第一章-沉淀与共沉淀(3课时)

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,定量分析过程,取样,溶样,消除干扰,测定,计算,掩蔽,原理 数据处理,分离,方法 结果,分离的意义：消除干扰、富集微量待测组分,.,对分离的要求,：,1,）干扰组分应减小至不再干扰被测组分的测定；,2,）被测组分在分离过程中的损失要小到可以不计。,被测组分,A,的回收率（,R,A,）：,A,为主要组分：,R,A,99.9%,A,在,1%,：,R,A,99%,A,为微量组分：,R,A,95%,或更低,气液分离,：,挥发和蒸馏,液液分离,螯合物萃取,离子缔合物萃取,三元络合物萃取,支撑型液膜,乳状液型液膜,生物膜,萃取分离,液膜分离,其他分离方法,：,萃淋树脂、螯合树脂、,泡沫,浮选,分离分析法：气相色谱法，,液相色谱法,、,电泳分析法,分 离 方 法,固液分离,沉淀分离,离子交换分离,氢氧化物：,NaOH,、,NH,3,硫化物：,H,2,S,有机沉淀剂：,H,2,C,2,O,4,阳离子交换树脂,阴离子交换树脂,固相萃取,气固分离,-,超临界流体萃取,第一章,沉淀与共沉淀分离法,沉淀,从液相中产生一个可分离的固相的过程，或指从过饱和溶液中析出的难溶物质。,沉淀作用表示一个新的凝结相的形成过程，或由于加入沉淀剂使某些离子成为难溶化合物而沉积的过程。,产生沉淀的化学反应称为沉淀反应。,溶度积常数,：,物质的沉淀和溶解是一个平衡过程，通常用溶度积常数,K,SP,来判断难溶盐是沉淀还是溶解。溶度积常数是指在,一定温度,下，在难溶电解质的,饱和溶液,中，组成沉淀的各离子浓度的乘积为一常数。各种难溶盐有不同的溶解度，通过测定难溶盐在纯水中的溶解度，便可以算出溶度积。它决定了从溶液中可分离出组分的限度,，,这在分析化学上经常应用,沉淀的结构类型：可分为晶形沉淀和非晶形沉淀两大类。非晶形沉淀又称为无定形沉淀或胶状沉淀,如硫酸钡是典型的晶形沉淀，,Fe,2,O,3,nH,2,O,是典型的非晶形沉淀,它们之间虽无绝对界限，但仍有明显差异。晶形沉淀颗粒大，直径约在,0.1,1,微米之间，内部排列较规则，结构紧密，易于沉降和过滤；非晶形沉淀颗粒很小，其直径通常小于,0.02,微米，没有明显的晶格，排列杂乱，结构疏松，体积庞大，易吸附杂质，难以过滤，也难以洗干净。,沉淀的形成过程很复杂，至今尚不完全了解沉淀形成的机理。实验证明，沉淀和颗粒的类型、大小，既取决于物质的本性，又取决于沉淀的条件。,沉淀条件,：在实际工作中，必须根据不同的沉淀类型选择不同的沉淀条件，以获得合乎要求的沉淀。对于晶形沉淀，主要是创造条件以生成较大的晶粒，避免形成能穿透滤纸的微小结晶。对于无定形沉淀，主要是加速沉淀微粒凝聚、防止形成胶体溶液，力争获得含水少、结构较紧密的沉淀,什么是共沉淀？,当沉淀从溶液中析出时，溶液中的某些原本可溶的组分被沉淀载带而混杂于沉淀中，这种现象称为,共沉淀现象,。,共沉淀现象是玷污沉淀的主要因素。在重量分析中，总是设法减少共沉淀。但是共沉淀分离法却是富集痕量组分的有效方法之一。这是利用溶液中主沉淀物（称为载体或搜集剂）析出时将共存的某些微量组分载带下来而得到分离的方法。,例如，在痕量,Ra,存在下，将硫酸钡沉淀时，几乎可载带下来所有的,Ra,2+,共沉淀的产生,表面吸附,。,由于沉淀表面的离子电荷未达到平衡，它们的残余电荷吸引了溶液中带相反电荷的离子。这种吸附是有选择性的：首先吸附晶格离子；其次，凡与晶格离子生成的盐类溶解度越小的离子，就越容易被吸附；离子的价数愈高，浓度愈大，则愈容易被吸附。升高溶液温度，减小沉淀的表面积，可减小吸附。,包藏,。,在沉淀过程中，如沉淀剂较浓，又加入过快，则沉淀颗粒表面吸附的杂质离子来不及被主沉淀的晶格离子取代，就被后来沉积上来的离子所覆盖，以至杂质离子陷入沉淀的内部，称为包藏，又叫吸留。由包藏引起的共沉淀也遵循表面吸附规律。,生成混晶,。,如果晶形沉淀晶格中的阴、阳离子被具有相同电荷的、离子半径相近的其他离子所取代，就形成混晶。,共沉淀分离法的历史及优势,一种古老的分离方法,为放射化学发展作出了巨大贡献,后来出现了许多更优秀的分离方法，如萃取，离子交换法等,但是由于方法简便，实验条件易于满足，共沉淀分离法在微量元素或放射性核素分析中仍应用广泛。,镭的发现,居里夫妇发现镭时就采取了共沉淀分离法中的分级结晶技术。,镭的发现,返回,良好的选择性,定量性，能定量沉淀微痕量物质,不干扰测定（或者至少易被除去或掩蔽）,便于与母液分离，易洗涤和过滤,共沉淀效率高,应具有以下特点：,共沉淀分离法中所使用的常量沉淀物质叫做载体（也称共沉淀剂）,混晶共沉淀,吸附共沉淀（包藏，吸留）,形成单质晶核的共沉淀,形成化合物的共沉淀,共沉淀分离法按使用载体的不同可分为无机共沉淀和有机共沉淀两大类，另外还有盐析法,无机共沉淀：,按其作用机理，可分为以下几类：,NEXT,有机共沉淀（简介）,有机共沉淀剂可用强酸强氧化剂破坏，或用灼烧挥发，易消除干扰,选择性高,载体分子量大，富集效率高,有机共沉淀剂的显著优点,NEXT,（一）利用大分子胶体凝聚作用,常用丹宁（,C,76,H,52,O,46,）,，辛可宁（,C,19,H,22,N,2O,）,，动物胶等,（二）以离子络合物形成共沉淀,常用阴离子有：卤离子，,SCN,-,，,阳离子：甲基紫，罗丹明,例如，可在酸化的海水中加入甲基紫和,NH,4,SCN,，可定量沉淀低至,0.2,微克的铀。,有些载体的共沉淀效果类似于萃取且不与共存离子反应，叫做惰性共沉淀剂（固体萃取剂）。其沉淀效果好,固体萃取,返回,生物大分子的沉淀分离,中性盐沉淀（盐析法）,：,各种蛋白质和酶的分离纯化,有机溶剂沉淀：,蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化,选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：,除去某些不耐热的和在一定,pH,值下易变性的杂蛋白,等电点沉淀,：,氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用,有机聚合物沉淀：,是发展较快的一种新方法， 主要使用,PEG,聚乙二醇（,Polyethyene glycol,）作为沉淀剂,中性盐沉淀（盐析法）,在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为,“,盐析,”,。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，,20,40,饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，,43,饱和度的硫酸铵可以使,DNA,和,rRNA,沉淀，而,tRNA,保留在上清,盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：,成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。对许多生物活性物质具有稳定作用。,中性盐沉淀蛋白质的基本原理,蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的,COOH,、,NH,2,和,OH,都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成,1nm,100nm,颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。,亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。,因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。,中性盐的选择,常用的中性盐中最重要的是,（,NH,4,）,2,SO,4,，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：,溶解度大,：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（,0,4,）进行。在,0,时,，（,NH,4,）,2,SO,4,仍有,70.6,的溶解度，远远高于其它盐类,分离效果好,：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去,75,的杂蛋白，纯度提高了四倍。,不易引起变性,，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用,2,3mol/L,的（,NH,4,）,2,SO,4,保存可达数年之久,价格便宜，废液不污染环境,盐析的操作方法,最常用的是固体硫酸铵加入法,。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。,各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由文献中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度。,盐析的影响因素,蛋白质的浓度：,通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。,pH,值对盐析的影响,：,蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变,pH,值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，,pH,值常选在该蛋白质的等电点附近。,温度的影响：,对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。,在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。,但对于某些对温度敏感的酶，要求在,0,4,下操作，以避免活力丧失。,有机溶剂沉淀法,其沉淀作用的原理,主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性越大，介电常数越大，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。,溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。,另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。,有机溶剂沉淀法的优点,优点,：,分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其它溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀,沉淀不用脱盐，过滤比较容易,缺点,：,对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行,有机溶剂的选择和浓度的计算,用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶,沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮,沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇,进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：,V = V,0,(S,2,S,1,),(100,S,2,),式中：,V =,需加入,100,浓度有机溶剂的体积,V,0,=,原溶液体积,S,1,=,原溶液中有机溶剂的浓度,S,2,=,所要求达到的有机溶剂的浓度,100,是指加入的有机溶剂浓度为,100,，如所加入的有机溶剂的浓度为,95,，上式的,(100,S2),项应改为,(95,S2),上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。,有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀,有机溶剂沉淀的影响因素,温度：,多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。,样品浓度,：,低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。,反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。,pH,值,：,有机溶剂沉淀适宜的,pH,值，要选择在样品稳定的,pH,值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的,pH,值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。,离子强度：,离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。,以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过,5,为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，,通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。,有机溶剂沉淀法,经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，,使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、,pH,值和离子强度，使之达到最佳的分离效果。,沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，,如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性,选择性变性沉淀法,这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目标物变性沉淀而得到分离提纯，称为,选择性变性沉淀法。,常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等。,热变性,利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目标生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。,此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。,表面活性剂和有机溶剂变性,不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那些敏感性强的杂蛋白变性沉淀，而目标物仍留在溶液中。,使用此法时通常都在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物活性,选择性酸碱变性,利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱不同,pH,值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤,等电点沉淀法,等电点沉淀法,是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。,氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出。,因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。,此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目标物,有机聚合物沉淀法,有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。,其中应用最多的是,聚乙二醇,HOCH,2,(CH,2,OCH,2,)nCH,2,OH (n,4)( Polyethylene Glycol,简写为,PEG ),，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量。,在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为,6000,20000,的,PEG,。,PEG,的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液,pH,和温度等因素的影响。,在一定的,pH,值下，盐浓度越高，所需,PEG,时浓度越低，溶液的,pH,越接近目的物的等电点，沉淀所需,PEG,的浓度越低。在一定范围内，高分子量和浓度高的,PEG,沉淀的效率高。,以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：,认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。,由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。,聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。,通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。,本方法的优点是：,操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用很少量的,PEG,即可以沉淀相当多的生物大分子。,沉淀后有机聚合物容易去除。,（一）混晶共沉淀,常用于晶格相似，离子半径大小相近的载体和微量组分。,例如：,共沉淀,Pb,时沉淀剂的选用（,SrSO,4,or BaSO,4,）,二价,Pb,，二价,Sr,二价,Ba,的半径分别为,1.32A 1.27A 1.43A,，二价,Sr,和二价,Pb,的半径更为接近。故选用,SrSO,4,有利,返回,（二）吸附共沉淀,常利用无定形沉淀进行表面吸附,沉淀剂：氢氧化物，如,Fe(OH),3,，,Al(OH),3,；水合氧化物，如,MnO,2,，,TiO,2,和硫化物，如,CuS,等。,例如：,明矾净水的原理,地球人都知道,吸附共沉淀和混晶共沉淀的比较,选择性好,易于过滤和洗涤,需满足一定条件才可用（半径相似等）,选择性差,过滤和洗涤都较困难,沉淀颗粒小，比表面大，分离富集效率高,应用广泛,在实际测定中都需采取一定措施消除载体对微量组分测定的干扰。,混晶共沉淀,吸附共沉淀,返回,（三）形成单质的共沉淀,将微量元素还原成单质状态从而聚集沉淀。多用于分离贵重金属，如,Ag,Au,铂族金属,例：,将,Ag,离子与二价,Cu,和二价,Fe,分离,解：,氨性溶液中加汞，使银离子还原，实现分离,（四）形成化合物的共沉淀,通过与沉淀剂形成化合物实现分离,返回,