在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第1页,汇报提要,调控网络概述,调控网络分类,调控网络研究方法,在基因水平上探索基因表示代谢和遗传控制,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第2页,调控网络概述,在生物机体内，全部生命活动过程都受到严格调整控制，以最有效地方式和路径适应内外环境改变，以有利生物机体生存繁衍，这些调整控制能够从不一样层次水平，经过不一样路径和方式，以不一样机制进行调控，而且，不一样调整路径和方式彼此之间能够发生有机联络，相互作用、相互影响，协调一致，从而组成了复杂调控网络。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第3页,调控网络分类,可依据不一样功效分类：,神经调控网络,免疫调控网络,代谢调控网络,激素调控网络,细胞内信号传导调控网络,基因表示水平调控网络,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第4页,调控网络研究方法,组织及细胞学方法,基因突变技术,突变体筛选,基因工程技术,基因缺失,基因过表示,转基因技术,生物芯片技术,基因芯片,蛋白质芯片,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第5页,在基因水平上探索基因表示代谢和遗传控制,Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale,Joseph L.DeRisi,Vishwanath R.Iyer,Patrick O.Brown,Science Vol.278.24 Oct.1997:680686,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第6页,当前，,10,各种微生物基因组全序列已测定。在以后几年中，将有望知道几个多细胞生物基因组全序列，其中包含人类基因组序列。然而，在这些基因组中，明确每一个基因功效和作用将是一项十分艰巨任务，而且从整体水平上了解基因组在生物机体复杂生命历程中怎样发生作用，对于咱们将更是一个严峻挑战。,知道一个基因何时何地被表示经常为其生物学作用提供了强有力线索。相反，在一个细胞中，不一样基因表示模式能够为细胞所处状态提供详细信息。尽管蛋白质丰度调整在一个细胞中绝不单独经过,mRNA,调控来完成，但实际上细胞类型或状态全部差异则与许多基因,mRNA,水平改变相关。这是偶然，因为对特定基因测定其,mRNA,含量则需要一特效试剂，即是其,cDNA,序列。,DNA,微阵列技术（基因芯片），是将数千个单个基因序列高密度排列在一张显微镜载玻片上，这种技术为在大规模研究基因表示提供了一个实用经济工具。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第7页,酿酒酵母是一个进行基因表示系统观察研究尤其好研究材料。这些基因在基因组序列中轻易识别，顺式调控元件通常紧凑并靠近转录单元，相关它遗传调控机制已经了解很多，而且一套有力工具可用于它分析。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第8页,酵母糖代谢普通特点,酵母自然生长史中一个重复,循环包含了从厌氧（发酵作用）到需氧（呼吸作用）代谢转换,。,将酵母接种到富含糖基质中会引发由发酵提供能量快速生长，产生乙醇。,当可发酵糖用尽时，酵母细胞转向将乙醇作为碳源供有氧生长。,这个基于葡萄糖损耗从厌氧生长到需氧呼吸转换，即指如,双峰转换,（,Diauxic shift,）,.,该转换与包括到细胞基础代谢过程中基因表示中普遍改变相关，这些代谢包含碳代谢、蛋白质合成，和碳水化合物储存等。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第9页,Fig.3.,Metabolic reprogramming inferred from global analysis of changes in gene expression.,酵母中代谢路径,糖酵解,有氧呼吸,TCA,循环,乙醛酸循环,糖异生,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第10页,咱们使用,DNA,微阵列来刻画整个基因组基因表示过程改变，并研究调控和执行该过程遗传路径,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第11页,基因芯片技术研究糖代谢中基因表示调控普通过程,DNA,微阵列制备,6400,个,DNA,序列,提取制备,RNA,探针,制备荧光标识,cDNA,杂交,酵母细胞,反转录,指数生长细胞不一样培养阶段,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第12页,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第13页,图讲解明,DNA,微阵列制备：,利用购置一组引物对,将酵母开放阅读框个别经过,PCR,放大,.,，包含大约,6400,个清楚,DNA,序列，被用一个简单自动机械印刷装置印刻在玻璃载片上,组成对应,DNA,微阵列。,mRNA,探针制备：,未来自以指数生长培养酵母细胞接种到新鲜基质中在,30C,生长,21,小时。在开始生长,9,小时后，然后依次取得经历间隔,2,小时,7,个不一样阶段连续培养样品，并分离制备,mRNA,。,cDNA,制备：,经过,Cy3(,绿色,),或,Cy5(,红色,)-,标识,dUTP,经反转录制备荧光标识,cDNA,，,杂交：,cDNA,与微阵列杂交。,观察、分析,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第14页,图讲解明,为使识别基因表示水平改变可靠性最大化，咱们标识了从每个连续间隔时间点培养细胞中取得,cDNA,用,Cy5,标识,，,然后将其与,Cy3-,标识,对照,cDNA,样品混合,，后者来自于从接种后第一个间隔时间得到细胞。,在这个试验设计中，测量每一个排列单元,Cy3,和,Cy5,荧光物质相对荧光强度，能够提供为两个细胞群体中对应,mRNA,相对丰度一个可靠量度,(Fig.,1,),。,来自,7,个样品系列数据（见,Fig.2,）,由超出,43000,表示率量度单位组成，被组织成一个数据库,以推进对试验结果深入探索和高效分析。该数据库可在网上公开取得。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第15页,Fig.1.,Yeast genome microarray,在这个试验设计中，测量每一个排列单元,Cy3,和,Cy5,荧光物质相对荧光强度，能够提供为两个细胞群体中对应,mRNA,相对丰度一个可靠量度,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第16页,Fig.2.,The section of the array indicated by the gray box in Fig.,1,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第17页,在一个细胞中，不一样基因表示模式能够为细胞所处状态提供详细信息。尽管蛋白质丰度调整在一个细胞中绝不单独经过,mRNA,调控来完成，但实际上细胞类型或状态全部差异则与许多基因,mRNA,水平改变相关。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第18页,hybridization of the,Cy3-dUTP-labeled cDNA,hybridization,of Cy5-dUTP-labeled cDNA,Genes expressed at roughly equal levels before,and after the diauxic shift,Fig 1.,Yeast genome microarray,TDH1,催化,PEP,GA-3-P,PDC1,催化丙酮酸,乙醛,ALD2,乙醛酸脱氢酶,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第19页,Fig.1,图讲解明,荧光标识,cDNA,探针是来自于从接种后很快细胞中分离得到,mRNA,（培养密度,5106 cells/ml,，基质葡萄糖水平为,19g/liter,）,在,Cy3-dUTP,存在下经过反转录制备。,类似，另一个探针来自培养,9.5,小时后分离同一细胞群中,mRNA,（培养密度,2108 cells/ml,，基质葡萄糖水平为,0.2 g/liter,）,在,Cy5-dUTP,存在下经过反转录制备。,在这幅图中，,Cy3-dUTP-labeled cDNA,杂交（即，,mRNA,在初始时间点表示）显示为绿色信号,，,Cy5-dUTP-labeled cDNA,杂交（即，,mRNA,在,9.5,小时表示）显示为红色信号,。,这么，双峰转换后被诱导或抑制基因在本图中就分别显示为红色和绿色斑点。,双峰转换前后表示水平大致相等基因在本图中显示为黄色斑点,。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第20页,在用于分析双峰转换期间基因表示每个微阵列中,红点代表被诱导与初始时刻相关基因，,绿点代表被抑制与初始时刻相关基因,。,在用于分析,tup1,突变和,YAP1,过表示影响阵列中,红点代表表示增加基因，,绿点代表经遗传修饰造成表示降低基因。,注意区分显著基因组是在不一样试验中被诱导和抑制。,在,600nm,光密度下测量细胞密度是用于测量培养物生长情况。,Fig.2.Fig.,1,中灰色方框标识个别阵列所显示所描述每组试验,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第21页,Fig.2.,图讲解明,酵母在,Glu,培养基上进行指数生长过程中，,其基因表示整体情况是相当稳定。,在比较最初两个细胞样品基因表示情况时（间隔,2,小时收获），,19,个基因,(0.3%),mRNA,水平差异,2,倍或,2,倍多，最大差异也仅有,2.7,倍。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第22页,Fig.2.,图讲解明,然而，当培养基中,Glu,被逐步消耗时，基因表示整体情况可发生显著改变。,大约,710,个,基因,mRNA,水平被诱导,最少增加了,2,倍,;,大约,1030,个,基因,mRNA,水平,下降了最少,2,倍,;,183,个,基因,mRNA,水平最少,增加了,4,倍,;,203,个,基因,mRNA,水平最少,降低了,4,倍,。,当前，这些表示不一样基因中大约有二分之一其功效还没有被认识，而且也没有命名。相对于那些功效已知基因而言,400,多个表示不一样基因没有显著同源性,.,所以，这些以前还未被认识基因对双峰转换应答，首次为了解它们作用提供了有益线索。,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第23页,红框白字,确定了在双峰转换中表示增加基因。,绿框深绿字,确定了在双峰转换中表示降低基因。,黑白框表示无显著差异表示（小于,2,倍）。,连接可逆酶促反应步骤箭头方向，表示从基因表示情况中推断出双峰转换后中间代谢物代谢方向。,基因被强烈诱导表示酶催化反应步骤，用,突出红色箭头,表示。,宽灰色箭头表示从基因表示情况中推断出双峰转换后代谢物主要增加流向。,Figure 3.,Metabolic reprogramming inferred from global analysis of changes in gene expression.,在基因组水平上探索基因表达的代谢和遗传控制调控网络,第24页,Fig.3.,从基因表示改变全局分析中推断得到糖代谢调整图谱。,图中,只确定了关键中间代谢产物。,编码代谢通路中催化每一步反应酶酵母基因名字在方框中给出。,编码琥珀酰,CoA,合成酶和肝糖脱支酶基因还未明确判别（给出），但,ORFs YGR244,和,YPR184,分别表现出与琥珀酰,CoA,合成酶和肝糖脱支酶显著同源性，所以被标注在该图对应步骤中。,红框白字确定了在双峰转换中表示增加基因。,绿框深绿字确定了在双峰转换中表示降低基因。,这些基因诱导和抑制程度在图中也显示出来。,对多亚基酶复合体，如琥珀酸盐脱氢酶，标注诱导倍数代表框中所列全部基因一个无关紧要平均数。,黑白框表示无显著差异表示（小于,2,倍）。,连接可逆酶促反应步骤