PCR技术简介-课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,PCR,技术简介,PCR技术简介,主要内容,PCR,RT-PCR（reverse transcriptional-PCR）,琼脂糖凝胶电泳,主要内容PCR,PCR,的概念,PCR（,p,olymerase,c,hain,r,eaction）即聚合酶链反应技术，它是以待扩增的两条DNA链为,模板,，在一对人工合成的寡核苷酸,引物,的介导下，利用耐热,DNA聚合酶,的酶促作用，通过变性-复性-延伸的循环操作，快速特异地扩增出特定的DNA片断。,PCR的概念,DNA的复制,核酸体外扩增的设想,1985年Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）,耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后诞生了第一台PCR自动化热循环仪,1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,PCR,技术简史,DNA的复制PCR技术简史,PCR,的原理,PCR反应时，一般采用,变性-复性-延伸,三步循环。,1变性：,通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到,94,0,C,，使双螺旋DNA解开成为单链。,PCR的原理PCR反应时，一般采用变性-复性-延伸三步循环。,2复性（退火）：,通过降低反应温度至,45-70,0,C,，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3端粘合。,PCR,的原理,2复性（退火）：通过降低反应温度至45-700C，使两种引,PCR技术简介-课件,PCR技术简介-课件,PCR技术简介-课件,PCR,的主要用途,目的基因的克隆,基因的体外突变,生成大量,DNA以,进行序列测定,特异基因表达量分析,PCR的主要用途目的基因的克隆,PCR反应体系,20ul；25ul；50ul,浓度,50,ul体系(ul）,10 PCR Buffer,5,Mg2+,1,.,5mmol/L,4,dNTPs,200umol/L,4,引物1,10pmol,2,引物2,10pmol,2,模板,0,.,12ug,1,Taq酶,2.5u,0.5,ddH2O,31.5,PCR反应体系20ul；25ul；50ul浓度50ul体系,PCR,实验准备试剂,Taq,酶,0.5-2.5 U/50,l（,通常,2.5 U/50,l）,酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量,从生物公司购买：生工；华美；,Takara;Promega;,与,buffer,mg2+成套出售,PCR实验准备试剂Taq酶,Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂,1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系,（,通常,4,l,/50,l）,Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性,PCR,实验准备试剂,Mg2+PCR实验准备试剂,PCR,实验准备试剂,Buffer,提供合适的PH值,有10buffer和2buffer,有的buffer中含有mg2+，有的buffer中不含有mg2+,PCR实验准备试剂Buffer,PCR,实验准备试剂,dNTP,dATP，dTTP，dGTP，dCTP,可以购买dNTP混合液，也可以购买dATP，dTTP，dGTP，dCTP等体积混合,四种dNTP浓度应相等,每种200umol/L,（通常,4,l,/50,l）,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,PCR实验准备试剂dNTP,PCR,实验准备试剂,模板（DNA或cDNA）,单、双链DNA均可,不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类,一般50ng DNA模板/50,L,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加,提取细胞或组织中的基因组DNA,PCR实验准备试剂模板（DNA或cDNA）,PCR,实验准备试剂,ddH2O,灭菌的去离子水或双蒸水,PCR实验准备试剂ddH2O,PCR,实验准备试剂,引物,0.1-0.5 mol/L（通常10pmol的引物2ul/50ul）,浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降,利用软件（Omiga、Primer primier）设计引物后，由生物公司（生工、赛百盛）合成，收到合成完毕的引物后根据说明对引物进行稀释，一般稀释成10pmol使用,引物设计中需关注的有上下游引物之间的长度，即将来PCR产物的大小；以及上下游引物的Tm值，即将来PCR中的退火温度,PCR实验准备试剂引物,PCR,实验准备-试剂,引物设计原则：,1.长度以1530个碱基为宜,2.正向反向两条引物链之间的距离适中，一般使扩增出的片断在300-1100bp之间。如果使用RT-PCR检测RNA病毒，引物间距离以500bp最佳。片断过短影响结果判定，过长则不易扩增,3.引物碱基组成应随机分布，G+C含量在45-55为宜。,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大,4.引物自身不形成二级结构，引物间没有互补序列（4个碱基以上），,引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败,5.引物序列具有特异性,6.引物3端碱基与模板DNA一定要配对，并且3末端碱基最好选T、C或者G，不选A。,因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高,PCR实验准备-试剂引物设计原则：,PCR,实验准备-仪器、耗材,PCR仪,移液器,吸头,200ul PCR管,EP管架,枪头盒,PCR板,冰盒,PCR实验准备-仪器、耗材PCR仪,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,PCR,反应程序,1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3,PCR,反应程序,预变性(94,C,3m),变性(94,C,30s),复性,(,50-70,C,30s),延伸(72,C,30-60,s),总延伸(72,C,10m),(25-35),变性温度:94C or 95C,不变；,延伸温度：72C，不变；,退火温度：50C左右，可变，Tm值-5,延伸时间：,30-60s，与PCR产物的大小有关，参考酶的延伸效率（通常1000bp/min）,PCR反应程序预变性(94C,3m)变性(94C,30s,PCR,反应程序,(1)94变性3min，,(2)94变性30sec，,(3)52 退火30sec，,(4)72 延伸1min。,(5)goto(2)repeat29,（6）72 延伸10min。,（7）hold at 4。,PCR反应程序(1)94变性3min，,PCR,操作过程,加样顺序,50,ul体系(ul）,10 PCR Buffer,5,Mg2+,3,4,dNTPs,4,4,引物1,5,2,引物2,6,2,模板,7,1,Taq酶,8,0.5,ddH2O,1,31.5,2,混匀，瞬时离心3-5sec,PCR操作过程加样顺序50ul体系(ul）10 PCR,PCR,操作过程,PCR操作过程,PCR,操作过程,PCR操作过程,RT-PCR（reverse transcriptional-PCR）,RT-PCR（reverse transcriptional,RT-PCR,原理,DNA,聚,合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR,扩增,RT-PCR原理DNA聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩,RT-PCR,主要用途,检测特异基因的表达量,特异基因的组织定位,构建,cDNA,文库,鉴定已转录序列是否发生突变,RT-PCR主要用途检测特异基因的表达量,RT-PCR,反应体系,10buffer,2 ul,Mg2+,4 ul,dNTP,2 ul,Rnase Inhibitor,0.4ul,AMV RnaseXL,0.4ul,AMV-Taq,0.4ul,H2O,3.8ul,引物,1 ul,引物,1 ul,RNA(1ug),5 ul,一步法,RT-PCR,RT-PCR反应体系10buffer2 ulMg2+4 u,RT-PCR,反应体系,Components,Volume(l),RNA,8(1g),5xR.T.buffer,4,dNTPs(10mmol/L),2,Primer,1,Rnasin(50U/l),0.4,AMV-RT(10U/l),1.0,DEPC-H,2,O,3.6,Total,20,两步法,RT-PCR,Components,Volume(l,R.T.Product,5.0,10 xPCR buffer,2.5,MgCl2(25mmol/L),2.5,Primer1,1,Primer2,1,Taq DNA polymerase,1,ddH,2,O,12,Total,25,cDNA PCR扩增,cDNA第一链合成反应,RT-PCR反应体系ComponentsVolume(l),RT-PCR,的准备-试剂,提取细胞或组织中RNA,购买,RT-PCR,试剂盒（一步法或两步法）,RT-PCR的准备-试剂提取细胞或组织中RNA,RT-PCR,的准备-耗材、仪器,超净台,PCR仪,移液器,吸头,200ul PCR管,EP管架,枪头盒,PCR板,冰盒,RT-PCR,过程中,cDNA,第一链合成反应所用的枪头、枪头盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制品在180干烤6-8小时。加样过程在超净台内进行，需戴手套与口罩。cDNA PCR扩增的准备工作同普通PCR反应。,RT-PCR的准备-耗材、仪器超净台RT-PCR过程中cD,RT-PCR,反应程序,(1)4230min，,(2)943min，,(3)94变性3min，,(4)94变性30sec，,(5)52 退火30sec，,(6)72 延伸1min。,(7)goto(4)repeat29,（8）72 延伸10min。,（9）hold at 4。,RT-PCR反应程序(1)4230min，,RT-PCR,操作过程,cDNA第一链合成反应所用枪头、枪头盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制品在180干烤6-8小时。在超净台内按试剂盒说明书进行加样，加样过程需戴手套与口罩。,cDNA PCR扩增的准备工作同普通PCR反应。,在PCR仪上设定程序进行反应。,RT-PCR操作过程cDNA第一链合成反应所用枪头、枪头盒、,琼脂糖凝胶电泳的原理,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方法，琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，利用,电荷效应,，在电场的作用下及中性,pH,的缓冲条件下，,带负电的核酸分子,向正极迁移。利用,分子筛效应,可以分离不同片断大小和不同,构象,的,DNA、RNA,分子。,琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方,琼脂糖凝胶电泳的主要用途,分离不同片断大小和不同构象的DNA、RNA分子。,鉴定DNA片段，如PCR产物的鉴定。,纯化DNA分子。,琼脂糖凝胶电泳的主要用途分离不同片断大小和不同构象的DNA、,琼脂糖凝胶电泳的准备-试剂,琼脂糖,电泳缓冲液：Tris，冰乙酸，EDTA（TAE）,6X载,样缓冲液（Load buffer）：溴酚蓝，蔗糖,染色液：goldview,DNA或RNA样品,DNA分子量marker,琼脂糖凝胶电泳的准备-试剂琼脂糖,琼脂糖凝胶电泳的准备-仪器、耗材,电泳仪,电泳槽,微波炉,三角瓶,移液器,电子天平,枪头,凝胶成像系统,琼脂糖凝胶电泳的准备-仪器、耗材电泳仪,琼脂糖凝胶电泳的操作过程,1g 琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。