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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,化学发光免疫技术,第一节 发光与化学发光剂,第二节 发光酶免疫测定,（,C,LEIA,）,（,chemiluminescence enzyme immunoasssay,）,第三节,化学发光免疫测定技术,(,CLIA),（,chemiluminescence,immunoassay,）,第四章 电化学发光免疫测定技术,(,ECLI),(electrochemiluminescence,immunoassay),1,ppt课件,化学发光免疫技术：,集灵敏的化学,发光分析和特异的抗原抗体免疫测,定于一体的检测技术。,概 念,特点：,特异性高、敏感性高、分离简便、,快速、试剂无毒、安全稳定、,可自动化。,2,ppt课件,化学发光免疫技术的类型,按发光剂不同分为,1.,发光酶免疫测定,（,C,LEIA,）,chemiluminescence enzymeimmunoasssay,2.,化学发光免疫测定技术,(,CLIA),chemiluminescence,immunoassay,3.,电化学发光免疫测定技术,(,ECLI),electrochemiluminescence,immunoassay,按分离方法不同分,1.,微粒子化学发光免疫测定,2.,磁颗粒化学发光免疫测定,3,ppt课件,第一节 发光与化学发光剂,一、发光,一种物质由电子激发态回复到基态时，,释放出的能量表现为光的发射。,1.,光照发光,:,发光剂经短波长入射光照射后进入激,发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。,2.,生物发光,:,反应底物在荧光素酶的催化下利用,ATP,产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回,复到基态时多余的能量以光子形式放出。,3.,化学发光,:,在常温下由化学反应产生的光的发射。,化学发光是一个多步骤的过程。,4,ppt课件,荧光素酶,ATP,；,O,2,；,Mg,2+,氧化萤火虫荧光素,萤火虫荧光素,生物发光,返回,光,+,AMP+O,2,+CO,2,+,5,ppt课件,化学发光,机制：,某些化合物可以利用化学反应产生的能,量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子,激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基,态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。,二、化学发光剂,化学发光剂或发光底物：,在化学发光反应中参,与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量,的化合物。,发光剂分为,荧光素、生物发光剂、化学发光剂,6,ppt课件,能参与化学发光反应；,与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂；,偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；,应不改变或极少改变被标记物的理化特性，,特别是免疫活性。,化学发光剂应符合以下几个条件,返回,7,ppt课件,1.,酶促反应的发光底物,是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。,CLEIA,中常用的酶有,HRP,和,AP,HRP,的发光底物有鲁米诺、对,-,羟基苯乙酸,AP,的发光底物有,AMPPD,、,4-MUP,（荧光底物）,特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物,1.1,鲁米诺,H,2,O,2,/OH,HRP,+N,2,+H,2,O,+,光,8,ppt课件,对,-,羟基苯乙酸（,HPA,）,HPA,在,H,2,O,2,存在下被,HRP,氧化成氧化二聚体（荧光,物质），在,350nm,激发光作用下，发出,450nm,波长,的荧光，可用荧光光度计测量。,1.2 HPA,H,2,O,2,HRP,+,荧,光,氧化二聚体,9,ppt课件,AMPPD,AMPPD,在碱性条件下，被,AP,酶解生成相当稳定的,AMP-D,阴离子，其有,2,30min,的分解半衰期，发,出波长为,470nm,的持续性光，在,15min,时其强度,达到高峰，,15,60min,内光强度保持相对稳定。,光,AP,/OH,HPO,4,2,1.3 AMPPD,10,ppt课件,4-MUP,4-MUP,被,AP,催化生成,4-,甲基伞形酮，在,360nm,的,激发光的作用下，发出,448nm,的荧光，可用荧,光光度计进行测量。,荧光,AP,1.4 4-,MUP,4-,MU,360nm,激发光,H,3,PO,4,+,11,ppt课件,2.,直接化学发光剂,特点：,不需催化剂，只需改变溶液的,pH,等条件,就能发光的物质。反应迅速、背景低、,信比高，发光量与,AE,浓度呈线性关系。,常用试剂：,吖啶酯（,acridinium,，,AE,）,+,CO,2,+,光,12,ppt课件,3.,电化学发光剂,是指通过在电极表面进行电化学反应而发出,光的物质。,特点：,反应在电极进行；,电子供体为：三丙胺（,TPA,）,化学发光剂：三联毗啶钌,返回,三联毗啶钌,分子结构图,13,ppt课件,第二节 发光酶免疫测定,（,CLEIA,）,一、原理,属于酶免疫测定的一种。只是最后一,步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应,发出的光在特定的仪器上进行测定。,二、技术类型,根据酶促反应底物不同可分为：,1.,荧光酶免疫测定技术,2.,化学发光酶免疫测定技术,根据免疫学反应模式分,1.,双抗体夹心法和双抗原夹心法,3.,固相抗原竞争法：,14,ppt课件,荧光酶免疫测定技术反应原理图,洗涤,弃上清,是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有,强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。,15,ppt课件,化学发光酶免疫测定技术反应原理图,洗涤,弃上清,是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，,通过光强度的测定而直接进行定量。,16,ppt课件,电化学发光原理图,这一过程可在电极表面周而复始地进行,产生许多光子，使光信号增强,返回,激发态,不稳定,基态,电极,17,ppt课件,1.,抗原抗体结合反应,将已包被了抗体的乳胶微,粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间,后,再加入,AP,标记抗体，温育,形成固相包被抗,体,-,抗原,-,酶标抗体复合物,技术要点,2.,分离技术,将复合物转移到玻璃纤维上，用缓,冲液洗涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体,-,抗,原,-,胶乳微粒抗体复合物则被保留在纤维膜上。,3.,酶促发光反应,加入,4-MUP,，酶标抗体上,AP,将,4-MUP,分解，形成,4-MU,，它在,360nm,激发光的照,射下，发出,448nm,的荧光，经荧光仪记录，放大，,根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量,18,ppt课件,1.,磁颗粒分离法：,用抗原或抗体包被磁颗粒,与标,本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过,一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合,酶标记物,IC,和游离酶标记物进行分离的技术。,分离技术,2.,微粒子捕获法：,所用颗粒是无磁性微粒子作为,抗体或抗原的包被载体,然后用纤维膜柱子进,行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。,3.,包被珠分离法：,用聚苯乙稀等材料制成小珠,在,小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后,将,结合状态和游离状态的酶标记物进行分离,.,19,ppt课件,第三节 化学发光免疫测定技术,（,CLIA,）,一、原理,用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与,待测标本中相应,Ab,或,Ag,、磁颗粒性的,Ag,或,Ab,反,应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离,状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入,发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的,检测进行定量或定性检测。,二、技术类型,1.,分离方法 常用磁颗粒分离技术,2.,免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术,3.,不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶,20,ppt课件,1.,抗原抗体结合反应,将包被,McAb,的磁颗粒和待,测标本加入到反应管中，标本中待测,Ag,与磁珠,上,Ab,结合，再加上,AE,标记,Ab,，经过温育，形成,磁珠,Ab,-,Ag,-AE,标记,Ab,复合物。,技术要点,2.,分离技术,在电磁场中进行,2-3,次洗涤后，很快,地将未结合的多余,Ag,和标记,Ab,洗去。,3.,化学发光反应,经洗涤的磁,珠,中，加入,H,2,O,2,和,pH,纠正液,NaOH,，这时,AE,不需要催化剂即分解并,发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记,录,1,S,内所产生的光子能，其积分与被测物含量,成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。,21,ppt课件,1.AE,其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催,化剂。,方法评价,2.AE,与大分子的结合并无减少所产生的光量，,从而增加灵敏度，灵敏度可达,10-15,g/ml,。,3.AE,标记试剂有效期长，可达一年。,4.,固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被,面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更,简易、快捷。,22,ppt课件,第四节 电化学发光免疫测定技术,（,ECLI,）,一、原理,是一种在电极表面由电化学引发的特,异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化,学发光二个过程。,ECL,是电启动发光反应，而,CL,是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光,剂三联吡啶钌,Ru(bpy,)3,2+,标记,Ab,，通过,Ag-Ab,反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极,上发出的光强度对待测的,Ag,或,Ab,进行定量,/,定性。,二、技术类型,1.,分离方法 常用磁颗粒分离技术,2.,免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术,3.,相应标记物是三联吡啶钌而不是酶,23,ppt课件,1.,三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本,同时加入一个反应杯中孵育反应,技术要点,2.,将链霉亲和素（,SA,）包被磁珠加入反应杯中，再次,孵育，使生物素（,B,）通过与亲和素（,A,）的结合，,将磁珠、,Ab,连接为一体，形成双,Ab,夹心法。,3.,蠕动泵将形成的,Ru(bpy,),3,2+,-Ab-Ag-Ab,-B-SA-,磁珠,复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁,吸附于电极表面。同时，游离的,Ab,也被吸出测量室。,4.,蠕动泵加入,TPA,，电极加电压，启动,ECL,反应过程。,该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，,光电倍增管检测光强度，其与,Ru(bpy,)3,2+,的浓度呈,线性关系,故可测出待测,Ag,的含量。,24,ppt课件,原理图,返回,抗体包被 样本,Ru(byp,),2+,TPA,缓冲,的磁珠 抗原 标记抗体 液洗涤,3,25,ppt课件,方法评价,标记物的再循环利用，使发光时间更长、强,度更高、易于测定；,敏感度高，可达,pg,ml,或,pmol,水平；,线性范围宽,10,4,；,反应时间短，,20min,以内可完成测定；,试剂稳定性好，,2,5,可保持一年以上。,26,ppt课件,五、临床应用,1.,甲状腺激素,2.,生殖激素,3.,肾上腺,/,垂体激素,4.,贫血因子,5.,肿瘤标记物,6.,感染性疾病,7.,糖尿病,8.,心血管系统,9.,病毒标记物,10.,骨代谢,11.,过敏性疾病,12.,治疗药物监测,返回,27,ppt课件,
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