人类细胞质RNA提取RTPCR的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用分析课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,2024/11/19,RNA,2024/11/19,人类细胞质,RNA,提取,RT-PCR,的原理、方法,琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用,主要内容,人类细胞质,RNA,提取,2024/11/19,电泳,PCR,提取总,RNA,合成,cDNA,第一链,2024/11/19,真核细胞RNA的种类,真核细胞总,RNA,主要由,rRNA,（,80-85%,）、,tRNA,和核内小分子,RNA(10-15%),、,mRNA,（,1-5%,）组成，其中,rRNA,、,tRNA,和,mRNA,位于细胞质中。,大多数真核细胞,mRNA,在其,3,端均有一多聚,A(Poly,A),尾巴。,2024/11/19,实验前的准备,RNA,实验失败的主要原因是,RNA,酶的污染。由于,RNA,酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的,RNA,酶就会引起,RNA,的降解，而所制备的,RNA,的纯度和完整性又可直接影响,RNA,分析的结果，所以建立一个无,RNA,酶的环境对于制备,RNA,很重要。,2024/11/19,常用的RNA酶抑制剂,1,、,焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，,进而使RNA,酶失活，,有高致癌性。（实验准备阶段使用,）,2,、,异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。,3,、,RNA,酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用,）,2024/11/19,实验原理,Trizol,试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍,(GTC),的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使,RNA,与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使,RNA,进入水相，离心后，,RNA,保留在水相中，,DNA,和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀,RNA,，从而得到纯化的总,RNA,。,2024/11/19,提取,RNA,（一）、准备试剂,氯仿,异丙醇,75,乙醇,无,RNase,的水或,0.5SDS(,溶液均需用,DEPC,处理过的水配制,),2024/11/19,提取,RNA,（二）、操作步骤,取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约23min，用15ml离心管（,4,000rpm 5min）收集细胞(同管多次离心)，弃上清,沉淀中加入,1ml TRIzol,，旋涡震荡10 s 重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转移至1.5ml EP管，153,0放置5min,加入,0.2 ml氯仿,，用手摇晃15 s，1530,放置5min,12000rpm,离心15min,2024/11/19,提取,RNA,（二）、操作步骤,小心吸取上清，转移至新的1.5ml Ep管，加入等体积的异丙醇，1530放置10min,12000rpm,离心15min，小心去上清，加入,1ml 70%乙醇,，震荡数秒，,8000rpm,离心5min,小心去上清，室温干燥5min，加入10ul DEPC水，打匀,55水浴10分钟助溶,2024/11/19,提取,RNA,（三）、注意事项,1,、,塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。,2,、,有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。,3,、,所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。,4,、,配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。,5,、,操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。,2024/11/19,提取,RNA,（三）、注意事项,6,、,设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。,7,、防止,RNA,酶污染,（,1,）,RNA,酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等,（,2,）严格控制外源性,RNA,酶的污染：外源性的,RNA,酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。,（,3,）最大限度地抑制内源性的,RNA,酶；而各种组织和细胞中则含有大量内源性的,RNA,酶。,2024/11/19,RNA保存,溶解在无,RNase,的水或,TE,中，在,-70,或更低温度中保存时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。,从富含,RNase,的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的,RNA,需溶解在去离子甲酰胺中存于,-70,，至少可以保存一年。需使用,RNA,时，可以加入,NaAc,至终浓度,0.3M,，,12000g,离心,5,分钟，,70%,乙醇洗涤后再用无,RNase,的水或,TE,溶解。,RT-PCR,的原理、方法,2024/11/19,实验原理,1,、单拷贝基因表达存在逐步放大机制。,2,、,PCR,技术，即聚合酶链式反应。反应分三步：变性，退火，延伸。,3,、逆转录酶。可以以,RNA,为模板合成,cDNA,第一条链，或者以第一条,DNA,链为模板合成互补的双链,cDNA,。,pr,incipe,does matter,可见，,RT-PCR,是一种将,cDNA,合成与,PCR,技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法。,RNA,模板,逆转录酶,DNA,-RNA,杂化双链,RNase降解RNA,单链,DNA,DNA聚合酶,c,DNA,RT-PCR,Taq酶,2024/11/19,1,、,引物的特异性决定,PCR,反应特异性。,2,、,引物设计原则的把握：,（,1,）,引物长度,:,一般为,15,30bp,（,2,）,碱基分布,（,3,）,3,端要求,（,4,）,引物自身二级结构,（,5,）,引物之间的二级结构,（,6,）,同源序列,（,7,）,5,端无严格限制,操作步骤,（一）,引物设计,2024/11/19,操作步骤,（二）,RNA,的提取,2024/11/19,操作步骤,（二）,RNA,的提取,2024/11/19,（,1,）两步法,RT-PCR,操作步骤,（三）,cNDA,合成,a,常用的反应体系,10,RT反应缓冲液 2ul,dNTP Mixture（各10mM）2ul,RNAase inhibitor(40U/ul)0.5ul,oligo(dT)18 1ul,逆转录酶 1ul,总RNA 0.51ug,DEPCfree水 补足体系至20ul,2024/11/19,（,1,）两步法,RT-PCR,操作步骤,（三）,cNDA,合成,b,操作,在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul 总RNA溶液,0.2ml Ep管，迷你离心机离心数秒，放置PCR仪中,42 30min（合成cDNA第一链）,85 5min（灭活逆转录酶）,2024/11/19,（,2,）一步法,RT-PCR,操作步骤,（三）,cNDA,合成,在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。,优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余污染；可以得到更高的灵敏度。,缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重新提取总RNA。,2024/11/19,（,2,）一步法,RT-PCR,操作步骤,（三）,cNDA,合成,0.1-1ug 总RNA,200一500 umol/L的dNTP(每种),0.5umolL 基因特异引物（上下游）,200 U AMV逆转录酶,1Taq聚合酶缓冲液,0.5-15mmolL MgCI,2,1 mmo1L DTT,1.5U Taq聚台酶,终体积为50ul。,2024/11/19,（,1,）,50ulPCR,体系的组成（即一步法）：,操作步骤,（四）,PCR,扩增,2024/11/19,（,2,）,PCR反应,过程,：,操作步骤,（四）,PCR,扩增,2024/11/19,（,1,）引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下,2,变化寻找最佳退火温度。,（,2,）此外,Mg2,浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为,2mM,左 右。,（,3,）引物和模板的量等。,操作步骤,（五）,PCR,条件的优化,2024/11/19,根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度,）,。,取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳4560min。成像系统成像分析。,操作步骤,（六）,产物的电泳和结果的测定,琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用,2024/11/19,实验原理,1,、琼脂糖为链状多糖 绳状琼脂糖束大网孔型凝胶,分离、鉴定、纯化,DNA,2,、影响,DNA,迁移率的因素：,DNA,分子的大小、构象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成,pr,incipe,does matter,琼脂糖浓度与,DNA,分离范围,琼脂糖浓度,/%,线状,DNA,大小,/kb,0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0,30-1 12-0.8 10-0.5 7-0.43-0.2 2-0.05,2024/11/19,染色和照相,电泳,样品的制备与加样,选择电泳类型,选择电泳缓冲体系,琼脂糖凝胶的制备,2024/11/19,选择电泳类型,用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。,S,TEPS,does matter,2024/11/19,选择缓冲液系统,常用的电泳缓冲液有,EDTA,（,pH8.0,）和,Tris,-,乙酸（,TAE,），,Tris,-,硼酸（,TBE,）或,Tris,-,磷酸（,TPE,）等，浓度约为,50mmol/L(pH7.57.8),。,S,TEPS,does matter,2024/11/19,凝胶的制备,以稀释的电泳缓冲液为溶剂，用微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。,S,TEPS,does matter,2024/11/19,样品配制与加样,DNA,样品用适量,Tris,-EDTA,缓冲液溶解，缓冲液内含有,0.25%,溴酚蓝或其他指示染料，含有,10%-15%,蔗糖或,5%10%,甘油，以增加其比重，使样品集中。,S,TEPS,does matter,2024/11/19,电泳,在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。,S,TEPS,does matter,2024/11/19,染色与照相,常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA,条带,，用紫外分析仪拍照,，,或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析,。,S,TEPS,does matter,2024/11/19,结果分析,（一）、影响琼脂糖凝胶电泳的因素,DNA,分子的大小：实验证明，,DNA,片段迁移距离与其分子量的对数成反比；,琼脂糖的浓度：一定大小的,DNA,片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；,DNA,分子的构型：不同构型的,DNA,在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大,2024/11/19,结果分析,（二）、常见问题的原因和解决,常见问题,原因,对策,电泳时,ladder,扭曲,配胶的缓冲液与电泳的缓冲液不是同时配制。,同时配制，电泳缓冲液高出胶的,1-2mm,即可。,电泳时电压过高,电泳时电压不应超过,20V/cm,。,2024/11/19,结果分析,（二）、常见问题的原因和解决,常见问题,原因,对策,DNA,带缺尖,DNA,跑出凝胶,缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。,分子大小相近的,DNA,带不易分辨,增加电泳时间，核准正确凝胶浓度,DNA,变性,电泳前勿加热，用,20mM,NaCl,缓冲液稀,释,DNA,。,DNA,链巨大，常规凝胶电泳不合适。,在脉冲凝胶电泳上个分析。,2024/11/19,结