基因工程的操作课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因工程的操作,*,第二节,基因工程的基本,操作程序,基因工程的操作,生长快、肉质好的转基因鱼(中国),基因工程的操作,基因工程（DNA重组技术）是指,按照人们的愿望,，进行严格的设计，并通过体外,DNA重组,和,转基因,等技术，赋予生物以新的遗传特性从而创造出,更符合人们需要的新的生物类型和生物产品,。,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,概念：,基因工程的操作,一、目的基因的获取,目的基因,：,主要是指编码蛋白质的基因，,例如，与优良品质相关的基因，与生物药物和保健品相关的基因，以及与工业所需酶相关的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。,获取目的基因的方法,：,人工合成,从基因文库中获得目的基因,PCR技术扩增,基因工程的操作,从,基因文库,中获得目的基因,1、概念:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入,受体菌,的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为,基因库,。,2、分类:,基因组文库,部分基因文库,(如cDNA文库),基因工程的操作,基因组文库:,将某种生物体内的,DNA全部提取出来,，选用适当的,限制酶,，将DNA切成,一定范围大小的DNA片段,，然后，将这些DNA片段,分别与载体连接起来,，导,入受体菌的群体中储存，,每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段，也就是说，这个群体包含了这种生物的,所有基因,，叫做这种生物的,基因组文库,。,cDNA文库,如果用某种生物发育的某个时期的,mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA)片段,，与载体连接后储存在,一个受体菌群中,，那么，这个受体菌群就叫做这种生物的,cDNA文库,。,基因工程的操作,基因组文库的构建,基因工程的操作, cDNA文库的构建-,反转录法：,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA,(目的基因),基因工程的操作,基因工程的操作,基因工程的操作,思考？,1、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因?,根据基因的,核苷酸序列，基因的功能，基因在染色体上的位置，基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特殊性,来获得目的基因。,基因工程的操作,利用PCR技术扩增,目的基因,1、定义：,PCR是,多聚酶链式反应,的缩写，是一项在,生物体外,复制特定DNA片段的核酸合成技术，通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。,2、原理：,它是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈,指数方式增长(约2,n,，其中n为扩增循环的次数）,。,基因工程的操作,3、基本前提：,要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成,引物,。,4、过程：,（1）加热至,9095,，使双链DNA模板两条链 之,间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚,合反应的模板。,(DNA变性）,（2）将温度降至,5560,，使两种,引物,分别与,模板DNA的一端互补序列,互补配对,。,（退火）,（3）将温度升至,7075,，在,耐高温的DNA聚合,酶催化,作用下，使DNA链延伸。,（延伸）,基因工程的操作,是一小段单链,DNA,，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的,多核苷酸链.,引物：,基因工程的操作,利用PCR技术扩增目的基因,基因工程的操作,PCR扩增仪,基因工程的操作,人工合成,目的基因,基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成.,基因工程的操作,二、,基因,表达载体,的构建,基因表达载体,的模式图,抗生素,抗性,基因,思考？,将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？,表达载体的构建使目的基因在受体细胞中,稳定存在，并且以遗传给下一代,，同时是目的基因能够表达和发挥作用。,基因工程的操作,基因,表达载体组分,目的基因,启动子：,是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首段，它是,RNA聚合酶,识别的,结合部位,，有了它才能驱动基因转录mRNA。,终止子：,也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的末端，使,转录在这里终止。,标记基因：,是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,基因工程的操作,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因,和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载,体基础上增加了目的基因、启动子、终止子,三部分结构.,用到的工具酶：,既用到限制酶切割载体，又,用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两,种酶作用的化学键都是磷酸二酯键.,启动子、终止子,对于目的基因表达必不可少.,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表,达载体的方式携带进去。,注意,基因工程的操作,三、,将,目的基因,导入,受体,A,、将目的基 因导入,植物细胞,农杆菌转换法,（最常用）,基因枪法,花粉管通道法,基因工程的操作,1、农杆菌转换法,农杆菌：,是一种在土壤中生活的微生物，能在自然界感染,双子叶植物和裸子植物,，而对大多数,单子叶植物,没有感染能力。,原理：,当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的,酚类化合物,，吸引龙杆菌移向这些细胞，这时龙杆菌的,Ti质粒,上的,T-DNA,（可转移的DNA)可转移至,受体细胞，,并且整合到,受体细胞染色体的DNA上,。,基因工程的操作,转化过程,基因工程的操作,2、基因枪法,原理：,利用,压缩气体,产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,应用：,单子叶植物,，但成本较高,基因工程的操作,3、花粉管通道法,基因工程的操作,B,、将目的基因导入,动物细胞,1、方法：,显微注射法,2、步骤：,（1）首先将含有目的基因的表达载体,提纯,。,（2）从雌性体内取出受精卵，采用,显微注,射仪,进行显微注射。,（,3）再将注射了目的基因的受精卵，经,胚,胎早期培养一段时间后,，再移植到雌,性动物的输卵管或子宫内，使其发育,称为具有,新现状,的动物。,基因工程的操作,基因工程的操作,C,、将目的基因导入,微生物细胞,1、受体：,由于,原核生物,具有繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少等特点，因此。早期的基因工程操作都用,原核生物,作为受体细胞，其中以,大肠杆菌,应用最为广泛。,2、导入方法：,（1）,首先用,Ca,2+,处理细胞，使细胞处于一种能,吸,收周围环境中DNA,分子的生理状态，这种细,胞称为,感受态细胞,。,（2）将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液与感受,态细胞融合，在,一定温度下,促进感受态细胞,吸收,DNA分子，完成转化过程。,基因工程的操作,四、目的基因,的检测与鉴定,1、受体细胞的DNA是否,插入了目的基因,。,2、目的基因是否,转录出了mRNA。,3、检测目的基因是否,翻译成蛋白质,。,基因工程的操作,受体细胞的DNA是否,插入了目的基因,1、方法：,DNA分子杂交技术,2、步骤：,（1）将转基因生物的,基因组DNA,提取出来。,（2）制备一个含有目的基因的,DNA片段,，在片,段上用,同位素标记,，,作为探针。,（3）使探针与基因组DNA,杂交,，如果显示出,杂,交带,，说明目的基因已经插入染色体DNA,中。,基因工程的操作,目的基因是否,转录出了mRNA,1、方法：,分子杂交技术,2、步骤：,（1）将转基因生物的,mRNA,提取出来。,（2）制备一个含有目的基因的,DNA片段,，在片,段上用,同位素标记,，,作为探针。,（3）使,探针,与mDNA,杂交,，如果显示出,杂交带,，,说明目的基因,转录出了mRNA,。,基因工程的操作,检测目的基因,是否翻译成蛋白质,1、方法：,抗原抗体分子杂交,2、步骤：,（1）将转基因生物的,蛋白质,提取出来。,（2）制备一个相应的,抗体,，抗体用同位素标记。,（3）使,抗体,与,蛋白质,杂交，如果显示出,杂交,带,，说明目的基因,已经形成蛋白质,。,基因工程的操作,1、在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是,A,用mRNA为模板逆转录合成DNA,B,以4种脱氧核苷酸为原料人工合成,C,将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选,D,由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA,答案：B,基因工程的操作,2、下列高科技成果中，根据基因重组原理进行的是（ ）,我国科学家袁隆平利用杂交技术培育出超级水稻,我国科学家将苏云金杆菌的某些基因移植到棉花内， 培育出抗虫棉,我国科学家通过返回式卫星搭载种子培育出太空椒,我国科学家通过体细胞克隆技术培养出太空牛,ABCD,答案：B,基因工程的操作,3、镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 （ ）,A解旋酶 BDNA连接酶,C限制性内切酶 DRNA聚合酶,解析：检测这种碱基序列改变需将被测基因从DNA上切下来进行扩增，该过程需要限制性内切酶。在扩增后，通过热变性即可使待测基因解旋成单链，与已知碱基序列的贫血病基因制成的DNA探针进行分子杂交，根据形成双链的情况即可测知其碱基序列，此过程无需解旋酶，更不需要形成重组DNA分子所需的DNA连接酶和基因转录所需的RNA聚合酶。据以上分析可知，必须使用的酶是C、限制性内切酶。,答案：C,基因工程的操作,4、下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）,A基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因,B细菌质粒是基因工程常用的运载体,C为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体,D通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA , 用另一种处理运载体DNA,解析：基因工程经常以抗菌素抗性基因为标记基因；质粒是基因工程常用的运载体；通常用同一种限制酶切割目的基因和运载体，以获得相同的黏性末端；受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。,答案：B,基因工程的操作,5、利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是,A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因,B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA,C山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列,D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白,答案：D,基因工程的操作,演讲完毕，谢谢听讲,!,再见，see you again,11/24/2024,