研实验大实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,一,.,目的：,1.,学习和掌握,蛋白酶抑制剂电泳,基本原理及电泳技术。,2.,熟练掌握蛋白酶抑制剂电泳有关试剂配制的技术和制胶技术。,二、原理：,(,一,).,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为,PAGE,（,Polyacrylamide,gel electrophoresis,）,:,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。,单体的丙烯酰胺（,CH2=CHCONH2 Acrylamide,，简称,Acr,）,甲叉双丙烯酰胺（,CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N,-methylenebisacrylamide,简称,Bis,）,聚合而成，这一聚合过程需要有,自由基催化,完成。,常用的催化聚合方法有两种：,化学聚合和光聚合。,化学聚合,:,加入,催化剂过硫酸铵,（,NH4,）,2S2O3,（即,AP,）以及,加速剂四甲基乙二胺,（,TEMED,），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基，这样由于乙烯基,“,CH2=CH,”,一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成,交联的三维网状结构,。,氧气对自由基有清除作用,，所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。,光聚合,:,催化剂是核黄素,，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照,2,3,小时即可完成聚合反应。,聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。,链间纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶,具有分子筛性能,。,网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。,长链上富含酰胺基团，使聚丙烯酰胺成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。,这些特点使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。,聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由,凝胶浓度（,T,）,和,交联度（,C,）,决定。,每,100mL,凝胶溶液中含有的单体,(Acr,a),和交联剂,(Bis,b),总克数称为凝胶浓度，用,T,表示。,凝胶溶液中，交联剂,(Bis),占单体,(Acr),和交联剂,(Bis),总量的百分数称为交联度，用,C%,表示。,改变凝胶浓度（,T,）和交联度（,C,），,可获,得不同密度、粘度、弹性、机械强度和,孔径大小的,凝胶,，以适应各种样品的分离。,一般常用,7.5%,浓度,的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，,用,2.4%,的分离核酸,。但根据蛋白质与核酸相对分子质量的不同，适,用的浓度也不同。,富有弹性，且完全透明的凝胶，,a,与,b,的重量比应在,30,左右。选择,T,和,C,的经验公式是：,C=6.5,0.3T,此式可用于计算,T,为,5,20,时的凝胶组成。,C,值并,不很严格，在大多数情况下，可变化的范围约为,1,，,当,C,保持恒定时，凝胶的有效孔径随着,T,的增加而减小，当,T,保持恒定，,C,为,4,时，有效孔径最小，,C,大于或小于,4,时，有效孔径均变大，,C,大于,5,时凝胶变脆，不宜使用，,实验中最常用的,C,是,2.6,和,3,。,聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉,双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在,3,30,之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如,3,的聚丙,烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等,电聚焦或,SDS,PAGE,电泳的浓缩胶，也可以用于分离,DNA,；,高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如,10,20,的凝胶常用于,SDS,PAGE,电泳的分离胶。,配称,30,的丙烯酰胺水溶液在,4,下能保存,1,个月，在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触皮肤，但它们聚合后则无毒。,由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点，因而四十年来得,到广泛的应用，目前尚无更好的支持介质能够取代它。其,主要的优点有：可以随意控制胶浓度,“,T,”,和交联度,“,C,”,，,从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大,分子。能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，,达到更高的灵敏度：,10,9,10,12 mol/L,。由于聚丙,烯酰胺凝胶是由,C,C,键结合的酰胺多聚物，侧链只有,不活泼的酰胺基,CO,NH2,，没有带电的其他离子基团，,化学惰性好，电泳时不会产生,“,电渗,”,。由于可以制得高,纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好。透明度,好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便,于操作和保存。无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波,长的凝胶扫描作定量分析。还可以用作固定化酶的惰性,载体。,(,二,).,影响电泳迁移率的因素,电场强度,电场强度是指单位长度（,cm,）的电位降，也称电势,梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极,液与滤纸交界面的纸长为,20cm,，测得的电位降为,200V,，那,么电场强度为,200V/20cm,10V/cm,。当电压在,500V,以下，,电场强度在,2-10v/cm,时为常压电泳。电压在,500V,以上，电,场强度在,20-200V/cm,时为高压电泳。电场强度大，带电质,点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备,冷却装置以维持恒温。,溶液的,pH,值,溶液的,pH,决定被分离物质的解离程度和质点的带电性,质及所带净电荷量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团,（,-COOH,），又有碱性基团（,-NH2,）的两性电解质，在某,一溶液中所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此,时，蛋白质在电场中不再移动，溶液的这一,pH,值为该蛋白,质的等电点（,Isoelctric point,，,pI,）。若溶液,pH,处于等,电点酸侧，即,pH,pI,，则蛋白质带正电荷，在电场中向负,极移动。若溶液,pH,处于等电点碱侧，即,pH,pI,，则蛋白质,带负电荷，向正极移动。溶液的,pH,离,pI,越远，质点所带净,电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品,性质，选择合适的,pH,值缓冲液。,溶液的离子强度,电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。,其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成,一个与运动质点符合相反的离子氛（,ionic,atmosphere,），离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加,质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过,低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的,pH,值，影响质点的带电量，改变泳动速度。离子的这种障,碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度,I,表示。,式中,S,表示溶液中离子种类，,Ci,和,Zi,分别表示每种离子的摩尔浓度与化合价。最常用,I,值在,0.02-0.2,之间。,电渗,在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电,渗,(Electro-osmosis),。其产生的原因是固体支持物多,孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离,子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持,物时，纸上纤维素吸附,OH-,带负电荷，与纸接触的水溶液,因产生,H3O+,，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移,向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点,原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可,能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。,5.,焦耳热,电泳过程中释放的热量与电流的平方成正比，当电极,缓冲液中离子强度增加时，电流强度会随之增加，这不仅,降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或融化琼脂糖凝胶,支持物。,6.,筛孔,支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔，,在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快；反之，则泳动速,度慢。除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等,对泳动速度的影响也应考虑。,(,三,).,蛋白酶抑制剂电泳活性染色的原理：,分离纯化蛋白酶抑制剂时，常采用对其靶蛋白酶的抑,制活性来进行检测和追踪。由于植物材料中蛋白酶抑制剂,含量较少，而测定抑制活性的方法复杂、费时，需要人工,合成的特殊底物，因此不太方便。,根据蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶的作用特点，采用明胶,PAGE,，分离胶中加入,0.5%,明胶作为靶蛋白酶的底物，,电泳后胶板（含明胶底物）在靶蛋白酶进行酶解时，除了,蛋白酶抑制剂存在处的明胶不被酶解，胶板中其他位置的,明胶均被蛋白酶水解。酶解后再经水冲洗干净凝胶，然后,再经考马斯亮蓝,R250,染色，显色带（蛋白带）为靶蛋白酶,抑制剂的作用效果（抑制剂抑制蛋白酶活性从而使明胶不,被水解部位）。采用不同靶蛋白酶可以检测同一植物中不,同的蛋白酶抑制剂。,三,.,实验材料,胰蛋白酶抑制剂：来自红豆提取液，经,80,盐析的,上清液、,Sephadex-G100,柱层析。,标准胰蛋白酶抑制剂（国产）。,大概蛋白酶抑制剂的点样范围：抑活为,1,10U,都可,以出带。,电泳的样品：,0.5,1mL/,样品,/,班（,15l/,孔）,四,.,仪器设备,1.DDY-5,型稳压稳流电泳仪、,DYCZ,23A,型电泳槽（垂直平板电泳槽）,2.,恒温箱,3.,水浴锅：调,37,或,50,4.,冰箱,5.,脱色摇床,6.,移液管或移液器,5mL(1),、,1mL(2),、,0.1mL,（,1,）,7.,微量注射器,50uL,（,1,）,五,.,玻璃器皿（以组为单位）,100 mL,烧杯（,3,），,吸管（,1,）、玻棒（,1,），,滤纸（,3,6,），,试剂瓶（,1000 mL,、,500 mL,、,250 mL,等）、培养皿。,六,.,实验试剂,（一）试剂准备：,丙烯酰胺（,Acr,）、甲叉双丙烯酰胺,(Bis),、过硫酸,铵、浓,HCl,、,Tris,、氢氧化钠、蔗糖、冰醋酸、,TEMED,、考马斯亮蓝,R250,、,NaCl,、,CaCl2,、甲醇、甲,醛、明胶、溴酚蓝、胰蛋白酶（国产）,(,二,),电泳部分的凝胶制备方法,1,、,30%,凝胶贮液：取,60g,丙烯酰胺（,Acr,）、,1.6g,甲叉双丙烯酰胺,(Bis),。先用约,100 mL,蒸馏水溶解，如溶解不了,可加热,30oC-50oC,溶解,再用量筒定容至,200mL,，然后过滤，后置于棕色瓶。,4,下保存备用。全班,200mL,2,、,10%,过硫酸铵,(AP),溶液：取,2g,过硫酸铵溶解后，定容至,20mL,，现配现用,.,3,、,1 mol/L HCl 500mL,：在通风橱取浓,HCl 42 mL,，加蒸馏水至,500 mL,。,4,、分离胶缓冲溶液（,1.5mol/L Tris,Cl,缓冲液，,pH8.8,）：取,36.3g Tris,（三羟甲基氨基甲烷）溶解后，加,1mol/L HCl,溶液约,96 mL,，调,pH,至,8.8,，定容至,200mL,。全班,200mL,5,、浓缩胶缓冲液,(0.5mol/L Tris,HCl,缓冲液，,pH6.8),：取,6g Tris,（三羟甲基氨基甲烷）溶解后，加,1mol/L HCl,溶液约,40 mL,，调,pH,至,6.8,，定容至,100mL,。,6,、电极缓冲液（,0.05 mol/L Tris,0.384 mol/L,甘氨酸缓冲液，,pH8.3,）：取,Tris,（三羟甲基氨基甲烷）,6g,、,28.8g,甘氨酸,(,氨基乙酸,),，加水溶解后,测定,pH8.3,，定容至。用时稀释倍。全班,5000mL,工作液,7,、,25,明胶：称取,25g,明胶，加入,10mL,蒸馏水，溶解混匀后低温保存。,(,如果难以溶解可于,37,水浴中搅拌溶解,),。,8,、,0.5,溴酚蓝指示剂：配,50mL,。,9,、,10%,四甲基乙二胺,（,TEMED,）,20mL,。,(,三,),酶解和脱酶部分的试剂制备方法,（电泳过程中再配）,。,1,、,0.5 mol/L HCl,：全