1-2基因工程的基本操作程序(新)XXXX(2)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,1、结合图，判断以下有关基因工程的工具酶功能的叙述，正确的选项是 ()。,A切断a处的酶为限制性核酸内切酶,B连接a处的酶为DNA聚合酶,C切断b处的酶为限制性核酸内切酶,D切断c处的为限制性核酸内切酶,c,A,DNA连接酶,DNA水解酶,1,1.2 基因工程的基本操作程序,2,基因工程的根本操作程序,一、目的基因的,获取,二、基因表达,载体的构建,三、将目的基因,导入,受体细胞,四、目的基因的,检测,与,鉴定,3,一、目的基因的获取,主要是编码蛋白质的,结构基因,2、获取方法：,1、目的基因:,1）从基因文库中获取目的基因,4,1）从基因文库中获取目的基因：,基因文库:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library),分类：,基因组文库:包含了一种生物所有的基因的基因文库。,构建方法：限制酶切法,局部基因文库（如cDNA文库):包含了一种生物的一局部基因的基因文库。,构建方法：逆转录法,5,限制酶切法（,鸟枪法,或,散弹射击法,）,用限制酶切断成许多片段,6,某生物体内,全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,1、从基因文库中获取目的基因,限制酶,与运载体连接 导入,基因组文库,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,反转录,受体菌群体,与运载体连接 导入,局部基因文库,（cDNA文库）,7,外显子,内含子,与RNA聚合酶结合位点,编码区,非编码区,非编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合酶结合位点,编码区,原核生物基因,真核生物基因,8,RNA聚合酶,A G G T C A C G T C G,T C C A G T G C A G C,A G G U C A C G U C G,一个典型的原核细胞基因结构示意图,非编码区,非编码区,编码区,T C C A G T,A G G T C A,A G A,T C T,mRNA,多 肽 链,9,与RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,1,2,3,4,5,编码区下游,非编码区,非编码区,编码区,转录,mRNA前体,加工,成熟mRNA,翻译,肽链,一个典型的真核细胞基因结构示意图,10,一、目的基因的获取,主要是编码蛋白质的,结构基因,2、获取方法：,1、目的基因:,1）从基因文库中获取目的基因,2）利用PCR技术扩增目的基因,11,2、,利用PCR技术扩增目的基因,概念：,聚合酶链式反应,，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。,条件：,_、,_、_(做启动子)、,_,_.,原理：_,DNA复制,模板DNA,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶,12,利用PCR技术扩增,13,循环,变性,退火,延伸,14,方式：,以_方式扩增，即_（n为扩增循,环的次数）,指数,2,n,利用PCR技术扩增目的基因,过程：,使,目的基因,的片段在短时间内成百万倍地扩增,结果：,：加热至9095，使DNA解旋；,：冷却到5560，2个引物分别与DNA单链结合；,：加热至7075，热稳定DNA聚合酶开始互补链的合成。,氢,键断裂,15,与体内DNA复制的区别：,：不需要解旋酶；,：需参加引物,（前提：目的基因的核苷酸序列，以便合成引物）,：需热稳定DNA聚合酶(Taq酶)；,与体内DNA复制的相同点：,(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板,(2)原料：均为四种脱氧核苷酸,(3)酶：均需DNA聚合酶,(4)引物：都需要引物，,使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,16,一、目的基因的获取,主要是编码蛋白质的,结构基因,2、获取方法：,1、目的基因:,3）化学方法人工合成DNA合成仪,1）从基因文库中获取目的基因,2）利用PCR技术扩增目的基因,17,3、人工合成法,在基因较小，核苷酸序列的前提下，可以利用DNA合成仪人工合成,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,思考：,化学法合成的目的基因含,内含子、启动子和终止子,吗？,18,二.基因表达载体的构建,1、,载体,构建目的：,2、基因表达载体的组成,启动子+目的基因+终止子+标记基因,-,核心,（P11）,同时使目的基因能够,表达和发挥作用。,使目的基因在受体细胞内,稳定存在,，并且,可以遗传,给下一代，,19,表达载体,启动子：,终止子：,位置:,首端,本质:,DNA,功能:,有与RNA聚合,酶结合的位点，,能驱动转录,位置:,尾端,本质:,能终止转录,20,3、基因表达载体的构建过程,特别提醒该过程把三种工具(两种工具酶、一种载体)全用上了，是,最核心、最关键,的一步，在体外进行。,21,思考：,如果用同一种限制性内切酶，处理质粒和目的基因，并将产物放在一起用连接酶连接它们，最后可以产生多少种环状的DNA分子？,你认为它们是怎么组成的？,22,三、将目的基因导入受体细胞,2、将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径,。,1、常用的受体细胞：,动物、植物、微生物。,23,（1）.将目的基因导入植物细胞,1）农杆菌转化法,三、将目的基因导入受体细胞,三、将目的基因导入受体细胞,最常用,方法、经济有效,3、转化,的概念：,目的基因,进入,受体细胞内并在受体细胞中,维持稳定和表达,的过程。,4、转化的方法：,24,1）农杆菌转化法,适用范围：,双子叶,植物和,裸子,植物；,(2)原理：,Ti质粒,上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,25,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,过程：,26,（1）.将目的基因导入植物细胞,1）农杆菌转化法,2）基因枪法,3）花粉管通道法,三、将目的基因导入受体细胞,三、将目的基因导入受体细胞,最常用,方法、经济有效,单子叶植物常用、准确但本钱高,我国独创、,简便经济,3、转化,的概念：,目的基因,进入,受体细胞内并在受体细胞中,维持稳定和表达,的过程。,4、转化的方法：,（2）.将目的基因导入动物细胞,-显微注射技术,27,2）将目的基因导入动物细胞,1.方法：,显微注射技术,2.受体细胞：,受精卵,3.程序:,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,28,（1）.将目的基因导入植物细胞,1）农杆菌转化法,2）基因枪法,3）花粉管通道法,三、将目的基因导入受体细胞,三、将目的基因导入受体细胞,（2）.将目的基因导入动物细胞,（3）.将目的基因导入微生物细胞,-Ca,2+,处理,-显微注射技术,最常用,方法、经济有效,单子叶植物常用、准确但本钱高,我国独创、,简便经济,3、转化,的概念：,目的基因,进入,受体细胞内并在受体细胞中,维持稳定和表达,的过程。,4、转化的方法：,29,3)将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,常用菌：,大肠杆菌,常用法：,Ca,2+,处理获得感受态细胞,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态,细胞,感受态细胞,吸收,DNA,表达载体,与感受态,细胞混合,30,方 法,受体,细胞,其他处理,或特点,植物,细胞,农杆菌,转化,法,基因枪法,花粉管,通道,法,体细胞、,受精卵,植物组织培养,（脱分化和再分化）,动物细胞,显微注射法,受精卵,动物细胞培养,早期胚胎培养,胚胎移植或胚胎分割移植,微生物细胞,Ca2+处理法,（感受态细胞）,原核细胞,繁殖快，多为单细胞，遗传物质少,（农杆菌Ti质粒的T-DNA的特点：即能进入受体细胞，,又能与受体细胞的染色体DNA整合）,双子叶、裸子,31,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？,1,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,2,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,32,四、目的基因的检测与鉴定,1、分子水平 检测,2、个体水平鉴定,检测转基因生物染色体的DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA分子杂交,DNA-RNA分子杂交,抗原抗体杂交,33,转基因生,物的DNA,含目的基因的DNA单链为,探针,15,N,15,N,14,N,14,N,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,34,DNA分子杂交示意图,用DNA分子杂交技术可鉴定两个物种之间的亲缘关系的远近。,将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,如果杂合部位多，则亲缘关系近，反之则远。,35,1、鉴定,分子水平的鉴定,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15,N,15,N,转基因生物,的mRNA,14,N,14,N,36,1、鉴定,分子水平的鉴定,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,苏云金杆菌,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液别离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,37,2、鉴定,个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒表现，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,38,四、目的基因的检测与鉴定,1、分子水平 检测,2、个体水平鉴定,检测转基因生物染色体的DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA分子杂交,DNA-RNA分子杂交,抗原抗体杂交,39,考法,方法,过程,导入检测,外源基因是否与受体细胞的染色体整合,DNA分,子杂交,用放射性同位素或荧光分子标记的目的基因的单链做探针，与转基因生物的基因组DNA杂交，观察是否出现杂交带。,表达检测,是否转录,分子,杂交,用放射性同位素或荧光分子标记的目的基因的单链做探针，与转基因生物细胞中的mRNA杂交，观察是否出现杂交带。,表达检测,是否翻译,抗原-抗,体杂交,从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交，观察是否出现反应。,个体水平检测,比较简单的方法,抗虫或抗,病实验,如，转基因抗虫植物是否出现抗虫性状，让害虫食用转基因植物的叶片，观察其是否死亡。,40,基因工程的根本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,1、从基因文库中获取目的基因,2、利用PCR技术扩增目的基因,3、化学方法人工合成,目的基因+启动子+终止子+标记基因,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、,显微注射法、Ca,2+,处理法,DNA分子杂交技术,DNA-RNA分子杂交技术,抗原抗体杂交技术,个体水平鉴定,分子检测,41,稳固练习:,1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗性基因的主要作用是 (),A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性,B.有利于对目的基因是否导入进行检测,C.增加质粒分子的分子量,D.便于与外源基因连接,2.在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于 (),A.目的基因的提取和导入,B.目的基因的提取和检测,C.目的基因与载体的结合和导入,D.目的基因的提取与载体结合,B,D,42,3.在遗传工程技术中,以下何种目的基因一般以直接别离的方法获得 (),A.人的胰岛素基因 B.蚕的蚕丝蛋白基因,C.芽孢杆菌的抗虫基因 D.菜豆储藏蛋白基因,4.1976年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达,此文中的表达是指该基因在大肠杆菌