式发酵,发酵罐：,100M,3,，装料,80M,3,.,带放,:6-10,次，带放量,10,，间隔,24h,。,发酵周期：,180-220h,4,、发酵培养与过程控制,青霉素的生产周期,发酵动力学,前,40,小时：培养基中的主要营养物,40,小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。,半饥饿状态：延长合成期，提高产量。,碳源占成本,12,以上，采用糖化液流加,降低成本。,糖与,6APA,结合形成糖基,-6APA,，影响青霉素产量。,（,1,）过程控制,补料分批操作,控制基质浓度,根据残糖、,pH,、尾气中,CO,2,和,O,2,含量。,葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。,残糖,0.3-0.6,左右，,pH,开始升高时流加糖。,浓度：,500kg/M3,，流速,:1.0-2.5kg/M3.h,流加碳源控制,玉米浆,:,最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。,补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素,氨基氮浓度：,0.01-0.05%,。,流加氮源控制,无机盐：硫、磷、镁、钾等。,铁对青霉素合成有毒，,30-40 ug/ml,以下。,罐壁涂环氧树脂保护层。,盐离子控制,时期：合成阶段,种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸,毒性：抑制细胞生长和青霉素合成。,策略：低浓度流加,浓度：苯乙酸,0.1%,，苯乙酰胺,0.05-0.08%,控制：保持供应速率略大于生物合成需要。,（,2,）添加青霉素侧链前体,表面活性剂：新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯,可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇,其他：剪切保护剂；分散剂,提高产量的其他物质流加,适宜菌丝生长温度,30,，分泌青霉素,20,。,20,青霉素破坏少，周期很长。,变温控制，不同阶段不同温度。,生长阶段,:,较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。,前期控制,26,左右，后期降温控制,24,（,3,）温度控制,合成适宜,pH6.4,6.6,左右，避免超过,7.0,直接加酸或碱：自动控制,流加葡萄糖：恒速；变速，依赖,pH,变化快慢。,pH,下降：补加,CaCO,3,、通氨、尿素或提高通气量,pH,上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）,（,4,）,pH,控制,30,饱和度，产率急剧下降；,10,，造成不可逆的损害。,临界溶氧浓度：,30,。,通气比：,1,：,0.8,1.5,。,适宜的搅拌速度,:,保证气液混合，提高溶氧,调整搅拌转速,:,各阶段的生长和耗氧量不同。,（,5,）溶氧控制,天然油脂：玉米油；,化学消沫剂：泡敌。,策略：少量多次。,注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。,（,6,）消沫,青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活,水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定,易溶于有机溶剂，水中溶解度很小,青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性,防止降解，条件温和、快速。,2.8.4,提炼工艺过程,青霉素的存在部位：发酵液,浓度较低：,10,30Kg/M,3,含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等,目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。,预处理,:,发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白,1,、预处理,鼓式真空过滤机过滤：,一次滤液：,pH6.2-7.2,，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量,0.5-2.0%,。,板框式过滤机过滤：,硫酸调节,pH4.5-5.0,，加入,0.07%,溴代十五烷吡啶，,0.07%,硅藻土为助虑剂。,二次滤液：澄清透明，用于提取（收率,90,）,2,、过滤,原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而霉素盐易溶于水。,萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。,工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。,除去蛋白质：加,0.05-0.1%,乳化剂,PPB,。,萃取：,2,3,次。,3,、溶剂萃取,正相萃取：酸化,pH1.8-2.0,，滤液：醋酸丁酯,1,：,0.3,，碟片式离心机分离（浓缩,1.5-2.1,）,反相萃取：,pH6.8-7.4,（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。,反复萃取,2,3,次，达到结晶要求。,萃取条件：,10,下。萃取罐冷冻盐水冷却。,逆流萃取过程,萃取液中添加活性炭，除去色素,过滤，除去活性炭。,4,、脱色,加醋酸钠乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。,加醋酸钾乙醇溶液：得到青霉素钾盐。,5,、结晶,直接结晶,萃取液，再用,0.5 M NaOH,萃取,pH6.4-6.8,下得到钠盐水浓缩液。,加,3-4,倍体积丁醇，,16-26,，真空,0.67-1.3KPa,）下蒸馏。,水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。,结晶经过洗涤、干燥（,60,真空,16h,），磨粉，装桶，得到青霉素产品。,5,、结晶,共沸蒸馏结晶,青霉素的概述,生产菌特性,发酵工艺过程,提炼工艺过程,小结,（,1,）青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？,（,2,）如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？,（,3,）青霉素发酵过程的控制原理及其关键点是什么？,（,4,）青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作，为什么？,思考题,