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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,一.试验目的,1.学习SDS-测定蛋白质分子量的原理,2.把握垂直板电泳的操作方法,二.试验原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS十二烷基磺酸钠,1967年，Shapiro等人首先觉察，假设在聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，外形和电荷)系统中参加肯定量的十二烷基硫酸钠SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？,SDS的作用,SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强复原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消退各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用,因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小,当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。,符合如下方程式：Lg MW =b m R +K,其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件肯定时，b与K均为常数,因此通过分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-)依据缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度一样，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应,不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分别条带清晰度及区分率均较前者佳,Gel,5%,10%,15%,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进展反响，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，参加标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反响一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，参加适合标记物的检测试剂进展显色或发光等，观看有无特异性蛋白条带的消失，也可通过条带的密度大小来进展特异性蛋白的半定量,操作过程,1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,预备2个洁净的小烧杯2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封条和隔离板)*固定玻璃板时，两边用力肯定要均匀，防止夹坏玻璃板,分离胶(,10%10ml,),浓缩胶,(5%10ml),ddH,2,O,4.05ml,6.8ml,30%Acr,3.3ml,1.7ml,Buffer,1.5mol/L pH=8.8,Tris-HCl 2.5ml,0.5mol/L pH=6.8,Tris-HCl 1.25ml,10%SDS,100l,100l,10%Ap,50l,100l,TEMED,10l,10l,配 胶,3.按比例配好分别胶,用移液管快速参加或直接用小烧杯倒入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水或异丙醇除泡,静置至胶凝 *凝胶配制过程要快速,催化剂TEMED要在注胶前再参加,否则分散无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避开产生气泡,*水封的目的：保持分别胶上沿平直，排气泡*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳参加浓缩胶至离边缘5mm处,快速插入梳子,静置到胶凝 *梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平,5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中参加缓冲液,*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出,6.上样：,1marker 5l,2细胞样品10 l+2上样buffer 10l 共20l,100沸水浴，3-5min？蛋白变性,7.微量注射器加样器上样,上样量 15l *微量注射器不行过低,以防刺破胶体；也不行过高,样品下沉时易发生集中，溢出加样孔,8.电泳槽中参加缓冲液，接通电源，进展电泳，开头电流恒定在10mA120V，当进入分别胶后改为20mA180V，溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停顿电泳 9.凝胶板剥离与染色：电泳完毕后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培育皿内，参加考马斯亮蓝染色染色液，染色1小时左右 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰*剥胶时要留神,保持胶完好无损,染色要充分,11.试验结果分析,按下式计算相对迁移率：,每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有牢靠性,五.分析计算,=,蛋,白,样,品,距,加,样,端,迁,移,距,离,c,m,溴,酚,蓝,区,带,中,心,距,加,样,端,距,离,c,m,相,对,迁,移,率,留意的问题,蛋白质电泳,常用的SDS-：单一亚基组成的蛋白质,非变性：多个不同亚基组成的蛋白质,聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套,？,在不连续体系SDS-中,当分别胶加完后,需在其上加一层水,为什么?,电极缓冲液中甘氨酸的作用?,在不连续体系SDS-中,分别胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?,样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,浓缩胶的作用,浓缩胶的作用是有积存作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开头后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开头时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子快速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚拢在移动界面四周，浓缩成一中间层,常见问题及解决方法,1.纹理和拖尾现象：由于样品溶解不好引起的，抑制的方法可以在加样前离心，增加一些增溶帮助试剂如尿素,2.蛋过宽，与邻近泳道的蛋相连是由于加样量太多，可以削减上样量,3.电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分别物质的等电点差异太小，或缓冲系统的离子强度太高,4.指示剂成微笑符号指示剂前沿呈现向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间局部冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致,5.指示剂成微笑符号指示剂前沿呈现向下的曲线形，由于电泳槽的装置不适宜，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片得凝胶聚和不完全,6.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。假设凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应当现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。假设凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂,试剂配制,(1)30%丙烯酰胺Acr：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺Bis0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。4，1-2月210%SDS十二烷基磺酸钠31.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，参加50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最终用蒸馏水定容至100ml41.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，参加50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最终用蒸馏水定容至100ml50.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最终用蒸馏水定容至100ml,710%过硫酸铵(AP)8TEMED四甲基乙二胺9样品溶解液：,SDS100mg+巯基乙醇0.1ml+溴酚蓝2mg+甘油2g+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl2ml，最终定容至10ml。10固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。11染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用,12脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml,13电极缓冲液内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，参加SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml,影响因素,1.溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，假设单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1:0.4这样就不能消退蛋白质原有的电荷差异，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应当为1:4或1:3,2.样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10100mmol/L,3.二硫键是否完全被复原,
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